全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 20 期 2014 年 10 月

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• 药材与资源 •
白木香AsNINJA1基因全长cDNA克隆及其在愈伤组织中的茉莉酸甲酯诱导表达
廖永翠 1，徐艳红 1，张 争 1, 2，隋 春 1，梁 良 1, 3，魏建和 1, 2*
1. 中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193
2. 中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所海南分所，海南省南药资源保护与开发重点实验室，海南 万宁 571533
3. 山东中医药大学药学院，山东 济南 250012
摘 要：目的 克隆国产沉香基原植物白木香 Aquilaria sinensis 互作蛋白（jasmonate Zim-domain，JAZ）基因（NINJA），为深
入研究其在沉香倍半萜合成途径中的功能奠定基础。方法 以白木香总 RNA 为模板，采用 RACE 法和 RT-PCR 方法，克隆白
木香 NINJA 基因 cDNA 全长，并进行生物信息学的分析；采用实时荧光定量（qRT-PCR）方法分析经茉莉酸甲酯（MeJA）处
理的白木香愈伤组织中 AsNINJA1 基因的表达模式。结果 获得白木香 NINJA 基因全长 cDNA，命名为 AsNINJA1。序列分析
表明，该基因的序列全长为 1 982 bp，包含一个 1 221 bp 的开放阅读框，编码 406 个氨基酸，蛋白质相对分子质量为 43 697，
等电点为 6.02。qRT-PCR 结果显示，经 MeJA 处理 4 h 后 AsNINJA1 基因相对表达量最高，是对照（未经 MeJA 处理的白木香
愈伤组织）的近 100 倍，随后显著下降。结论 获得 AsNINJA1 基因全长 cDNA 序列，该基因对 MeJA 诱导极为敏感，且能在
伤害早期响应。
关键词：白木香；AsNINJA1 基因；cDNA 快速末端扩增；序列分析；表达分析；茉莉酸甲酯
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253-2670(2014)20 - 2968 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.20.019
Full-length cDNA cloning of AsNINJA1 gene in Aquilaria sinensis and MeJA-induced
expression in callus
LIAO Yong-cui1, XU Yan-hong1, ZHANG Zheng1, 2, SUI Chun1, LIANG Liang1, 3, WEI Jian-he1, 2
1. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing
100193, China
2. Hainan Provincial Key Laboratory of Resources Conservation and Development of Southern Medicine Hainan Branch Institute of
Medicinal Plant, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Wanning 571533, China
3. College of Pharmacy, Shandong Traditional Chinese Medicine University, Jinan 250012, China
Abstract: Objective To clone the full-length cDNA of interacting protein of JAZ (NINJA) gene in Aquilaria sinensis, and to provide the
basic information for further study on gene function in sesquiterpenes biosynthesis pathway. Methods With the total RNA as template, the
full-length cDNA of NINJA in A. sinensis was cloned through RACE technique and RT-PCR method. The bioinformatics of cloing NINJA
gene was analyzed as well. The expression mode of this gene was with MeJA treatment in A. sinensis callus detected by qRT-PCR method.
Results The full-length cDNA (1 982 bp) of NINJA gene in A. sinensis, named as AsNINJA1 was obtained with an open reading frame of
1 221 bp and encoding 406 amino acids. The relative molecular mass of AsNINJA1 protein calculated was 43 697, and the isoelectric point was
6.02. The qRT-PCR results indicated that MeJA treatment could stimulate the increase of mRNA expression of AsNINJA1; There was a sharp
rise at 4 h with nearly 100 times higher than the control (without MeJA treatment), then dropped significantly. Conclusion The full-length
cDNA sequence of AsNINJA1 gene is obtained; AsNINJA1 is extremely sensitive to MeJA treatment, and responded to the early damage.
Key words: Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg; AsNINJA1 gene; rapid amplification of cDNA ends; sequence analysis; expression analysis; MeJA

