全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 6 期 2016 年 3 月

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铁皮石斛赤霉素 3-氧化酶基因的克隆及表达分析
刘思思，张 岗，陈晓梅，李淑超，陈 娟*，郭顺星*
中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193
摘 要：目的 克隆珍稀濒危药用植物铁皮石斛 Dendrobium officinale 赤霉素 3-氧化酶（gibberellin 3-oxidases，GA3ox）基
因（DoGA3ox），并进行生物信息学和表达分析。方法 采用 RACE 和 RT-PCR 技术获得 DoGA3ox 基因 cDNA 全长；利用
生物信息学软件预测其编码蛋白的理化性质、结构域及亚细胞定位等分子特性；用 DNASTAR 7.0 和 MEGA 6.0 软件分别对
其进行氨基酸多序列比对和进化关系分析；借助实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）检测基因表达模式。结果 克隆到 DoGA3ox
基因（GenBank 注册号 KT597694），cDNA 全长 1 318 bp，编码一条由 353 个氨基酸组成的多肽，相对分子质量为 39 052.5，
等电点 6.21；DoGA3ox 蛋白不含跨膜域和信号肽，具有 GA3ox 的保守结构域 DIOX_N（40～130）和 2OG-FeII_Oxy（197～
299）；DoGA3ox 与大葱、油棕、海枣、野茶树及蓝猪耳 GA3ox 蛋白一致性分别为 55%、56%、54%、51%、50%，与单子
叶植物大葱、油棕和海枣的亲缘关系较近。qRT-PCR 实验结果显示 DoGA3ox 基因在铁皮石斛种子共生（非共生）萌发 1～3
级时，其相对表达量呈现出先升高后降低再升高的趋势，分别为未萌发种子的 13.44（5.21）、7.28（2.32）和 9.40（6.21）倍，
由此可知，该基因在共生萌发种子中的表达量高于非共生萌发种子。结论 首次克隆得到 1 个 DoGA3ox 基因的全长 cDNA，
其转录本在共生和非共生不同萌发级别种子中的表达特性说明该基因在铁皮石斛种子萌发中起着重要调控作用。
关键词：铁皮石斛；种子萌发；赤霉素 3-氧化酶；克隆；实时荧光定量 PCR
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)06 - 0990 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.06.022
Cloning and expression analysis of gibberellin 3-oxidase gene in Dendrobium officinale
LIU Si-si, ZHANG Gang, CHEN Xiao-mei, LI Shu-chao, CHEN Juan, GUO Shun-xing
Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing
100193, China
Abstract: Objective To clone the gibberellin 3-oxidase gene DoGA3ox from an important and endangered medicinal plant Dendrobium
officinale (Orchidaceae), followed by bioinformatic and expression analysis. Methods RACE and RT-PCR were used to isolate the
full-length gene. The physicochemical properties, conserved domains, and subcellular localization of DoGA3ox protein were determined
using a series of bioinformatic tools. The phylogenetic analyses were performed using DNASTAR 7.0 and MEGA 6.0 software. Real time
quantitative PCR was employed for gene expression analysis. Results The full-length cDNA of DoGA3ox (GenBank registration
number KT597694) was 1 318 bp in size, and encoded a 353-amino acid peptide chain with a molecular weight of 39 052.5 and an
isoelectric point (pI) of 6.21; The deduced DoGA3ox protein without transmembrane or signal peptide residues, contained the gibberellin
3-oxidases conserved domains that DIOX_N (40—130) and 2OG-FeII_Oxy (197—299). DoGA3ox had 51%—56% similarity with
GA3ox proteins from various plants, and was closely related to the monocot Allium fistulosum, Elaeis guineensis, and Phoenix dactylifera.
The relative transcript levels of DoGA3ox were increased at stage 1, then decreased (stage 2), and increased again (stage 3) during D.
officinale symbiotic/asymbiotic seed germination, the fold change to ungerminated seeds was 13.44 (symbiotic)/5.21 (asymbiotic),
7.28/2.32 and 9.40/6.21, respectively. Moreover, its transcript level was higher in symbiotic germination than that in the asymbiotic status.
