全 文 ：·1894· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 13 期 2014 年 7 月

硬紫草羟基萘醌提取物对炎症细胞因子表达的影响
邹茜茜，宋巍薇，王美瑜，范华英，车 鑫，刘 珂*
烟台大学药学院，山东 烟台 264005
摘 要：目的 研究硬紫草羟基萘醌提取物对脂多糖（LPS）诱导的小鼠腹腔巨噬细胞 RAW264.7 细胞炎症因子的抑制作用
和对苯磺酸（TNBS）诱导的炎症性肠病（IBD）大鼠结肠组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的影响。方法 对硬紫草羟
基萘醌提取物进行提取分离，采用 ELISA 法测定硬紫草羟基萘醌提取物对 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞释放的 TNF-α和白细
胞介素-1β（IL-1β）的抑制作用；用 TNBS 法制备 IBD 大鼠模型，造模 24 h 后 ig 给药，连续给药 7 d，于末次给药 24 h 后
处死大鼠，采用免疫组织化学法检测大鼠结肠组织中 TNF-α的表达。结果 硬紫草羟基萘醌提取物对 LPS 诱导的 RAW264.7
细胞释放的 TNF-α 和 IL-1β 具有抑制作用；与模型组相比，硬紫草羟基萘醌提取物可降低 TNBS 诱导的 IBD 大鼠结肠组织
中 TNF-α 的表达。结论 硬紫草羟基萘醌提取物对 TNF-α 和 IL-1β 炎症因子具有不同程度的抑制作用，并可抑制 TNBS 诱
导的肠道炎症反应，这种抑制作用是通过降低 TNF-α的表达来实现的。
关键词：硬紫草；羟基萘醌提取物；炎症性肠病；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-1β
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)13 - 1894 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.13.016
Effect of hydroxynaphthoquinone extract from Lithospermum erythrorhizon on
inflammatory cytokines
ZOU Qian-qian, SONG Wei-wei, WANG Mei-yu, FAN Hua-ying, CHE Xin, LIU Ke
School of Pharmacy, Yantai University, Yantai 264005, China
Abstract: Objective To study the effect of hydroxynaphthoquinone extract from Lithospermum enythrorhizon on the inflammatory
cytokines in lipopolysaccharide (LPS)-induced peritoneal macrophage RAW264.7 cells of mice and on the expression of tumor
necrosis factor-α (TNF-α) in the TNBS-induced rat model of inflammatory bowel disease (IBD). Methods The
hydroxynaphthoquinone fraction was extracted from L. enythrorhizon. The inhibition of hydroxynaphthoquinone on the inflammatory
cytokines was tested by ELISA method. The IBD rat model was induced with TNBS. After 24 h of the model induction, the rats were ig
administered for 7 d, After 24 h of the last administration, all rats were killed and the expression of TNF-α in colon tissues was
evaluated by immunohistochemistry. Results The hydroxynaphthoquinone extract from L. enythrorhizon had the inhibition on TNF-α
and interleukin-1β (IL-1β) in LPS-stimulated RAW264.7 cells. Compared with the model group, the expression level of TNF-αin the
colon tissue of IBD rats induced by TNBS was significantly lower in hydroxynaphthoquinone extract groups. Conclusion
Hydroxynaphthoquinone extract from L. enythrorhizon has the inhibition on TNF-α and IL-1β, which provides a support for the
development of hydroxynaphthoquinone extract from L. enythrorhizon into a therapeutical agent.