收稿日期：2014-06-11
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81173481，31100220，31000136）；协和学者特聘教授 [医科人发(2012)282 号]；科技部国家创新人
才计划重点领域创新团队（2013）；中组部“万人计划”（2014）
作者简介：廖永翠（1985—），女，博士在读，研究方向为诱导型药用植物形成机理研究。Tel: (010)57833359 E-mail: liao.yong.cui@163.com
*通信作者 魏建和（1970—），男，研究员，博士生导师，主要从事药用植物基因资源和次生代谢调控研究。
Tel: (010)57833358/57833016 E-mail: wjianh@263.net
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白木香 Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg 又称土沉
香，属瑞香科沉香属植物，是我国生产名贵芳香类
药材沉香的唯一正品植物来源，现已被列为国家二
级濒危保护植物。沉香味辛、苦，性微温，具有行
气止痛、温中止呕、纳气平喘等功效[1]。白木香是
一种典型的伤害诱导型药用植物，只有在受到伤害
后才能在其伤口周围木质部产生倍半萜等沉香类物
质。研究表明，伤害诱导沉香形成是白木香防御反
应的产物[2]。
为研究伤害诱导沉香形成的分子机制，课题组
前期对健康和伤害处理的白木香进行了转录组分
析，并重点分析了参与倍半萜合成与调控的关键基
因；发现外源茉莉酸（JA）处理显著诱导倍半萜合
酶基因的表达，经茉莉酸酯（MeJA）处理的愈伤组
织中倍半萜成分的含量相对于健康组织升高了 70
多倍[3]。白木香悬浮细胞经 MeJA 处理后，可增加 5
个 δ-愈创木烯合酶基因的表达量，同时增加倍半萜
δ-愈创木烯的量[4]。此外，白木香树经机械伤害和
外施 MeJA 处理，内源茉莉酸素（JAs）量显著增加，
同时产生 3 种倍半萜物质[5-6]。这些结果表明，JA
信号在白木香诱导结香中扮演重要角色。
大量的研究表明，JA 是伤信号转导途径中长
距离运输的重要信号分子，依赖于 JA 作为调节反
应信号的防御应答也是植物次生代谢物质积累的
前提[7-9]。NINJA（Novel Interactor of JAZ）是 JA 信
号途径中的负调控因子；在拟南芥中，Pauwels 等[10]
发现了互作蛋白（jasmonate Zim-domain，JAZ）抑
制蛋白与协同抑制因子 TOPLESS（TPL）和 TPL 相
关蛋白（TPLs）的结合需要 NINJA 蛋白的参与，共
同调控着 JA信号途径相关次生代谢物的合成并达到
植物防御的目的。本实验首次报道了白木香 NINJA
（AsNINJA1）基因 cDNA 全长的克隆及表达分析，为
进一步研究AsNINJA1 蛋白的功能及揭示 JA 信号在
白木香倍半萜形成中的作用机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
中国医学科学院药用植物研究所温室栽培的 3
年生白木香茎诱导产生，生长良好且基本一致的白
木香愈伤组织，转接到含有 100 μmol/L 浓度 MeJA
的 MS 固体培养基中，25 ℃暗培养，8 个不同时间
段（0.5、1、2、4、6、8、16、24 h）取样，分别设
置 3 个生物学重复。以同一批生长一致的白木香愈
伤组织同时转接到不含 MeJA 的 MS 培养基中 25
℃暗培养，分别在相同时间段（0.5、1、2、4、6、
8、16、24 h）取样，均设 3 个重复，作为对照。所
有的材料取样后均置于液氮中速冻后，−80 ℃冰箱
保存备用。
1.2 试剂
植物总 RNA 提取试剂盒、Fast HiFidelity
Polymerase 高保真酶、大肠杆菌 DH5α 感受态、多
聚 酶 链 反 应 （ PCR ） 产 物 胶 回 收 试 剂 盒 、
pZeroBack/blunt 零背景连接试剂盒购于天根生化科
技（北京）有限公司。pUC-T 载体 UltraSYBR Mixture
购于北京康为世纪生物科技有限公司。SMARTerTM
RACE cDNA Amplification Kit 试剂盒购于日本宝生
物公司产品。RevertAid First Strand cDNA Synthesis
Kit 购于 ThermoFisher SCIENTIFIC 公司。其他试剂
均为国产分析纯。本研究所用引物由上海生工生物
工程股份有限公司合成，产物测序由英潍捷基贸易
有限公司完成。
1.3 总 RNA 的提取和 cDNA 合成
将经 MeJA 化学处理的白木香愈伤组织材料及
未处理的健康白木香愈伤组织材料置于液氮中研
磨，依据天根生化科技（北京）有限公司的植物总
RNA 提取试剂盒说明书提取总 RNA，利用
NanoDrop 2000 进行测定和 1%琼脂糖电泳检测。健
康的不经 MeJA 处理不同时间段的白木香愈伤组织
混样提取总 RNA，利用 SMARTerTM RACE cDNA
Amplification Kit（Clontech 公司）试剂盒合成 5′-
和 3′-RACE cDNA，反转录的条件及程序均按照试
剂盒说明书进行，用于 AsNINJA1 基因全长的克隆。
经 MeJA 化学处理的和健康不经 MeJA 处理白木香
愈伤组织提取总 RNA，利用 RevertAid First Strand
cDNA Synthesis Kit（ThermoFisher SCIENTIFIC 公
司）反转录成 cDNA 第一链，作为 qRT-PCR 的模板。
1.4 AsNINJA1 基因全长克隆
基于白木香转录组数据库得到 AsNINJA1 基因
的 UniGene 片段，通过 NCBI Blast 比对发现该序列
并不是全长，运用引物设计软件 Primer 5.0 分别设
计 AsNINJA1 基因 5’-和 3’-末端的扩增的特异性引
物 GSP1、GSP2。以健康的不经 MeJA 处理不同时
间段的白木香愈伤组织混样提取的总 RNA 反转录
得到的 RACE cDNA 为模板，反应体系和 PCR 程序
按照 SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit
（Clontech 公司）试剂盒说明书进行操作。1%琼脂
糖凝胶电泳检测 PCR 产物，切胶，用天根公司琼脂
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糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。将回收的 PCR 目
的产物与 pUC-T 载体连接，转化 DH5α 菌株，在含
有氨苄的 LB 平板上进行培养，挑取单克隆摇菌，经
菌液 PCR 扩增和电泳检测后选择阳性克隆送英潍
捷基贸易有限公司测序。将测序结果在 NCBI 基因
预测工具（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）
上寻找一个完整的开放阅读框（open reading frame，
ORF），通过设计全长引物扩增全长（表 1）。反应体
系：快速高产聚合酶 0.5 μL，5×快速高产 PCR 缓冲
液 5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2 μL，NINJA-LF
（10 μmol/L）1 μL，NINJA-LR（10 μmol/L）1 μL，cDNA
1.0 μL，ddH2O 14.5 μL，终体系为 25 μL。PCR 反应
程序：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，62 ℃、30 s，72 ℃、
80 s，35 个循环；72 ℃ 延伸 7 min；4 ℃保存。PCR
产物回收后用 pZeroBack/blunt 零背景连接试剂盒进
行连接、转化、涂平板，菌液 PCR 如前。
表 1 基因克隆及实时荧光定量 PCR 检测引物
Table 1 Primers for gene cloning and real-time PCR detection
引物用途 引物名称 引物序列（3’-5’）
5’-RACE 扩增引物 GSP1 CACAGACTTGTTGGAACCCCC
3’-RACE 扩增引物 GSP2 CCACAGGATCTGGCCCACATGGGAGAAC
NINJA-LF ATGGTAGAGGGGTTTGGGGGTTC 基因克隆
NINJA-LR TCAGCTCTGAGTCAGACGCTTGC
TUA-f GCCAAGTGACACAAGCGTAGGT 内参基因实时荧光定量
PCR 引物 TUA-r TCCTTGCCAGAAATAAGTTGCTC
NINJA－1f CACAGCCATTACTTGCCCT AsNINJA1 基因实时荧光定量
PCR 引物 NINJA－1r CCTACCCTTTACAGTTTCACC

