全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 21 期 2013 年 11 月 ·2997·
九州虫草 Zn2＋胁迫下金属硫蛋白的诱导产生规律及性质研究
张 琪 1，程显好 2*，郭文娟 1，刘凤红 2，王朝霞 2
1. 天津工业大学，天津 300000
2. 鲁东大学菌物科学与技术研究院，山东 烟台 264100
摘 要：目的 探讨 Zn2＋胁迫下九州虫草 Cordyceps kyusyuensis 金属硫蛋白（MT）的产生及性质。方法 以培养基中添加
ZnSO4 的方式，研究九州虫草在 Zn2＋胁迫下 MT 的产生规律。通过超声波细胞破碎、提取和凝胶柱色谱法对 MT 进行分离
纯化，利用考马斯亮蓝法进行纯度鉴定。用电喷雾质谱法测定 MT 的相对分子质量，以 Ellman’s 方法测定巯基的量，以原
子火焰吸收法测定 Zn 的量，以 Ag 饱和分析法结合原子吸收光谱（AAS）测定 MT 的量，用氨基酸自动分析仪对 Zn-MT 进
行氨基酸组成分析。通过对羟基自由基（HO•）、DPPH 自由基（DPPH•）和超氧阴离子自由基（O •2 ）的清除率实验探讨九
州虫草 MT 的抗氧化活性。结果 菌丝体中 Zn 和 MT 的量随着培养基中 Zn2＋质量浓度（0～15 g/L）的增加而增加。在 10 L
发酵罐培养时，培养基中 Zn2＋质量浓度为 15 g/L，培养时间为 56 h，金属硫蛋白的量为 14.335 mg/g 菌丝体（湿质量）。对
九州虫草的菌体蛋白通过 2 次凝胶柱色谱，冷冻干燥得到九州虫草 MT，电喷雾质谱法测得其相对分子质量为 6 750，每分
子 Zn-MT 氨基酸总量为 56 个，含有 20 个半胱氨酸，含极少量的芳香族氨基酸，可结合 6 个 Zn 原子。九州虫草 Zn-MT 对
于 HO•、DPPH•、O •2 有较好的清除作用，清除效果依次为 O •2 ＞DPPH•＞HO•，其半数清除率质量浓度（IC50）分别为 71.49、
80.58、100.65 mg/L。结论 通过紫外扫描图谱分析、蛋白柱色谱图谱分析、九州虫草 Zn-MT 理化性质以及抗氧化活性的测
定，可以判断其与标准的兔肝 MT 非常相似，进一步可以确定通过九州虫草菌丝体液态发酵法可生产 MT，以期为工业生产
提供可靠的理论依据。
关键词：九州虫草；金属硫蛋白；分离纯化；氨基酸组成；抗氧化活性
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)21 - 2997 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.21.011
Production and properties of matallothionein in Cordyceps kyusyuensis
under Zn2+ stress
ZHANG Qi1, CHENG Xian-hao2, GUO Wen-juan1, LIU Feng-hong2, WANG Zhao-xia2
1. Tianjin Polytechnic University, Tianjin 300000, China
2. Institute of Mycological Science and Techology, Ludong University, Yantai 264100, China
Abstract: Objective To explore the production and properties of matallothionein (MT) in Cordyceps kyusyuensis under the zinc ion
(Zn2+) stress. Methods By adding ZnSO4 to the culture, the production regularity of MT in C. kyusyuensis under Zn2+ stress was
explored. Ultrasonic cell disruption, crude extraction, and gel column chromatography were employed to isolate and purify the MT.
The methods of Coomassie brilliant blue, electron spray mass spectrometry (ESMS), Ellman’s reagent colorimetry, atomic flame
absorption spectrometry, silver saturation method with atomic absorption spectrometry analysis, and amino acid analyzer were used to
determine the purity, molecular weight, sulfhydryl content, zinc content, MT content, and amino acid composition, respectively. In
addition, the anti-oxidative activity was identified by scavenging capacity of hydroxyl radicals (HO•), DPPH radicals (DPPH•), and
superoxide anion radicals (O •2 ). Results The contents of Zn and MT in mycelia increased strikingly with the increase of Zn2+
concentration (0－15 g/L) in the culture medium. In 10 L fermenter, MT achieved the maximum yield up to 14.335 mg/g mycelium
(wet weight) with Zn concentration of 15 g/L in 56 h, and the biomass reached 16.921 g/L. The C. kyusyuensis Zn-MT was obtained
with Sephadex G-50 and Sephadex G-25 gel filtration, and dried by vacuum freeze-drying. The molecular weight of the protein was 6
750, one molecule Zn-MT binded six zinc atoms and contained 56 molecules of amino acid, which contained 20 molecules of cysteine