Key words: Lithospermum enythrorhizon Sieb. et Zucc.; hydroxynaphthoquinone extract; inflammatory bowel disease; tumor necrosis
factor-α; interleukin-1β

硬 紫 草 为 紫 草 科 多 年 生 草 本 植 物 紫 草
Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc. 的干燥
根，主要分布在我国东北地区[1],《中国药典》2000
年版曾有收载。研究表明硬紫草中主要化学成分包
括萘醌类、生物碱类、脂肪酸类和酸性多糖类等[2]。
紫草具有凉血、活血、解毒透疹的功效，用于血热
毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、疮疡、湿疹、水火烫
伤。现代药理学研究表明，紫草具有较好的抗菌、

收稿日期：2014-01-07
基金项目：国家科技重大专项资助项目（2011ZX09102-006-04）
作者简介：邹茜茜（1986—），女，硕士研究生，研究方向为中药药理作用。Tel: 15865357387 E-mail: dzouqian@126.com
*通信作者 刘 珂 Tel: (0535)6706030-8013 E-mail: liuke@target-drug.com
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抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗过敏、保肝降酶等作用，
是一种药用价值很高的植物[3]。国内外大量研究表
明萘醌衍生物为紫草科多种药用植物抗炎的主要
有效成分 [4-6]。炎症性肠病（ inflammatory bowel
disease，IBD）是一种肠道内环境紊乱的慢性疾病，
其发病因素至今尚不明确，主要包括溃疡性结肠炎
（Ulcerative colitis，UC）和克隆恩氏病（Crohn’s
disease，CD）。其典型症状主要包括腹泻、腹痛、
便血、溃疡等[7-8]。已经有报道称，肿瘤坏死因子-α
（TNF-α）在 IBD 病人的血清、粪便和肠组织被证
实存在[9-10]，TNF-α 被用来作为导致人类 IBD 腹泻
的一种调节因子[11-12]。经对苯磺酸（TNBS）诱导
后，TNF-α成为肠道炎症损伤和肠壁黏膜损伤的一
种重要的细胞因子[13]。IBD 的发病与 TNF-α的高水
平表达息息相关[14]。抑制 TNF-α的生物合成和信号
传导通路成为治疗 IBD 的新型靶点。但是很多生物
药都具有一定的副作用，增加了人们的感染率和复
发率，并且这些新生物制品的高价格也限制了其使
用[15-16]。近年来，天然药用植物由于其自身所具有
的高安全性越来越受到人们的关注，逐渐发展成为
了一种新型的治疗药物。有文献报道，紫草素作为
紫草羟基萘醌的一种活性成分被用于调节 TNF-α
的表达，抑制体内 TNF-α的逆转录[17]。因此，本实
验通过提取得到了硬紫草中的羟基萘醌提取物，并
研究硬紫草羟基萘醌提取物对TNBS诱导的 IBD大
鼠结肠组织中 TNF-α表达的影响，进一步探讨硬紫
草羟基萘醌类化合物治疗 IBD 的作用机制。
1 材料
1.1 仪器
Agilent 1200 高效液相色谱仪，岛津 UV—2550
型紫外分光光度仪，旋转蒸发仪（上海禾汽玻璃仪
器有限公司），RM2255 型石蜡切片机（德国 Leica
公司），PL303 电子天平（梅特勒-托利多有限公司），
DHG—9140A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海精密实
验设备有限公司），病理图像（IMAGE-PRO PLUS，
美国 Medical Cybentics 公司）。
1.2 试药与试剂
硬紫草由内蒙古药品检验所中药室赠送，经烟
台大学药学院生药室赵燕燕博士鉴定为紫草
Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc. 的干燥
根，标本存于烟台大学药学院。左旋紫草素对照品
（批号 110769-200405）、β, β′-二甲基丙烯酰阿卡宁
对照品（批号 11689-200503）均购于中国食品药品
检定研究院，薄层色谱硅胶和柱色谱硅胶（200～300
目）购自烟台市化学工业研究所；TNF-α、白细胞介
素-1β（IL-1β）ELISA 试剂盒购自南京建成生物工
程研究所；脂多糖（LPS）购自美国 Sigma 公司；
二甲基亚砜（DMSO）购自碧云天生物技术研究所；
RPMI 1640 培养基购自 GenMed Scientifics Inc.；
DAB 显色试剂盒购自索莱宝科技有限公司，兔超敏
二步法免疫组化检测试剂购自北京中杉金桥生物
技术有限公司。
1.3 动物与细胞
雄性 SD 大鼠，体质量（200±10）g，购自北
京大学医学部实验动物科学部，许可证号 SCXK