1.5 AsNINJA1 基因的序列分析
AsNINJA1 基因编码蛋白的理化性质预测采用
ExPASy Proteomics Server 提 供 的 在 线 工 具
ProtParam （ http://web.expasy.org/protparam ） 和
ProtScale（http://web.expasy.org/protscale）进行分析。
利用在线工具 InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/
Tools/pfa/iprscan/）对 AsNINJA1 蛋白结构域进行分
析。使用 SignalP3.0Server（http://www.cbs.dtu.dk/
services/SignalP/）和 TargetP 1.1 Server（http://www.
cbs.dtu.dk/services/TargetP/）进行分泌蛋白预测。利
用 WOLF PSORT（http://wolfpsort.org/）分析亚细胞
定位，TRMHMM server v2.0（http://www.cbs.dtu.
dk/services/TMHMM-2.0/）进行跨膜域分析。氨基
酸序列比对利用 NCBI 的蛋白质序列数据库进行，
通过 MEGA 5 构建 NJ 系统进化树，bootstrap 重复
次数为 1 000 次。
1.6 实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）
利用 qRT-PCR（美国伯乐公司的 iQTM5 实时
PCR 检测系统）的方法检测经 MeJA 处理的白木
香愈伤组织中 AsNINJA1 基因不同时间段的表达
量。反应体系如下：2×UltraSYBR 预混液 20 μL，
正反向引物（10 μmol/L）各 0.4 μL，cDNA 模板
0.8 μL，加水至终体积 20 μL，每个反应体系设置
3 个重复。实时 PCR 反应程序：95 ℃、10 min；
95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40 个循环；RT-PCR
反应以 α 微管蛋白基因 TUA 为内参[11]，不同时间
段基因的表达以健康的不进行 MeJA 处理的白木
香愈伤组织中的表达量为对照。将 Real-time PCR
仪所得的样品 Ct 值，利用 2－ΔΔCt 方法转化为基因
相对表达量值。应用 Excel 软件进行数据录入及
表的绘制，采用 SPSS16.0 软件进行统计与
One-way ANOVA 方差分析，并用 Duncan 检验法
进行多重比较。
2 结果与分析
2.1 白木香 AsNINJA1 基因全长的克隆
根据前期转录组测序得到的 AsNINJA1 基因的
UniGene 序列设计特异引物，通过 RACE-PCR 技术
获得 5’端序列和 3’端序列克隆测序的结果与已知的
序列片段拼接得到全长 cDNA 序列为 1 982 bp。为
验证全长的结果，根据拼接后得到的全长序列设计
引物，以 cDNA 为模板，扩增白木香 AsNINJA1 基
因全长序列并测序，与预计的片段大小一致，克隆
后测序，结果与拼接结果一致。
从得到的白木香 AsNINJA1 基因 cDNA 序列全
长，通过 NCBI 基因预测工具（ORF Finding）获得
一个长为 1 221 bp 完整的开放阅读框（ORF）。5’
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端存在为 525 bp 的非翻译区（UTR），3’端的 UTR
区长为 255 bp，其中含为 18 bp 的 poly（A）尾，命
名为 AsNINJA1 基因。图 1 为经过 PCR 扩增得到的
AsNINJA1 基因编码区（CDS）序列检测电泳图。

