全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 19 期 2013 年 10 月

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丹红注射液对乳鼠脑微血管内皮细胞缺氧损伤的保护作用
周 鹏 1，周惠芬 1，何 昱 1，张宇燕 1，杨洁红 1，赵 涛 2，付 巍 2，邢攀科 2，万海同 1*
1. 浙江中医药大学 心脑血管病研究所，浙江 杭州 310053
2. 山东步长制药有限公司，山东 菏泽 274000
摘 要：目的 研究丹红注射液对缺氧致原代培养的乳鼠脑微血管内皮细胞（rBMECs）损伤的保护作用。方法 原代培养
rBMECs，并对其进行兔抗鼠 VIII 因子鉴定。实验设对照组，缺氧模型组，丹红注射液低、中、高剂量（25、50、100 μL/mL）
组，给药后，rBMECs 缺氧 4 h。显微镜下观察细胞形态；流式细胞仪检测细胞凋亡率及 DNA 的量，按试剂盒方法检测细胞
上清液中乳酸脱氢酶（LDH）水平、细胞中超氧化物歧化酶（SOD）活性。结果 丹红注射液 50、100 μL/mL 可显著对抗
缺氧造成的损伤，明显改善 rBMECs 形态，使缺氧所致细胞凋亡数明显减少，有效抑制缺氧诱导的 rBMECs 发生 G1/S 期阻
滞，抑制 LDH 释放，增强 SOD 活性。结论 丹红注射液对缺氧所致原代培养的 rBMECs 损伤具有明显的保护作用，其机
制与增强细胞抗氧化能力、抑制细胞凋亡有关。
关键词：丹红注射液；乳鼠脑微血管内皮细胞；缺氧；抗氧化；细胞凋亡
中图分类号：R972.9 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)19 - 2727 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.19.018
Protection of Danhong Injection on brain microvascular endothelial cells injury
by hypoxia in neonate rats
ZHOU Peng1, ZHOU Hui-fen1, HE Yu1, ZHANG Yu-yan1, YANG Jie-hong1, ZHAO Tao2, FU Wei2,
XING Pan-ke2, WAN Hai-tong1
1. Institute of Cardiovascular-Cranial Disease, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China
2. Heze Buchang Pharmaceutical Co., Ltd., Heze 274000, China
Abstract: Objective To study the protective effect of Danhong Injection (DI) on primary cultured neonate rat brain microvascular
endothelial cells (rBMECs) injury. Methods The primary cultured rBMEC model was established and the identification of rabbit anti
rat VIII factor was carried out. The cells were divided into control, model, low-, mid-, and high-dose (25, 50, and 100 μL/mL) DI
groups in hypoxic condition for 4 h after administration. The cell morphology was observed under microscope, the apoptosis rate and
DNA content were determined by flow cytometry, and the lactate dehydrogenase (LDH) level in cultural supernatants and cell
superoxide dismutase (SOD) activity were detected according to the kit methods. Results DI (50 and 100 μL/mL) could alleviate the
rBMEC damage induced by hypoxia remarkably, improve the cell morphology of rBMECs, decrease the apoptosis significantly,
inhibit the blockage of rBMECs in G1/S phase and the leakage of LDH, and increase the SOD activity. Conclusion DI plays a
significant role in the protection on injured primary cultured rBMECs induced by hypoxia, and the mechanism may be related to the
enhancement of cellular anti-oxidative capacity and the inhibition of apoptosis.
Key words: Danhong Injection; neonate rat brain microvascular endothelial cells; hypoxia; anti-oxidantion; apoptosis

缺血性中风是指血管阻塞引起脑缺血、缺氧损
伤进而导致局灶或全脑的功能障碍，具有发病率高、
致残率高、死亡率高和复发率高等特点，是威胁人
类健康的重大疾病之一[1]。血管内皮细胞具有维持
管壁通透性、防止凝血和血栓形成的生理功能，干
预多种与血管有关的生理和病理生理过程[2]。血管