Conclusion The full-length DoGA3ox gene is cloned for the first time, and its expression in different stages during seed germination
indicates that DoGA3ox gene plays a crucial role in the regulation of seed germination in D. officinale.
Key words: Dendrobium officinale Kimura et Migo; seed germination; GA3ox; cloning; real time quantitative PCR

收稿日期：2015-10-10
基金项目：教育部博士点基金优先发展领域（20131106130002）；药植所创新团队发展计划（PIRTI-IT1302）；中央公益性科研院所基本科研业
务费专项（YZ-12-14）；中医药行业科研专项（201407005）
作者简介：刘思思（1988—），女，博士在读，主要从事药用植物分子生物学研究。E-mail: liusisi274@126.com
*通信作者 陈 娟，副研究员，硕士生导师，主要从事真菌分类及菌根生物学。E-mail: kibchenjuan@126.com
郭顺星，研究员，博士生导师，主要从事药用植物菌根生物学研究。E-mail: sxguo1986@163.com
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铁皮石斛 Dendrobium officinale Kimura et Migo
为 单 子 叶 植 物 纲 （ Monocotyledoneae ） 兰 科
（Orchidaceae）石斛属 Dendrobium Sw. 多年生草本
植物，作为中华九大仙草之首，具有益胃生津、滋
阴清热、润肺止咳、明目强身等功效，是石斛属药
用植物中最为珍稀名贵的种[1-2]。和其他兰科植物一
样，铁皮石斛种子细小如尘，发育不完全，仅具尚
未分化的原胚，自然条件下需与合适的菌根真菌共
生才能萌发[3-4]。目前，铁皮石斛的规模化生产主要
采用种苗快繁技术，而该项技术的关键在于种子的
高效萌发。研究表明，接菌共生萌发可以提高种子
的萌发率，或将成为解决濒危兰科药用植物资源再
生的有效途径[5]。然而，国内外就铁皮石斛种子萌
发的研究集中在非共生萌发培养基的筛选改良[6-8]
和高效共生萌发真菌的筛选方面[9-10]，而铁皮石斛
种子萌发尤其是接菌共生萌发的分子机制尚不明
确，仅有赵明明等[11-12]通过构建铁皮石斛种子接菌
共生萌发抑制差减杂交（SSH）文库，发现大量差
异表达基因，并据此克隆得到 S-腺苷甲硫氨酸脱羧
酶基因（SAMDC），揭示该基因具有受真菌侵染诱
导表达的特性，推测其通过参与多胺调控途径在种
子接菌共生萌发中起到信号应答作用，为后续相关
研究提供了基因资源和分子基础。
高等植物的种子萌发是由多种植物激素调节
的，如脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）、生长素、
乙烯、油菜素内酯等，尤其是 GA 和 ABA 的平衡
关系，GA 量的提高能够促进种子解除休眠和发芽，
减弱 ABA 的影响，同时影响着植株的生长发育[13]。
赤霉素 3-氧化酶（GA3ox）和赤霉素 20-氧化酶
（GA20ox）是 GA 生物合成过程中的关键限速酶，
而赤霉素 2-氧化酶（GA2ox）则是 GA 分解代谢时
的关键限速酶[14]。因此，GA20ox、GA3ox 和 GA2ox
基因的表达调控在 GA 内稳态中扮演着至关重要的
角色。在 GA 信号途径中，GA2ox 基因转录水平受
到 GA 水平的正反馈调控，GA20ox 和 GA3ox 转录
水平则是受到 GA 水平的负反馈调控[15-16]。其中，
GA3ox 是一种 α-酮戊二酸依赖性多功能双加氧酶，
催化非13-羟化途径产生的GA9和13-羟化途径产生
的 GA20 经过 3β-羟基化生成具有生物活性的 GA4
和 GA1[17-18]。在需光种子莴苣、拟南芥中，光敏色
素信号一般通过靶向调控 GA3ox 和 GA2ox 来改变
种子中具有生物活性的 GA 量，进而调控种子萌发。
如莴苣种子中红光诱导 LsGA3ox1 基因表达同时抑