收稿日期：2013-06-29
基金项目：山东省自然科学基金联合专项资助（ZR2010CL005）；烟台市科技发展计划项目资助（2011069）
作者简介：张 琪（1987—），女，硕士研究生，研究方向为天然产物化学。Tel: 18353512283 E-mail: weifangzhangqi@163.com
*通信作者 程显好 Tel: 13695359213 E-mail: chengxianhao@sohu.com
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and one molecule of histidine. The eliminating action of C. kyusyuensis Zn-MT for HO•, DPPH•, and O •2 was better than that of
glutathione, and the eliminating action was different in O •2 > DPPH•> HO•. The concentration of half clearance rate was 71.49, 80.58,
and 100.65 mg/L. Conclusion According to ultraviolet scan pattern analysis, protein column chromatogram analysis,
physicochemical properties, and anti-oxidative activity of C. kyusyuensis Zn-MT, it is similar with the characteristics of standard
animal MT, and a certain concentration of zinc sulfate liquid fermentation of C. kyusyuensis could induce the synthesis of Zn-MT,
which could provide the reliable theoretical basis for the industrial production.
Key words: Cordyceps kyusyuensis (Fr.) Link; matallothionein; separation and purification; amino acid composition; anti-oxidative
activity

金属硫蛋白（metallothionein，MT）是一类广
泛存在于生物体内的低相对分子质量、高巯基含量、
能大量结合金属离子的蛋白质。自从 1957 年美国生
物学家 Margoshes 和 Vallee[1]首次从马肾中分离出
镉结合的 MT（Cd-MT），1975 年 Prinz 和 Weser[2]
从酿酒酵母中分离出铜结合的 MT（Cu-MT）以来，
目前几乎能从所有的哺乳动物、两栖类、鱼类、某
些植物和原核、真核微生物体中分离得到 MT[3-5]。
真核微生物中分离出的 MT 在氨基酸组成、半胱氨
酸（Cys）的量，结合金属的数量及其蛋白质的结
构域上与哺乳动物 MT 有差别，但其基本结构、性
质、功能类似[6]。此类 MT 的特征主要有：低相对
分子质量（2 000～10 000），富含 Cys（约占 6.8%～
44.0%），没有或含极微量的芳香族氨基酸，高金属
的量（每分子 MT 约结合 4～13 个金属原子）。研究
表明，MT 是一种体内清除自由基最强的蛋白质，
其清除能力强于谷胱甘肽（GSH）[7]。由于 MT 具
有重要的生物学功能和良好的应用前景，其已成为
世界各国科学家竞相研究的热点。
本实验室前期工作中发现，几种虫草属真菌对
于 Zn2＋、Mn 离子具有较高耐受与富集特性[8-9]，进
一步研究发现，九州虫草可以由富集到体内的金属
离子诱导而产生大量 MT。本实验仅就九州虫草在
Zn2＋胁迫下 MT 的诱导产生规律、分离纯化、性质
鉴定及抗氧化活性进行了探讨，以期为九州虫草
MT 开发利用提供理论依据。
1 仪器与材料
LDZX—50KB 型立式压力灭菌器（上海申安医
疗器械厂），HZQ—Q 全温振荡培养箱（哈尔滨东
联电子技术开发有限公司），AA800 型原子吸收分
光光度仪（美国 PE 公司，附带微机和打印机），超
净工作台，KQ—100TDB 高频数控超声波清洗器