（京）2006～2008。小鼠巨噬细胞（RAW264.7）购
自中国科学院上海细胞库（ATCC，TIB-71）。
2 方法
2.1 硬紫草羟基萘醌提取物的提取分离
2.1.1 提取工艺 取硬紫草 1 kg，粉碎，过 3 号筛，
用 95%乙醇冷浸提取，10 倍量提取 3 次，每次 1 h，
合并提取液，滤过，滤液于 50 ℃减压浓缩。将得
到的硬紫草浸膏用石油醚-醋酸乙酯（8∶1）进行柱
色谱洗脱，收集洗脱液，50 ℃减压浓缩，得到硬
紫草羟基萘醌提取物，采用 HPLC 方法进行测定。
2.1.2 紫草羟基萘醌提取物总色素测定 采用紫
外-可见分光光度法在 516 nm 处测吸光度值，以左
旋紫草素的吸收系数为 242，计算硬紫草羟基萘醌
提取物中总色素的质量分数，结果为 82.1%。
2.1.3 紫草羟基萘醌化合物定量测定 参考《中国
药典》2010年版方法[18]以乙腈-水-甲酸（700∶300∶
0.5）为流动相，UV 检测器，检测波长 518 nm；体
积流量 1.0 mL/min，色谱柱为 Phenomenex Luna C18
柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温 35 ℃，进样
量 10 μL。以 β, β′-二甲基丙烯酰阿卡宁为对照品计
算各羟基萘醌化合物的质量分数。结果硬紫草羟基
萘醌提取物中含有异丁酰紫草素 25.7%、紫草素
1.0%、乙酰紫草素 33.2%、β, β′-二甲基丙烯酰紫草
素 3.5%、异戊酰紫草素 18.0%、β-羟基异戊酰紫草
素 14.7%。
2.2 对LPS诱导的巨噬细胞TNF-α和 IL-1β的影响
细胞株 RAW264.7 使用含 10%胎牛血清、10
μg/mL 链霉素及 100 U/mL 青霉素的 RPMI 1640 培
养液，置于 37 ℃、5% CO2 的培养箱中培养，隔日
传代，贴壁生长的 RAW264.7 细胞使用 0.25%胰蛋
白酶消化，待细胞处于生长期时进行实验。
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取对数生长期的 RAW264.7 细胞，调整细胞密
度为 5×105/mL，将细胞悬液加入 96 孔培养板中
（200 μL/孔），放入 CO2培养箱中培养 1 h 后，加入
1 μg/mL 的 LPS 和质量浓度分别为 0.15、0.30、0.60、
1.20、2.40 μg/mL 的硬紫草羟基萘醌提取物（以
DMSO 溶解），将 96 孔培养板放入 CO2 培养箱中培
养 6 h，取细胞上清，用 TNF-α和 IL-1β ELISA 试
剂盒测定细胞上清液中 TNF-α和 IL-1β的水平。
2.3 对 TNBS 诱导的 IBD 大鼠结肠组织中 TNF-α
表达的影响
2.3.1 TNBS 诱导 IBD 大鼠模型制备 参考文献方
法[19-20]制备 IBD 大鼠模型，动物按体质量随机分为
5 组：对照组，模型组，硬紫草萘醌提取物低、中、
高剂量（2.5、5.0、10.0 mg/kg）组。造模前禁食 24 h，
记录体质量，戊巴比妥钠 30 mg/kg ip 麻醉。麻醉后，
大鼠头部朝下、肛门朝上倒置，用 16 号灌胃针缓
慢插入大鼠结肠部（深度为距肛门 8 cm 处），缓慢
注入灌肠液，推注耗时约 1 min。推注完毕后缓慢
抽出灌胃针，捏住大鼠肛门倒置 2 min 后，将大鼠
放归笼中，保持大鼠体位为头低臀高状态，于大鼠
肛门处放干净棉签，待自然清醒。对照组灌肠给予
生理盐水，其余各组灌肠给予 80 mg/kg TNBS-50%
乙醇溶液，灌肠体积 4 mL/kg。造模 24 h 后即出现
肉眼血便或黏液便，体质量也有不同程度的下降，
并伴有精神萎靡、蜷卧、少动、毛耸、进食减少等
症状，随机处死造模的 2 只大鼠，取结肠段观察其
病理改变，发现表现为黏膜充血、水肿、黏膜下层
有大量炎性细胞浸润，确定造模成功。造模 24 h 后
各组开始 ig 给药，连续给药 7 d。对照组和模型组
给予等体积的 CMC-Na。每日观察记录动物体质量、
体征和粪便情况。
2.3.2 标本处理 大鼠于末次给药 24 h 后 ip 10%
水合氯醛麻醉，剖腹观察大鼠腹腔，观察结肠大体
形态改变及腹腔粘连等情况；取出肛门至盲肠末端
的整个结肠和直肠段，沿肠系膜剪开肠腔，用冰的
生理盐水冲洗掉肠内容物，将结肠分为 2 个部分：
一部分用 10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，3 μm
连续切片，HE 染色用作病理检测；剩余的部分称
质量后用锡箔纸包好于液氮中或−80 ℃冰箱中保
存备用。
2.3.3 结肠组织中 TNF-α 表达的测定 采用免疫
组织化学法对 TNF-α 表达测定。DAB 显色后，以
细胞质出现棕黄色颗粒为阳性。利用 IMAGE-PRO
PLUS 病理图像分析系统对阳性染色进行积分吸光
度测定。每例每个指标取 10 个高倍视野（×400），
通过病理图像分析系统处理，记录 TNF-α表达值。
2.4 数据统计方法
数据均以 ±x s 表示，采用 SPSS 17.0 统计软件