制 LsGA2ox2 基因的表达，而红外光则可以抵消红
光的这一作用[19]。另有研究发现，后熟作用可以改
变 ABA 和 GA 代谢相关基因（如 CYP707A2 和
GA3ox1）的表达，从而解除种子休眠促进萌发[20]。
由此可见，GA3ox 基因在植物种子萌发中扮演着重
要角色。
为阐明铁皮石斛种子萌发机制，本研究前期对
铁皮石斛种子和原球茎进行高通量转录组测序，发
掘了大量的差异表达基因，这对于兰科植物种子萌
发分子机制的研究有着重要意义。鉴于 GA3ox 基因
在种子萌发中的重要作用，笔者选择一条 1 195 bp
的转录本，BlastX 分析显示其注释为 GA3ox，利用
RACE 技术和 RT-PCR 方法首次从铁皮石斛萌发的
种子中克隆得到 GA3ox 基因的 cDNA 全长并对其
验证，同时进行生物信息学及表达模式分析，旨在
为深入研究该基因在铁皮石斛种子萌发及原球茎发
育中的生物学作用提供基础。
1 材料与方法
1.1 材料
样品采自浙江金华，经笔者鉴定为铁皮石斛
Dendrobium officinale Kimura et Migo 成熟蒴果。促铁
皮石斛种子萌发真菌 S6 为胶膜菌属真菌 Tulasnella
sp.[21]。在 OMA 培养基[22]上进行铁皮石斛种子接菌共
生萌发实验，1/2 MS 培养基[23]上进行非共生萌发实
验，其分别得到萌发至 1～3 级的种子和未萌发种子，
液氮速冻后置−80 ℃保存备用。种子萌发级别划分参
照 Zettler 报道[24]，种子吸水膨大，种皮破裂为第 1 级；
种子继续膨大，并出现顶端分生组织为第 2 级；顶端
分生组织伸长变粗并弯曲为第 3 级。
1.2 RNA 提取和 cDNA 合成
按照 RNeasy® Plant Mini Kit（QIAGEN，德国）
操作说明制备各样品总 RNA，NanoDropTM 2000 分
光光度计（Thermo Fisher，美国）分析 RNA 质量、
纯度，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。按照
PrimeScriptTM RT Reagent Kit（Takara，日本）操作
说明，逆转录合成 cDNA，−20 ℃保存备用。
1.3 RACE 与 qRT-PCR 验证
通 过 NCBI 的 BlastX 和 ORF Finder
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析，
发现一条 1 195 bp 的 Unigene15096 序列被注释为
GA3ox ， 且 具 有 完 整 的 开 放 阅 读 框 （ open
readingframe，ORF）和完整的 5’UTR，根据此序列
设计 1 条基因特异引物，按照 SMARTerTM RACE
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cDNA Amplification Kit（Clontech，日本）说明书进行
3’-RACE PCR 反应。以 1 μg 铁皮石斛原球茎总RNA
为 模 板 ， 利 用 SMARTScribeTM Reverse
Transcriptase（Clontech，日本）进行逆转录合成
3’-RACE ready cDNA。3’-RACE引物为DoGA3ox-GSP-F：
5’-TCGCCGTTACCTCCCAACTCAGCCCTTT-3’。
DoGA3ox-GSP-F 与 UPM 引物组合，按照试剂盒中
Program 1 程序进行 3’-RACE。反应体系：2.0 μL
10×Advantage® 2 PCR buffer，10 mmol/L dNTPs 0.4
μL，10 μmol/L DoGA3ox-GSP-F 0.4 μL，2.0 μL
10×UPM，1.5 μL 3’-RACE ready cDNA，5 U/μL
50×Advatange® 2 Polymerase Mix 0.4 μL，补ddH2O至20
μL。PCR产物经电泳分析，回收目的条带、克隆并测序，
与原序列拼接分析后，设计ORF引物DoGA3ox-ORF-F：
5’-CCACCAAAGAAATGCCTTCTCTCTC-3’和 Do-
GA3ox-ORF-R 5’-GAACCAAAGCCGTTAGTGGA-
TTATC-3’以及 5’-UTR 引物 DoGA3ox-5’UTR-F：