M-marker 1-AsNINJA1
图 1 AsNINJA1 基因 CDS 的扩增
Fig. 1 CDS amplification of AsNINJA1 gene
2.2 白木香 AsNINJA1 基因编码蛋白特性分析
2.2.1 理化性质分析 AsNINJA1 蛋白的分子式为
C1886H2971N553O624S10，编码 406 个氨基酸，相对分
子质量为 43 697 。等电点 pI 为 6.02，带负电残基
（Asp＋Glu）为 46，带正电残基为 37（图 2）。该蛋
白的不稳定系数为 47.64，属于不稳定蛋白；脂肪系
数为 68.45，亲水性系数为−0.617，表明其为疏水性
蛋白；摩尔消光系数为 24 200，在哺乳动物体内的
半衰期为 30 h，酵母体内大于 20 h，菌内大于 10 h。
整个 AsNINJA1 中疏水性最大值是 1.678，最小值是
−2.589；其中 145～155、175～194、306～322 和
358～367 出现强烈的疏水性，其他为亲水性区域，
平均亲水系数小于−0.6，此结果表明 AsNINJA1 可
能是一种水合能力较强的蛋白。
2.2.2 信号肽、跨膜区及亚细胞定位预测分析
TargetP 1.1 Server 预测结果显示，线粒体信号肽
（mitochondrial targeting peptide，mTP）为 0.051，
分泌通路信号肽（secretory pathway signalpeptide，
SP）为 0.049，其他为 0.956。SignalP 4.0 Server 预
测结果显示 AsNINJA1 蛋白为非分泌蛋白，不具有
信号肽。 TRMHMM server v2.0 跨膜区预测
AsNINJA1 编码的蛋白没有跨膜区域，为非膜蛋白。
亚细胞定位结果表明该蛋白定位于细胞核中。
2.2.3 结构域预测 InterProScan 在线工具预测
AsNINJA1蛋白保守结构域，共有3个结构域（图2）。
AsNINJA1 蛋白的保守结构域主要含 Ninja 结构域，
以及 2 个未明确分类的保守结构域。Ninja 结构域位
于 331～380（PF07897），是植物响应胁迫过程中
JA 信号通路的负调控因子 NINJA 特有的结构域；
还有一类保守结构域在 IPR 中没有明确分类，位于
（PTHR31413 和 PTHR31413：SFO）331～379 两个
结构域仍未命名。
2.3 AsNINJA1 氨基酸序列的分子系统进化分析
通过 NCBI 在线工具 Blast 进行数据比对，结合
相关文献的查阅，筛选出包括白木香 AsNINJA1 在
内的 17 个物种，属 NINJA 家族蛋白的 17 种蛋白，
并下载它们的蛋白质序列（图 3）。使用 MEGA5.05