（昆山市超声仪器有限公司），Eppendorf 冷冻干燥
离心机，LGJ—10B 型真空冷冻干燥仪（北京四环
科学仪器厂有限公司），电喷雾质谱仪（美国 Agilent
公司），日立 835—50 型氨基酸自动分析仪（日立
公司）。
九州虫草 Cordyceps kyusyuensis CFCC89250，
购于中国林业微生物菌种保藏管理中心，保存于试
管 PDA 培养基斜面上。标准品兔肝 MT（Sigma 公
司），Sephadex G-50、Sephadex G-25、1, 1-二苯基
苦基苯肼（DPPH）均购自上海蓝季科技发展有限
公司，除标明外，其余均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 不同 Zn2 ＋质量浓度下诱导产生九州虫草
Zn-MT 的规律
2.1.1 培养基与试剂 试管斜面培养基：马铃薯琼
脂培养基（PDA 培养基）：马铃薯 20%，葡萄糖 2%，
琼脂 2%，pH 5.5～7.0；发酵培养基：葡萄糖 2.5%，
蛋白胨 0.6%，酵母浸粉 0.5%，KH2PO4 0.1%，MgSO4
0.1%，pH 5.5～7.0。
2.1.2 九州虫草液体种子的制备 将保藏的菌种接
入试管斜面 PDA 培养基中，25 ℃培养 7 d，置于 4
℃保存备用。将 200 mL 液体培养基装于 500 mL 锥
形瓶，于 121 ℃灭菌 30 min，将活化好的菌种接入
液体培养基中，每瓶接 0.5 cm2大小菌种 1块，25 ℃，
150 r/min 于摇床中培养 3 d。
2.1.3 九州虫草菌丝体内 Zn 的定量测定 称取烘
干至恒定质量的菌丝样品 0.1 g，加入 10 mL 体积比
为 4∶1 的浓硝酸-高氯酸的消化液，在沸水浴中加
热至澄清，用去离子水适度稀释后采用原子吸收分
光光度计进行测定，重复 3 次。测试条件为波长
285.2 nm，狭缝 3 mm，灯电流 5 mA，灯电压 170 V，
空气流量 15 L/min，乙炔流量 5 L/min。
2.1.4 九州虫草菌丝体内 Zn-MT 的定量测定[10]
利用 Ag 饱和分析法结合原子吸收光谱（AAS）检
测含 MT 的溶液中 MT 的量。基于 Ag+与 MT 的高
亲合力及 MT 的热稳定性，具体方法：称取烘干至
恒定质量的菌丝样品 0.1 g，加入 10 mL 体积比为
4∶1 的浓硝酸-高氯酸的消化液，在沸水浴中加热
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至澄清，用去离子水将消化液定容至 100 mL。取
0.2 mL 消化液，加入 0.5 mL 25 μg/mL 的 AgNO3 溶
液，待完全反应后，加入 100 μL 质量分数为 2%的
血红蛋白溶液，以结合过量的 Ag+，加热使血红蛋
白完全沉淀，则与 MT 结合的 Ag+完全存在于上清
液中，通过 AAS 测定其中 Ag+的量，利用公式：
MT＝(CAg＋－CBKG)×3.55×VT / m 计算出菌丝体中
MT 的量。其中 CAg＋为最终上清液中 Ag+质量浓度
（μg/mL），CBKG 为不加样品液的空白样品最终上清
液的读数（μg/mL）；VT为最终总体积（mL）；m 为
得到样品液所用菌丝体的质量（mg）。
2.1.5 ZnSO4 诱导九州虫草 Zn-MT 生产条件的确
定 液体培养基中添加 ZnSO4·7H2O，在 0～20 g/L
设置 Zn2+质量浓度梯度为 1 g/L，共设 20 个实验组
和 1 个空白对照组，每组 5 个平行实验。在 500 mL
摇瓶中装 200 mL 液体培养基，接入 5 mL 液体种
子，置于 25 ℃、150 r/min 摇床中培养 7 d。滤过
之后，将菌丝体用清水洗 3 次，分别测其菌丝体
Zn2+的量和菌丝体中 MT 的量。随着培养基中 Zn2+
质量浓度的不同，二者的变化规律见图 1。九州虫
草菌丝体内富集Zn的量与合成Zn-MT的量存在正
相关关系。在 Zn2+质量浓度为 0～16 g/L，九州虫
草菌丝体内合成 MT 的量随着富集 Zn 量的增加而
增加。在 Zn2+质量浓度为 15 g/L 时，菌丝体内合
成 MT 的量最大。然而在 Zn2+质量浓度为 16～20
g/L，可能是金属离子质量浓度太大，超出了生物
体的抵抗能力，影响了生物机体内 Zn 的运输通道
或破坏了生物机体的正常代谢途径，菌丝体内 Zn
的量呈降低趋势，而随之 MT 的量也呈降低趋势。
由此确定 Zn2+诱导九州虫草合成 MT 的质量浓度
为 15 g/L。