收稿日期：2013-04-12
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81173647，81373898，81274176）；浙江省自然科学基金资助项目（LR12H27001）；浙江省科技厅项
目（2013C33244）；浙江省中医药（中西医结合）重点学科项目（2012-XK-A06）
作者简介：周 鹏，男，主要从事中药有效成分分离及药效学研究。Tel: (0571)86633179 E-mail: zz198966@163.com
*通信作者 万海同 Tel: (0571)86613711 E-mail: wanhaitong@zjtcm.net
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内皮细胞自稳态调控失衡和微血管损伤是缺血缺氧
性损伤的重要发病机制之一。脑微血管内皮细胞
（rBMECs）及其紧密连接是血脑屏障的结构基础，
具有与外周血管内皮细胞不同的独有特征，是研究
脑血管疾病的最佳细胞模型[3]。
丹红注射液（Danhong Injection，DI）是由丹
参、红花组成的复方制剂，近年来在临床上用于治
疗瘀血闭阻所致的胸痹及中风获得肯定疗效[4]。前
期研究表明，丹红注射液对大鼠脑部缺血再灌注损
伤具有明显的保护作用，具有改善微循环、抗凝溶
栓、抗氧化作用[5-6]。本实验采用原代培养的乳鼠
rBMECs，建立缺氧损伤模型，从细胞水平上探讨
丹红注射液对缺氧所致 rBMECs 损伤的保护作用及
其作用机制。
1 材料
1.1 药品与试剂
丹红注射液，规格 10 mL/支，菏泽步长制药有
限公司，批号 12091021；M199 培养基、胎牛血清，
Gibco 公司；D-Hank’s 液、II 型胶原酶、磷酸盐缓
冲液（PBS）、FITC 标记山羊抗兔 IgG、碘化丙锭
（PI）、Folin-酚试剂、兔抗鼠 VIII 因子相关抗原抗
体、胰蛋白酶，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公
司；乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）
试剂盒，南京建成生物工程研究所；FITC Annexin V
细胞凋亡检测试剂盒、PI/RNase Staining 缓冲液试
剂盒，BD 公司；其余试剂均为市售分析纯。
1.2 动物
SD 大鼠，雌雄兼用，3～5 日龄，由浙江中医
药大学动物实验研究中心提供，许可证号 SCXK
（沪）2008-0016，上海西普尔-必凯实验动物有限公
司提供。
1.3 仪器
SW—CJ—2D 净化工作台，苏州净化设备有限公
司；3111 型 CO2培养箱，Thermo Scientific 公司；DMI
4000B 荧光倒置显微镜，德国徕卡公司；LDZ5—2
型低速自动平衡离心机，北京京立离心机有限公司；
TU—1900 双光束紫外可见分光光度计，北京普析
通用仪器有限责任公司；Thermo Scientific Varioskan
Flash 酶标仪、BD FACSCulibur 流式细胞仪，美国
BD 公司；Eppendorf 移液枪，自制缺氧罐。
2 方法
2.1 rBMECs 的培养
参考叶立等[7]培养 rBMECs 的方法并加以改
进。取 8 只 3～5 日龄 SD 乳鼠，脱颈椎处死，置于
75%冰乙醇中浸泡 3～5 min 后，于超净工作台、无
菌条件下沿大鼠脑正中线剪开颅骨，剔除硬脑膜，
取出大脑半球，去除小脑和脑干。将脑组织立即放
入含冷 D-Hank’s 液的培养皿中，尽量去除软脑膜、
大血管、白质组织，D-Hank’s 液漂洗 3 次后将大脑
皮质移入无菌的培养皿中，剪碎至 1 mm3（以上操
作在冰袋上进行）。剪碎的灰质组织用含乙二胺四乙
酸（EDTA）的 0.25%胰蛋白酶在 37 ℃下消化 20
min，5 min 摇 1 次，加入含有 10%胎牛血清的 M199
培养液终止消化，吹打均匀，依次通过 80、200 目
不锈钢筛滤过。收集 200 目上的团块滤液，1 000
r/min 离心 10 min。沉淀悬浮于 0.1% II 型胶原酶溶