图 2 AsNINJA1 蛋白保守结构域预测分析
Fig. 2 Predicted characteristic conserved domains of AsNINJA1 protein

图 3 白木香 AsNINJA1 蛋白与可可 NINJA 蛋白保守结构域序列相似性比较分析
Fig. 3 Comparison on sequence similarity of conservative domains of AsNINJA1 protein in A. sinensis and NINJA protein in cocoa

M 1
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
AsNINJA
Interactor of JAZ
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进行多序列的比对，采用相邻连接法构建 HDR 进
化树，进行聚类分析。结果如图 4 所示，白木香
AsNINJA1 与可可 JAZ 互作因子蛋白聚为一类，两
者亲缘关系最近，其中与可可的 NINJA 蛋白关系最
近，两蛋白保守结构域序列相似性为 88.7%。

图 4 白木香 AsNINJA1 系统发生树
Fig. 4 Phylogenetic tree of AsNINJA1 in A. sinensis
2.4 MeJA 处理后白木香 AsNINJA1 基因表达分析
不同时间段 MeJA 诱导白木香愈伤组织中
AsNINJA1 基因相对表达结果如图 5 所示。MeJA
能明显诱导白木香愈伤组织中 AsNINJA1 基因
mRNA 的表达，MeJA 处理后 0.5 h AsNINJA1 基
因相对表达量相对于对照提高了 40 多倍，随后增
长量下降，2 h 后快速增高直至 4 h 时达到最大值，
高达对照表达量近 100 倍；24 h 后基因的表达量
降低至正常水平。AsNINJA1 基因相对表达在不同
处理时间差异显著，处理 4 h 与其他各时间段均
差异显著。而对照组在不同时间段 AsNINJA1 基
因的相对表达量比较低，并且无明显变化，无显
著性差异。


图 5 MeJA 诱导白木香愈伤组织中 AsNINJA1 基因的表达
Fig. 5 Effect of MeJA on AsNINJA1 gene expression
in A. sinensis callus
3 讨论
植物由于受制于不能移动的特性，长期以来受
到来自于环境中生物和非生物的胁迫形成了一套有
效的防御系统。近几十年来，植物响应外界胁迫的
防御机制的研究一直都是备受关注的热点。沉香资
源短缺、价格昂贵，具有伤害后经过较长时间才能
产生的特点，因此揭示外界伤害胁迫诱导形成的分
子机制对于结香至关重要。
本研究首次从白木香中克隆得到了 JA 信号途
径中的第一个关键蛋白基因 AsNINJA1，这也是沉香
属植物第一次获得该基因。生物信息学分析表明，
该基因编码的氨基酸序列具有典型的 NINJA 蛋白
家族的结构域。因此，推测 AsNINJA1 蛋白可能作
为 JA 信号通路中的一个负调控因子与 JAZ 抑制蛋
白发生相互作用，共同调控着相关基因的表达。
qRT-PCR 结果表明，该基因的表达对 MeJA 诱导的
化学伤害敏感，且主要在早期响应伤害胁迫，后期
则基本恢复原表达水平。对于 MeJA 处理后，
AsNINJA1 基因的表达并未出现一个逐渐增高的趋
势，而是在初期 0.5 h 时出现表达量高于对照 40
倍的高峰期，随后降低再升高的表达特征，这与前
人的研究结果一致。即植物细胞在受到伤害胁迫
后，植物细胞膜快速释放出内源 JA 作为第二信号
分子，参与 JA 相关防御反应并产生相应的次生代
谢物[12-16]。总之，qRT-PCR 结果在一定程度上说明
AsNINJA1 基因属于防御反应早期应答的基因。研究
结果为从分子水平上调控 AsNINJA1 基因表达量及
其揭示白木香倍半萜合成分子机制的研究提供了基
础数据。但是，AsNINJA1 基因究竟在沉香形成的过
程发挥着怎样的作用，与信号通路中其他的蛋白如
何相互作用共同调控响应 JA 信号途径相关基因的
表达有待更深入的探讨。
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黄瓜
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短花药野生稻
玉米
狗尾草
不诱导 诱导 140
120
100
80
60
40
20
0
相
对
表
达
量

0 0.5 1 2 4 6 12 24
处理时间 / h
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