处理数据，组间比较行方差分析，S-N-K 方法统计。
3 结果
3.1 对LPS诱导的巨噬细胞TNF-α和 IL-1β的影响
经 1 μg/mL LPS 刺激 6 h 后，RAW264.7 细胞均
释放大量的 TNF-α和 1L-1β，与对照组比较差异非
常显著（P＜0.01）。不同质量浓度的硬紫草羟基萘
醌提取物均可明显抑制 LPS 诱导的巨噬细胞释放
TNF-α 和 1L-1β，并呈现出良好的剂量关系，IC50
值分别为 0.67、0.85 μg/mL。见表 1。
3.2 对 TNBS 诱导的 IBD 大鼠结肠组织中 TNF-α
表达的影响
光镜下，在对照组结肠组织中，TNF-α在肠黏
表 1 硬紫草羟基萘醌提取物对巨噬细胞 TNF-α和 1L-1β的抑制作用 ( ± = 3x s n, )
Table 1 Inhibition of hydroxynaphthoquinone extract from L. enythrorhizon on TNF-α and 1L-1β
in RAW264.7 cells ( ± = 3x s n, )
组别 ρ / (μg·mL−1) TNF-α / (pg·mL−1) TNF-α抑制率 / % 1L-1β / (pg·mL−1) 1L-1β抑制率 / %
对照 — 75.6± 0.5 — 13.1± 0.2 —
LPS 1 1 362.1±99.8## — 815.6± 1.2### —
1＋0.15 976.5±11.5 11.3 705.6±39.1 15.6
1＋0.30 856.0±22.5 32.5 657.9±49.8 29.3
1＋0.60 687.5±25.6 45.6 487.1±73.6** 45.6
1＋1.20 452.3±35.6** 58.9 430.2±40.5** 63.9
LPS＋硬紫草羟基萘醌
提取物
1＋2.40 312.4±18.5*** 95.6 256.3±35.6*** 85.6
与对照组比较：##P＜0.01 ###P＜0.001；与 LPS 组比较：**P＜0.01 ***P＜0.001
##P < 0.01 ###P < 0.001 vs control group; **P < 0.01 ***P < 0.001 vs LPS group
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膜上皮、大肠腺上皮呈现低表达或不表达，而在肌
层中表达呈阴性。在模型组结肠组织中，TNF-α在
肠黏膜上皮、肌层中呈现强烈的表达，在炎性细胞
也有强烈的表达。在硬紫草羟基萘醌提取物高、中、
低剂量组，TNF-α在肠黏膜上皮、肌层中的表达均
比模型组中的弱，可见不同程度的表达，其中低剂
量组中 TNF-α 中度表达，中、高剂量组中 TNF-α
中低度表达。见图 1 和表 2。

对照 模型 硬紫草羟基萘醌提取物 2.5 mg·kg−1

硬紫草羟基萘醌提取物 5.0 mg·kg−1 硬紫草羟基萘醌提取物 10.0 mg·kg−1
图 1 各组大鼠结肠组织中 TNF-α的免疫组织化学染色结果
Fig. 1 Immunohistochemical staining of TNF-α in colon tissue of rats in each group
表 2 硬紫草羟基萘醌提取物对 TNBS 诱导的 IBD 大鼠结
肠组织中 TNF-α表达的影响 ( ± = 10x s n, )
Table 2 Effect of hydroxynaphthoquinone extract from L.
enythrorhizon on TNF-α expression in colon tissue
of IBD rats induced by TNBS ( ± = 10x s n, )
组别 剂量 / (mg·kg−1) TNF-α
对照 — 282.93±10.55***
模型 — 974.81± 4.06
硬紫草羟基萘 2.5 733.83± 1.04***
醌提取物 5.0 657.91± 0.19***
10.0 628.09± 2.67***
与模型组比较：***P＜0.001
***P < 0.001 vs model group
4 讨论
本实验结果表明硬紫草羟基萘醌提取物对 LPS
诱导的小鼠巨噬细胞 RAW264.7 释放的 TNF-α 和
IL-β具有抑制作用，并呈现出良好的剂量关系。通
过光镜下观察TNBS诱导的 IBD大鼠结肠中TNF-α
的免疫组织化学染色图可以发现，与模型组相比，
给药组结肠组织中 TNF-α的表达明显降低，而且发
现硬紫草羟基萘醌提取物降低结肠组织 TNF-α 的
表达呈一定的剂量依赖性。实验结果显示硬紫草羟
基萘醌提取物能够降低结肠中 TNF-α 的表达，因
此，可初步说明硬紫草羟基萘醌提取物能够抑制
TNBS 诱导的肠道炎症反应，这种抑制作用是通过
降低 TNF-α的表达来实现的。
参考文献
[1] 辛 玲, 孙 辉. 硬紫草研究概况 [J]. 中国医药技术
经济与管理, 2008, 11(2): 63-68.