图 1 培养基中不同质量浓度 Zn2+下菌丝体中 Zn 的量
和 MT 的量
Fig. 1 Contents of Zn and MT in mycelia with different
Zn2+ concentration
2.2 10 L 发酵罐放大培养九州虫草菌丝体
2.2.1 九州虫草菌丝体的发酵罐放大培养 根据
“2.1”项中单因素试验设计方法对 ZnSO4 诱导九州
虫草 MT 生产条件的筛选，取 Zn2+质量浓度为 15
g/L。其发酵条件：装液量 6 L/10 L，接种量 6%，
通气量 350 L/h，发酵搅拌转速 300 r/min，发酵温
度 25 ℃，pH 值为 6.0，发酵时间 72 h。
2.2.2 10 L发酵罐放大培养条件下九州虫草菌丝体
生物量及MT量的变化规律 在 10 L发酵罐培养条
件下，测定了九州虫草菌丝体生物量及 MT 随培养
时间的变化规律，结果见图 2。培养至 48 h 时，菌
丝体生物量达到 18.325 g/L，菌丝体内 MT 的量为
12.871 mg/g 菌丝体湿质量；而在 56 h 时生物量降
低为 16.921 g/L，菌丝体内 MT 的量却提高至 14.335
mg/g 菌丝体湿质量。由此确定发酵终点为 56 h。




图 2 发酵过程中九州虫草生物量与 MT 的量
Fig. 2 Mycelia biomass and MT contents of C. kyusyuensis
in fermentation process

2.3 九州虫草 Zn-MT 的分离及性质鉴定
2.3.1 九州虫草 Zn-MT 的粗提取 过滤菌丝体，用
无菌水洗涤 3～4 次；称取一定质量的菌丝体于烧杯
中，以每克湿菌丝体加入 4 mL 1 mol/L NaOH 溶液
的比例加入 NaOH 溶液，充分搅拌混匀，用 0.05
mol/L 的稀盐酸调 pH 值至 8.5。置于 100 W 超声功
率下超声波提取 40 min，混匀后 4 ℃、5 000 r/min
离心 20 min。取上清液于 80 ℃水浴中热变性除杂
蛋白质 10～15 min，冷却，再 4 ℃、8 000 r/min 离
心 25 min，取上清液，测量并记录其体积。
2.3.2 粗提取液的紫外吸收光谱特征图 粗提取
液在 pH 值为 8.5 和 2.0 条件下，于 210～310 nm
紫外区进行连续扫描，间隔为 1 nm。最终绘制粗
提取液的紫外吸收光谱特征图（图 3）。九州虫草
锌结合蛋白在 210～300 nm 出现明显肩峰，该光谱
特征与兔肝 MT 光谱特征相似。在 254 nm 处有 MT
Zn
/
(m
g·
g−
1 )

140
120
100
80
60
40
20
0
0 5 10 15 20
Zn2+ / (g·L−1)
Zn
MT
12
10
8
6
4
2
0
M
T
/ (
m
g·
g−
1 )

生物量
MT
生
物
量
/
(g
·L
−1
)
20
16
12
8
4
0
16
14
12
10
8
6
4
2
0
M
T
/ (
m
g·
g−
1 )