5’-TATTGGGTTGCACTCGTTATCTCTCT-3’和DoGA-
3ox-5’UTR-R：5’-CGTGGCTGGTGGCATAGAAGAC-3’，
以铁皮石斛原球茎 cDNA 为模板，Ex TaqTM DNA 聚合
酶（Takara，中国）进行 RT-PCR。反应体系：2.5 μL
10×Ex TaqTM Buffer ， 0.5 μL Ex TaqTM DNA
Polymerase，10 mmol/L dNTP Mix 0.5 μL，10 μmol/L
正/反向引物 0.5 μL，1.5 μL cDNA，补 ddH2O 至
25 μL。PCR 程序为 95 ℃、3 min；94 ℃、30 s，60
℃、30 s，72 ℃、90 s，35 个循环；72 ℃延伸 7 min；
4 ℃保温。PCR 产物经克隆、测序分析以验证基因
cDNA 全长的可靠性。
1.4 基因克隆和序列分析
PCR 产物经 1.2%琼脂糖凝胶电泳，艾德莱琼脂
糖凝胶纯化回收试剂盒（艾德莱，中国）纯化目的
条带，连接至 pMD18-T vector（Takara，中国），转
化大肠杆菌 Escherichia coli DH5α 感受态细胞，随
机挑选 5 个克隆送金唯智公司测序。使用 BlastX、
ORF Finder 进行 cDNA 序列分析；InterProScan 和
PROSITESCAN 在线分析 DoGA3ox 蛋白质的结构
域和基元；Protparam 和 SOPMA 分析蛋白质理化性
质和二级结构；SignalP 4.1 和 TMHMM 2.0 预测蛋
白质信号肽和跨膜区域；PSORT 进行蛋白质亚细胞
定位分析。采用 DNASTAR 7.1 进行氨基酸序列对
比分析；借助 MEGA 6.0 构建系统进化树。
1.5 实时荧光定量 PCR 分析
分别用 500 ng 各萌发阶段的种子总 RNA 反转
录成 cDNA，以铁皮石斛 18 S rRNA 作为内参基因[25]，
qPCR引物DoGAox-qPCR-F：5’-CGCCGACCTCCT-
CCATCAAGTA-3’和 DoGAox-qPCR-R：5’-TCTTC-
CAGCCAGCTTCTTCATCTCT-3’的扩增产物长 280
bp。将 cDNA 原液稀释 20 倍作为 qPCR 反应模板。
用 LightCycler® 480II 实时荧光定量 PCR 仪（Roche，
瑞士）进行 qPCR 反应。反应体系 20 μL 包括 10 μL
2×SYBR® Premix Ex TaqTM（Takara，中国），0.4 μL
10 μmol/L 正/反向引物，2 μL cDNA，7.2 μL ddH2O。
每个反应 3 个复孔，3 次生物学重复。PCR 程序 95
℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40 个循环。反
应结束绘制熔解曲线。根据 LightCycler® 480 II HTC1
软件生成的循环阈值（cycle threshold，Ct），用 2−ΔΔCt
方法[26]计算相对表达量。
2 结果与分析
2.1 DoGA3ox 基因克隆和全长验证
通过 BlastX 分析比对可知原 Unigene 序列具有
完整的 5’-UTR，经过 3’-RACE 反应，扩增产生长
度约为 800 bp 的目标条带（图 1），克隆、测序获得
795 bp 的序列，与原 unigene 拼接分析获得了一条
1 318 bp 的 cDNA。BlastX 分析表明其与 GenBank
中已注册的多种植物 GA3ox 基因有较高的相似性
（44%～56%），定名为 DoGA3ox，提交 GenBank 并
获得注册号 KT597694。DoGA3ox 基因的 ORF 长
1 062 bp，5’-UTR 长 123 bp，3’-UTR 长 133 bp。分
别使用引物 DoGA3ox-5’UTR-F/R 和 DoGA3ox-
ORF-F/R，经 RT-PCR 扩增产生特异目的条带（图
1），克隆、测序前者获得一条 337 bp 的序列包含
5’UTR，后者获得一条 1 129 bp 的序列包含完整
ORF，两者均与拼接序列一致，进而验证成功获得
DoGA3ox 基因的全长 cDNA。


M-Marker 1-5’UTR 产物 2-3’RACE 产物 3-完整 ORF
M-Marker 1-5’UTR product 2-3’RACE product 3-Full ORF