液中，吹打均匀，37 ℃消化 25 min，5 min 摇 1 次，
1 000 r/min 离心 10 min。将下层沉淀用 M199 培养
基漂洗 1 次，再次离心，沉淀用 M199 完全培养基
悬浮，接种到细胞培养瓶中，37 ℃、5% CO2 培养
箱内静置培养，4 d 后首次换液，以后每 2 d 换液 1
次，7～8 d 细胞生长成致密单层，出现“铺路石”
征象后可进行传代培养，以 2～3 代细胞用于实验。
用培养基将传至第 3 代的 rBMECs调至 1×105/mL，
1 mL/孔，接种至 6 孔板上，置 5% CO2 培养箱中于
37 ℃培养，每 2 天换液 1 次，直至细胞长成致密单
层后用于以下实验。
2.2 rBMECs 鉴定[8]
将生长的细胞致密单层用 95%冷乙醇固定 5
min，PBS 洗 3 遍，吸干，加稀释 10 倍的一抗（兔
抗鼠第 VIII 因子抗体）和 50 μg/mL PI 染料盖住细
胞层，37 ℃湿盒反应 30 min，PBS 洗 3 遍，洗去
未结合的抗体，滴加荧光素标记的二抗（羊抗兔
IgG-FITC），37 ℃湿盒反应 30 min，PBS 洗去未结
合的荧光标记二抗。以不加一抗、只加二抗和 PI
处理的细胞作为阴性对照；加缓冲甘油封片置于倒
置荧光显微镜下观察（×200），调节荧光显微镜视
野拍照并保存。
2.3 分组、给药与造模
经 MTT 实验确定丹红注射液的细胞毒性剂量
范围，预实验确定给药剂量。取丹红注射液和无血
清 M199 培养基分别配成高、中、低剂量（100、50、
25 μL/mL）的含药无血清培养基。取长成致密单层
的 rBMECs，分为对照组、模型组和丹红注射液高、
中、低剂量组，每组 6 个复孔。给药前轻轻吸去 6
孔板中的培养基，用 PBS 洗涤 2 次，对照组加入
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M199 完全培养基 1 mL，模型组加入无血清 M199
完全培养基 1 mL，丹红注射液各组分别加入含相应
剂量的丹红注射液的无血清 M199 培养基 1 mL。对
照组 37 ℃、5% CO2 培养箱内静置培养 4 h；其他
各组均置于 37 ℃的自制密闭缺氧罐中，持续通入
95% N2＋5% CO2 的混合气体，充满缺氧罐，15 min
后封口膜密封缺氧罐接口，置于37 ℃恒温箱中4 h，
倒置显微镜下观察（×200）各组细胞形态。
2.4 LDH 的量和 SOD 活性检测
取各组细胞培养上清液 20 μL，按试剂盒说明
书操作，检测 440 nm 处吸光度（A）值，计算 LDH
的量。
去除各组细胞培养基，PBS 洗 2 次，加入 0.25%
胰蛋白酶消化细胞，终止消化后消化液分成 2 份，
离心收集细胞，其中 1 份加入细胞裂解液振荡，使
细胞裂解，收集裂解液，按试剂盒说明书方法测定
SOD 活性。
2.5 流式细胞仪检测rBMECs细胞周期及早期凋亡
取“2.4”项下另 1 份细胞，每组设 3 个复管，
以 70%乙醇、−20 ℃固定 2 h，PBS 和 Stain 缓冲液
分别洗细胞 1 次，PI 染色 30 min，流式细胞仪检测。
同法每组设 3 个复管，加 Annexin V Binding 缓冲液
500 μL，振荡成单细胞悬液，FITC Annexin/PI 双染
后，流式细胞仪检测。
2.6 统计学处理
数据用 SPSS 13.0 统计软件进行处理，数据用
±x s 表示，不同组间两两比较采用 LSD 单因素方
差分析。
3 结果
3.1 rBMECs 鉴定
对照组细胞只有细胞核显示红色荧光（PI 染
色），而胞质不出现绿色荧光。在参数完全相同条件
下，对用VIII因子及二抗处理的细胞样品进行扫描，
可见细胞核出现红色荧光，且细胞质出现强绿色荧
光，表明细胞含有 VIII 因子，可认为是内皮细胞。
通过细胞计数统计，几乎 100% 的细胞均为
rBMECs。结果见图 1。
3.2 对缺氧损伤的 rBMECs 形态学的影响
对照组 rBMECs 呈梭形或多角形，轮廓清楚，
形态饱满，生长旺盛成铺路石状。模型组细胞体积
明显缩小，与周围的细胞脱离，出现越来越多的凋
亡及坏死细胞。丹红注射液能有效地减轻缺氧对细
胞形态的损伤，且呈剂量相关性。结果见图 2。