0 16 32 48 64
t / h
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图 3 Zn-MT 粗提取液紫外扫描光谱图
Fig. 3 Ultraviolet absorption spectra of Zn-MT
in crude extract solution
的特征吸收峰，280 nm 处无特征吸收峰，说明九
州虫草 Zn-MT 不含芳香族氨基酸。又因为通过对
比纯化的九州虫草锌结合蛋白组分与标准 Zn-MT
的反相色谱图，发现两者的脱金属色谱图很相似。
参照现有的研究报道，又鉴于九州虫草锌结合蛋白
与典型的动物 MT 的光谱特征的相似性，基本可以
断定本研究中提取的蛋白质为预期得到的九州虫
草 Zn-MT。
2.3.3 九州虫草 Zn-MT 的纯化 将“2.3.1”项中的
上清液上样于预先充分平衡好的 Sephadex G-50（40
cm×5 cm）柱进行色谱分离，纯水作为洗脱剂进行
洗脱，体积流量 1.2 mL/min，每 10 分钟收集 1 管。
对洗脱液进行紫外（254 nm）吸光度值（A254）和
Zn 信号检测，结果见图 4。第 10 管处有 1 个较强
的紫外吸收峰，对应的 Zn 信号偏低，由其外观呈
现黄色，是 1 个未知成分；而第 40 管处又出现 1
个强的紫外吸收峰，且其对应的 Zn 信号很强，该
峰的洗脱位置与标准品兔肝 MT 的位置一致，为
Zn-MT 组分。收集该洗脱峰的洗脱液，适当浓缩后
真空冷冻干燥得到 MT 粗品。用超纯水溶解冻干粉，
再用脱盐柱 Sephadex G-25（50 cm×2.5 cm），以超
纯水为洗脱剂，体积流量 0.6 mL/min，每 10 分钟收
集 1 管，进行脱盐再纯化，收集 Zn 结合的 MT 组
分，经真空冷冻干燥得到九州虫草 Zn-MT 纯品。用
考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定样品中蛋白质的
纯度[11]。
2.4 九州虫草 Zn-MT 的性质鉴定
2.4.1 基本性质测定 用原子火焰吸收法测定样品
中 Zn 的量[12]；用 Ellman’s 方法测定巯基的量[13]。
结果表明，纯化的 Zn-MT 27.01 mg 中含 1.6 mg Zn，
巯基的量为 3.054 μmol/mg 蛋白质，即每毫克纯化
的 Zn-MT 中含 59.24 μg Zn 和 3.544 μmol 的巯基，



图 4 九州虫草粗提取液经 Sephadex G-50 凝胶色谱
分离的色谱图
Fig. 4 Sephadex G-50 gel filtration column separation
of crude extract from C. kyusyuensis

由此推算出每分子 Zn-MT 含有 6 个 Zn 原子和 20
个巯基。
样品相对分子质量测定[14]：将 MT 干粉溶于含
0.1%乙酸的甲酸溶剂中，配成 2 mg/L 的样品液，用
电喷雾质谱法（ES-MS）测定相对分子质量，其检
测限可低于 1 fmol。采用电喷雾离子化正离子方式
（ESI+），离子源雾化室参数：毛细管电压为 3.5 kV，
离子源温度 90 ℃，锥电压 10 V，干燥气（氮气）
温度 130 ℃，干燥气体积流量 400 L/h，雾化气（氮
气）压力为 0.25 MPa，体积流量 70 L/h，样品液由
仪器内置的蠕动泵进行注射，体积流量为 10～20
L/min。采集质量范围 m/z 0～16 000，由仪器软件
调节仪器参数并处理数据。电喷雾质谱法测定九州
虫草 MT 相对分子质量结果见图 5。用电喷雾质谱
仪软件计算得其相对分子质量为 6 750，比兔肝 Zn-
MT 的相对分子质量略小。