图 1 DoGA3ox 基因全长 cDNA 克隆
Fig. 1 Clone of full length cDNA of DoGA3ox
M 1 M 2 M 3
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
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2.2 DoGA3ox 基因编码蛋白理化特性分析
Protparam 预测 DoGA3ox 基因编码蛋白的分
子式为 C1742H2712N488O507S14，等电点 6.21、相对
分子质量 39 052.5；DoGA3ox 蛋白带正电残基
（Arg＋Lys）为 36，负电残基（Asp＋Glu）为 43。
该蛋白的不稳定系数为 36.70，脂肪系数为 85.41，
总平均疏水性系数为−0.218，负值表示亲水性，
正值表示疏水性，其介于−0.5～0.5 为两性氨基
酸。利用 ProtScale 对其再次进行亲疏水性预测，
结果显示该蛋白的疏水性最大值为 2.333，最小值
为−2.311，疏水性区域与亲水性区域交替出现，
没有典型的亲疏水性区域，与 Protparam 预测结果
一致，属于两性氨基酸。SOPMA 分析表明，
DoGA3ox 蛋 白 的 二 级 结 构 主 要 由 α 螺 旋
（34.84%）、延伸链（17.56%）、β 转角（8.22%）
和随机卷曲（39.38%）组成。
2.3 DoGA3ox 蛋白结构域、定位和跨膜区分析
InterProScan 分析显示，DoGA3ox 基因编码蛋白
含有保守的 DIOX_N 结构域（ 40 ～ 130 ）和
2OG-FeII_Oxy 结构域（197～299），具备已报道[27-28]
植物 GA3ox 的典型结构特征。PROSITE Scan 分析表
明，DoGA3ox 蛋白含有数目不等的基元，包括 3 个
蛋白激酶 C 磷酸化位点（246～248、277～279、342～
344）、5 个酪蛋白激酶 II 磷酸化位点（46～69、141～
144、147～150、204～207、324～327），3 个 N-酰基
化位点（56～61、62～67、102～107），这些保守基
元可能对蛋白结构和功能有重要作用。SignalP 4.1 分
析 DoGA3ox 蛋白不含信号肽，该蛋白不可能在细
胞中发生移动。利用 TMHMM 2.0 分析 DoGA3ox
蛋白不含跨膜结构域，由此推断该蛋白不经过跨膜
转运，与信号肽分析相吻合。PSORT 预测 DoGA3ox
蛋白定位于过氧化物酶体的可能性较高为 63.1%，
定位于线粒体基质的可能性为 10.0%。
2.4 DoGA3ox 蛋白序列比对和进化分析
运用 DNASTAR 7.1 中的 MegAlign 程序对
DoGA3ox 基因编码蛋白与 5 种植物的 GA3ox 蛋白
进行多序列比对分析（图 2）。结果表明，DoGA3ox
与大葱 Allium fistulosum L.（BAG32267.1）、油棕
Elaeis guineensis Jacq.（XP_010925284.1）、海枣
Phoenix dactylifera L.（XP_008785607.1）、野茶树
Camellia sinensis L.（AHC32022.1）、蓝猪耳 Torenia
fournieri L.（BAJ65442.1）GA3ox 蛋白的一致性分
别为 55%、56%、54%、51%和 50%。因此将 DoGA3ox
蛋白序列提交到 NCBI 上进行 Blast P 比对，搜索相
似 性 序 列 ， 结 果 显 示 ， DoGA3ox 与 油 棕
（XP_010925284.1）的 GA3ox 蛋白序列相似性最高
为 56%。
为了分析 DoGA3ox 蛋白的进化情况，从
NCBI 的 Nr 数据库中选取 16 个物种的 16 条
GA3ox 蛋白序列，经过 Clustal W 比对并利用
MEGA 6.0 中的 NJ 法构建进化树。这些序列包括
大叶藻 Zostera marina L.（KMZ69735.1）、芝麻
Sesamum indicum L.（XP_011072274.1）、蓝猪耳
（ BAJ65442.1 ）、 猴 面 花 Erythranthe guttata
（Fischer ex DC.）Nesom（XP_012856205.1）、绒
毛 状 烟 草 Nicotiana tomentosiformis L.