[2] 宋艳华, 孙 辉, 张爱华, 等. 紫草的研究进展 [J].
中医药学报, 2013, 41(4): 985-987.
[3] 李治建, 周 凡, 斯拉甫·艾白, 等. 紫草药理作用研
究进展 [J]. 中国中医药信息杂志 , 2010, 17(11):
110-113.
[4] 黄志纾, 张 敏, 马 林, 等. 紫草的化学成分及其药
理活性研究概况 [J]. 天然产物研究与开发 , 1999,
12(1): 73-81.
[5] Papageorgioua V P, Assimopoulou A N , Sammanidou I
N, et al. Recent advances in chemistry, biology and
biotechnology of alkannin and shikonins [J]. Curr Org
Chem, 2006, 10(16): 2123-2142.
[6] Papageorgiou V P, Assimopoulou A N, Couladouros E A,
et al. The chemistry and biology of alkannin, shikonin,
·1898· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 13 期 2014 年 7 月

and related naphthazarin natural products [J]. Angew
Chem (Int Ed Engl), 1999, 38(3): 270-301.
[7] Ghia J E, Blennerhassett P, Deng Y, et al. Ghia,
Reactivation of inflammatory bowel disease in a mouse
model of depression [J]. Gastroenterology, 2009, 7(137):
2280-2288.
[8] Keohane J, Mahony C, Mahony L, et al. Irritable bowel
syndrome type symptoms in patients with inflammatory
bowel disease: a real association or reflection of occult
inflammation [J]. Am J Gastroenterol, 2010, 105:
1789-1794.
[9] Braegger C P, Nicholls S, Murch S H, et al. Tumour
necrosis factor alpha in stool as a marker of intestinal
inflammation [J]. Lancet, 1992, 339(8785): 89-91.
[10] Reimund J M, Wittersheim C, Dumont S, et al. Increased
production of tumor necrosis factor-alpha interleukin-1
beta, and interleukin-6 by morphologically normal
intestinal biopsies from patients with Crohn’s disease [J].
Gut, 1996, 39(5): 684-689.
[11] Bischo V, Lorentz A, Schwengberg S, et al. Mast cells are
an important cellular source of tumor necrosis factor á in
human intestinal tissue [J]. Gut, 1999, 44: 643-652.
[12] Evans R C, Clarke L, Heath P, et al. Treatment of
ulcerative colitis with an engineered human anti-TNF-
alpha antibody CDP571 [J]. Aliment Pharmacol Ther,
1997, 11: 1031-1035.
[13] Yuan H, Ji W S, Wu K X, et al. Anti-inflammatory effect
of diammonium glycyrrhizinate in a rat model of
ulcerative colitis [J]. World J Gastroenterol, 2006, 12:
4578-4581.
[14] Rutgeerts P, Vermeire S, van Assche G. Biological
therapies for inflammatory bowel diseases [J].
Gastroenterology, 2009,7(136): 1182-1197.
[15] Harpaz N, Polydorides A D. Colorectal dysplasia in
chronic inflammatory bowel disease: pathology, clinical
implications, and pathogenesis [J]. Arch Pathol Lab Med,
2010, 134(6): 876-895.
[16] De Silva S, Devlin S, Panaccione R. Optimizing the
safety of biologic therapy for IBD [J]. Nat Rev
Gastroenterol Hepatol, 2010, 7(2): 93-101.
[17] Staniforth V, Wang S Y, Shyur L F, et al. Shikonins,
phytocompounds from Lithospermumerythrorhizon,
inhibit the transcriptional activation of human tumor
necrosis factor a promoter in vivo [J]. J Biol Chem, 2004,
7(279): 5877-5885.
[18] 中国药典 [S]. 一部. 2010.
[19] Morris G P, Beck P L, Herridge M S, et al.
Hapten-induced modelof chronic inflammation and
ulceration in the rat colon [J]. Gastroenterology, 1989,
96: 795-803.
[20] Shorter R G, Huizenga K A, Spencer R J. A
workinghypothesis for the etiology and pathogenesis of
nonspecific inflammatory bowel disease [J]. Am J Dig
Dis, 1972, 17: 1024-1032.