图 5 九州虫草 Zn-MT 电喷雾质谱图
Fig. 5 ESMS spectrum of Zn-MT in C. kyusyuensis

2.4.2 氨基酸组成测定 日立 835—50 型氨基酸自
动分析仪；分离柱：150 mm×2.6 mm（填充日立
2619 型阳离子交换树脂）；脱氨柱（50 mm×4 mm，
填充树脂为日立 2650）；柱温 53 ℃；N2压力 28 kPa；
茚三酮体积流量 0.3 mL/min，柱压 0.9～1.0 MPa；
缓冲液：柠檬酸钠、柠檬酸、氯化钠配成 pH 3.5 的
溶液，缓冲液体积流量 0.4 mL/min，柱压 8.82～9.8
MPa；水解氨基酸标准品（含 2.5 mmol/L 18 种标准
pH 8.5
pH 2.0
210 230 250 270 290 310
波长 / nm
A
值

10
8
6
4
2
0
A254
Zn2+
0 10 20 30 40 50 60
管数
30
25
20
15
10
5
0
Zn
2+
/
(m
g·
L−
1 )

0 4 000 8 000 12 000 16 000
m / z
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氨基酸，Sigma 公司）；检测波长 440 nm 和 570 nm；
进样量 50 μL；分析时间 70 min。
准确称量 MT 冻干粉 5 mg，加 6 mL 浓度为 6
mol/L HCl 溶液，于 110 ℃真空状态下水解 24 h，
启封后加 1 mL 浓度为 0.02 mol/L NaOH 溶液静置 4
h，用 0.1 mol/L 的 HCl 溶液中和后用 0.02 mol/L HCl
溶液稀释于 250 mL 量瓶中，上机分析氨基酸。再
取 5 mg 样品用过甲酸氧化法处理样品后上机分析
Cys 的量[15]。
由表 1 氨基酸组成测定结果显示，九州虫草
Zn-MT 总数趋近于 56 个氨基酸。其中，疏水性氨
基酸，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯
氨酸、酪氨酸共有 11 个，占 19.6%；Cys 20 个，占
35.7%，Cys 数目与“2.3.3”项中巯基数目相符；还
含有 1 个组氨酸，占 1.8%。而典型的哺乳动物 MT
（以小鼠肝脏MT-II为例）[16]，每分子含有 18个Cys，
并可结合 7 个 Zn 原子，其中 Cys 占 28%，疏水氨
基酸占 22.7%，不含任何芳香族氨基酸或组氨酸。
对比说明本研究中的九州虫草 MT 与典型的哺乳动
物 MT（以小鼠肝脏 MT-II 为例）相类似。另外，
从九州虫草中提取的这类MT疏水性弱于动物MT，

表 1 九州虫草 Zn-MT 氨基酸成分
Table 1 Amino acid composition of Zn-MT
from C. kyusyuensis
氨基酸 质量分数 / % 残基数 邻近整数
Cys 34.700 1 20.1 20
天冬氨酸 9.681 8 5.1 5
苏氨酸 1.492 1 0.9 1
丝氨酸 0 0 0
谷氨酸 17.240 0 9.2 9
脯氨酸 3.744 0 2.3 2
甘氨酸 5.364 8 4.9 5
丙氨酸 0.234 9 0.2 0
缬氨酸 8.177 1 4.7 5
甲硫氨酸 0.236 2 0 0
异亮氨酸 4.255 6 2.8 3
亮氨酸 2.441 6 1.2 1
苯丙氨酸 0.091 7 0 0
组氨酸 2.599 6 1.2 1
赖氨酸 4.226 5 2 2
精氨酸 4.949 7 2.2 2
酪氨酸 0 0 0
总量 99.435 7 56.4 56
因此在色谱过程中不易聚合变性，提高了蛋白质纯
化的产率，利于九州虫草 MT 的工业化大规模生产。
2.5 九州虫草 Zn-MT 的抗氧化实验
2.5.1 九州虫草 Zn-MT 对羟基自由基（•OH）的清
除作用 •OH 具有极高的氧化电位，是自然界中仅
次于氟的氧化剂，是目前所知活性氧自由基中对生
物体毒性最强、危害最大的一种自由基。大量研究
证明，MT 和 GSH 对•OH 的清除能力很强[7]。以
GSH 清除•OH 的效果作为样品清除•OH 能力的比
较，以一定质量浓度的 Zn2+溶液为对照。按文献方
法[17]测定。由测定结果（图 6）可知，清除•OH 的
能力随着 Zn-MT 质量浓度的增加而呈增长趋势，且
其半数清除率质量浓度（IC50）为 100.65 mg/L，GSH
的 IC50为 61.85 mg/L，且 Zn2+对•OH 几乎没有清除
作用。九州虫草 Zn-MT 清除•OH 的能力弱于 GSH。