（XP_009596383.1）、马铃薯 Solanum tuberosum L.
（XP_006341659.1）、野茶树（AHC32022.1）、案
头 菊 Chrysanthemum × morifolium Ramat.
（ BAG48320.1 ）、莲 Nelumbo nucifera Gaertn.
（XP_010249916.1）、梅花 Prunus mume Sieb. et
Zucc.（XP_008228615.1）、苹果 Malus domestica
Borkh. （ XP_008377587.1 ）、 白 梨 Pyrus ×
bretschneideri Rehd.（XP_009339604.1）、葡萄 Vitis
vinifera L. （ XP_002284981.1 ） 、 油 棕
（XP_010925284.1）、海枣（XP_008785607.1）和
大葱（BAG32267.1）。利用上述植物的 GA3ox 蛋
白序列绘制系统进化树（图 3），DoGA3ox 与单子
叶植物大葱、油棕和海枣的 GA3ox 蛋白序列亲缘
关系较近，与芝麻等双子叶植物关系较远。
2.5 DoGA3ox 基因在种子萌发不同阶段的表达分析
分别提取铁皮石斛种子萌发各阶段样品总
RNA，利用 qPCR 技术检测 DoGA3ox 基因在种子
萌发不同阶段的表达。图 4 结果表明，首先，
DoGA3ox 基因在铁皮石斛种子接菌共生萌发过
程中，萌发 1 级至第 3 级的相对表达量分别为未
萌发种子的 13.44、7.28 和 9.40 倍；在非共生萌
发时，其相对表达量则分别为未萌发种子的 5.21、
2.32 和 6.21 倍，均呈现出先升高（1 级）后降低
（2 级）再升高（3 级）的趋势。其次，DoGA3ox
基因在共生萌发过程中的表达量高于其在非共生
萌发过程中的表达。最后，分析可知铁皮石斛种
子萌发过程中，DoGA3ox 基因表达呈现一定幅度
频率的波动，间接反映种子萌发是一个非常复杂
的生理生化过程，同时亦说明 GA 在种子萌发过
程中的重要调节作用。
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图 2 DoGA3ox 与其他植物 GA3ox 蛋白的多序列比对
Fig. 2 Multiple sequence alignment of DoGA3ox and GA3ox from other plants

图 3 DoGA3ox 与不同物种 GA3ox 蛋白的进化树分析
Fig. 3 Phylogenetic tree of DoGA3ox with GA3ox proteins
from other species

图 4 qRT-PCR分析DoGA3ox基因在种子萌发不同阶段的
表达模式
Fig. 4 qPCR analysis on expression pattern of DoGA3ox
gene at different germination stages of D. officinale seeds
3 讨论
GA3ox 为催化赤霉素生物合成途径的最后关键
一步，是由多基因家族编码的。目前，该基因已在
部分植物中克隆得到，如南瓜[29]、拟南芥[30]、水稻[31]、
烟草[32]、小麦[33]等。药用植物中仅见西洋参、滇重
楼 GA20ox 基因克隆的相关报道 [12-13]，尚未见
野茶树
蓝猪耳
大葱
油棕
海枣
铁皮石斛

野茶树
蓝猪耳
大葱
油棕
海枣
铁皮石斛

野茶树
蓝猪耳
大葱
油棕
海枣
铁皮石斛

野茶树
蓝猪耳
大葱
油棕
海枣
铁皮石斛

野茶树
蓝猪耳
大葱
油棕
海枣
铁皮石斛
61
67
73
55
55
62
139
145
151
133
133
142
216
224
228
211
211
219
290
299
307
286
286
299
336
345
353
338
338
353
猴面花 (XP012856205.1)
芝麻 (XP011072274.1)
蓝猪耳 (BAJ65442.1)
绒毛状烟草 (XP009596383.1)
马铃薯 (XP006341659.1)
野茶树 (AHC32022.1)
案头菊 (BAG48320.1)
莲 (XP010249916.1)
梅花 (XP008228615.1)
苹果 (XP008377587.1)
白梨 (XP009339604.1)
葡萄 (XP002284981.1)
铁皮石斛 (KT597694)
大葱 (BAG32267.1)
油棕 (XP010925284.1)
海枣 (XP008785607.1)
大叶藻 (KMZ69735.1)
16
14
12
10
8
6
4
2
0
相
对
表
达
量

未萌发
1 级
2 级
3 级
非共生萌发 共生萌发
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GA3ox 基因克隆的报道。本研究以前期铁皮石斛萌
发种子转录组测序拼接获得的一条 GA3ox unigene
为基础，利用 RACE、RT-PCR 技术首次从珍稀濒
危药用铁皮石斛克隆获得一个 GA3ox 基因。通过生
物信息学分析了 DoGA3ox 基因编码蛋白的二级结
构、三级结构等基本特性，不存在信号肽和跨膜结
构域，这与报道的西洋参 GA20ox 蛋白[12]类似。
DoGA3ox 基因序列 BlastX 比对结果显示与大葱
（BAG32267.1）、油棕（XP_010925284.1）等单子叶
植物的 GA3ox 基因序列相似性为 50%～56%，高于
其与双子叶植物 GA3ox 基因序列的相似性（40%～
53%），与 GA3ox 蛋白进化分析结果一致，同时也
符合植物亲缘关系。通过 qRT-PCR 方法检测
DoGA3ox 基因在铁皮石斛种子接菌共生萌发、非共
生萌发各阶段的表达量，发现 DoGA3ox 基因在种
子萌发至幼苗的过程中，呈现升高降低再升高的趋
势，说明此过程中 GA 调控的复杂性和 GA 合成分
解代谢的旺盛，并由此推测 DoGA3ox 基因可能受
到 GA 的负反馈调控。此外，DoGA3ox 基因在共生
萌发种子中的表达量高于非共生萌发种子的，说明
促铁皮石斛种子萌发真菌能通过某些方式（共生信
号、分泌GA信号途径的中间产物等）诱导DoGA3ox
基因表达，进而提高赤霉素的合成[34-35]，从而促进
种子打破休眠快速萌发。
本研究结果不仅为分析 DoGA3ox 基因的分子
功能提供依据，还为铁皮石斛种子萌发以及菌根真
菌促其种子萌发的分子机制研究提供基础。高等植
物中 GA3ox 蛋白是由一个小基因家族编码的，能联
合 GA20ox 将 GA12 和 GA53 催化合成有活性的 GA1
和 GA4。有研究表明，GA3ox 蛋白至少有 4 个基因
编码[34]，根据 NCBI Blast 序列比对结果，尚不能确
定本研究所得基因为 GA3ox 基因家族中的哪一个
成员。为进一步研究 GA3ox 基因在种子萌发中的作
用，在后续研究中还需克隆铁皮石斛 GA3ox 基因家
族的其他成员，分析各成员间的不同以及表达存在
的规律。
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