图 6 九州虫草 Zn-MT 清除•OH 的能力
Fig. 6 Hydroxyl radical eliminating abilitity
of Zn-MT in C. kyusyuensis

2.5.2 九州虫草 Zn-MT 对 DPPH 自由基（DPPH•）
的清除作用 DPPH•是一种紫黑色的稳定的醇溶性
自由基，于 517 nm 波长处有强吸收。在其乙醇溶
液中加入自由基清除剂时溶液颜色由紫色向黄色变
化，且颜色变化程度与自由基清除程度呈线性关系。
通过在 517 nm 处的 A 值来反应自由基被清除的程
度，清除自由基的能力越强，其抗氧化活性越高[18]。
九州虫草 Zn-MT 清除 DPPH•的能力与 GSH 作比
较，以一定质量浓度的 Zn2+溶液作为对照。按文献
方法[19-21]测定，结果见图 7。对 DPPH•的清除能力
随着 MT 质量浓度的增加而增加。且九州虫草
Zn-MT 和 GSH 的 IC50 分别为 80.58 mg/L 和 90.75
mg/L，而 Zn2+对 DPPH•的清除率几乎为 0。实验结
果表明，按半数清除率质量浓度计算，得九州虫草
Zn-MT 清除 DPPH•的能力是 GSH 的 1.1 倍。
2.5.3 九州虫草 Zn-MT 对超氧阴离子自由基（O •2 ）
的清除作用 O •2 是机体内生命代谢产生的寿命很
长的自由基，具有很强的氧化性。本实验是利用邻
清
除
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图 7 九州虫草 Zn-MT 清除 DPPH•的能力
Fig. 7 DPPH radical eliminating abilitity
of Zn-MT in C. kyusyuensis

苯三酚在碱性环境下发生自氧化反应测定抗氧化剂
对其产生的 O •2 的清除作用。以 GSH 清除 O •2 的能
力作为比较实验，以含 Zn2+的溶液作为对照实验。
按文献方法[22]测定，结果见图 8。随着九州虫草
Zn-MT 质量浓度的增加，对 O •2 的清除能力增强。
其中九州虫草 Zn-MT 和 GSH 的 IC50 分别为 71.49
mg/L 和 82.44 mg/L，Zn2+对 O •2 无清除作用。由此
得知样品对 O •2 的清除能力是 GSH 的 1.2 倍，稍强
于 GSH。




图 8 九州虫草 Zn-MT 清除 O •2 的能力
Fig. 8 Superoxide anion radical eliminating abilitity
of Zn-MT in C. kyusyuensis

综上所述，九州虫草 Zn-MT 对于 HO•、DPPH•、
O •2 都有较好的清除作用，清除效果依次为 O •2 ＞
DPPH•＞HO•。IC50 分别为 71.49、80.58、100.65
mg/L，九州虫草 Zn-MT 抗氧化能力稍强于 GSH。
3 讨论
目前商品化的 MT 大多是从兔肝中提取分离
的，其技术要求高、生产成本高等缺点造成 MT 非
常昂贵。因此，寻求来源丰富、开发廉价的材料成
为降低 MT 生产成本的重要途径。真核微生物的
MT 相对分子质量范围较大，为 2 000～10 000，氨
基酸组成较一般蛋白质差异较明显，不含或含极微
量的苯丙氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸和组氨酸，
且具有较强的抗氧化活性。本研究中所得到的九州
虫草 MT 的相对分子质量、Cys 的量、结合金属数
量等均在符合这些基本的真核微生物 MT 特征。九
州虫草菌丝体在金属离子胁迫下会合成 MT，且其
诱导合成 MT 的条件不严苛、设备简单、成本低、
生产周期短，MT 产量可观。本研究不仅发现了这
种能诱导合成 MT 的虫草材料，而且提供了一种简
单易行的提纯工艺，这对工业生产很有意义。
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