图 1 兔抗鼠 VIII 因子鉴定 rBMECs
Fig. 1 rBMECs of rabbit anti rat factor VIII identification


图 2 各组 rBMECs 形态学观察
Fig. 2 Morphological observation of rBMECs in each group
3.3 对缺氧损伤的 rBMECs 中 LDH 量与 SOD 活
性的影响
与对照组相比，模型组 rBMECs 由于缺氧促进
LDH 的释放，细胞 SOD 活性降低（P＜0.01），表
明细胞膜受到了明显损伤，通透性增加，清除氧自
由基的能力下降。丹红注射液 100、50 μL/mL 均能
显著抑制细胞上清液中 LDH 的增加（P＜0.01），并
显著增强 SOD 的活性（P＜0.01）；剂量为 25 μL/mL
时作用显著（P＜0.05）。结果见表 1。
3.4 对缺氧损伤的 rBMECs 早期凋亡的影响
对照组早期凋亡 rBMECs 仅有 5.49%；缺氧模
型组则高达 65.49%；丹红注射液 100、50 μL/mL 作
用 rBMECs 4 h 后，早期凋亡细胞分别为 20.74%、
41.65%，与模型组相比差异显著（P＜0.01）；而丹

对照 兔抗鼠 VIII 因子鉴定

对照 模型 丹红注射液 100 μL·mL−1 丹红注射液 50 μL·mL−1 丹红注射液 25 μL·mL−1
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表 1 丹红注射液对缺氧损伤的 rBMECs LDH 释放、SOD
活性的影响 ( ± = 6x s , n )
Table 1 Effect of DI on LDH leakage and SOD activity
in rBMECs injured by hypoxia ( ± = 6x s , n )
组 别
体积分数 /
(μL·mL−1)
LDH /
(U·L−1)
SOD /
(U·mg−1)
对照 － 75.04±4.85 59.37±3.80
模型 － 112.39±3.42△△ 26.21±2.74△△
丹红注射液 100 86.91±3.92** 50.86±1.47**
50 95.64±4.52** 42.72±1.26**
25 106.46±5.20* 29.38±1.29*
与对照组比较：△△P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，
下表同
△△P < 0.01 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs model group,
same as below
红注射液 25 μL/mL组则未见明显的细胞凋亡抑制作
用，表明丹红注射液高、中剂量能够明显抑制缺氧
诱导的 rBMECs 早期凋亡的进程。结果见图 3、表 2。
3.5 对 rBMECs 细胞周期的影响
与对照组比较，模型组 G1 期 rBMECs 显著增
加（P＜0.01），S 期细胞显著减少（P＜0.01），表
明缺氧可诱导 rBMECs 细胞发生 G1/S 期阻滞。与模
型组相比，丹红注射液 100、50 μL/mL 组显著增加
S 期细胞（P＜0.01），减少 G1 期细胞（P＜0.01）；
而 25 μL/mL 组未见显著改变，表明丹红注射液高、
中剂量能有效抑制缺氧诱导的 rBMECs 发生 G1/S
期阻滞。结果见表 2。
4 讨论
血脑屏障在维持大脑内环境和功能方面起着极


图 3 丹红注射液对缺氧诱导的 rBMECs 早期凋亡的影响
Fig. 3 Effect of DI on early apoptosis of rBMECs injured by hypoxia
表 2 丹红注射液对缺氧损伤的 rBMECs 早期凋亡率及细胞周期的影响 ( ± = 3x s n, )
Table 2 Effects of DI on early apoptosis and cell cycle of rBMECs injured by hypoxia ( ± = 3x s n, )
细胞周期 / % 组 别 体积分数 / (μL·mL−1) 细胞凋亡率 / %
G1期 S 期 G2期
对照 — 7.74±1.32 72.09±1.79 21.53±1.31 6.38±0.48
模型 — 63.81±4.34△△ 88.47±2.87△△ 5.42±1.62△△ 6.11±1.73
丹红注射液 100 18.70±2.55** 73.84±1.45** 19.36±1.13** 6.80±0.68
50 40.45±4.02** 76.78±1.53** 13.14±1.55** 10.08±1.05
20 59.69±4.17 86.98±2.16 7.58±1.20 5.44±1.03

为重要的作用，血脑屏障受到破坏是缺血缺氧损伤
性脑病发生的重要病理生理基础。减轻缺血缺氧后
血脑屏障的损伤是防治脑血管疾病继发性脑损伤的
重要手段，也是研发脑保护药物的主要靶点[9]。
脑缺血缺氧时，腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）合
成减少，使 Na+-K+-ATP 酶功能减弱，大量 Na+内流，
K+外流，细胞膜电位下降，产生去极化。细胞膜去
极化，释放兴奋性氨基酸，引发大量的 Ca2+内流，
导致细胞内游离 Ca2+超载。细胞内 Ca2+超载在缺氧
性神经元凋亡的发生中起关键作用。缺血缺氧后，
细胞内 Ca2+浓度的升高，可活化 Ca2+、Mg2+依赖性
核酸内切酶，使核染色质 DNA 降解成单个或寡核
苷酸小体，诱导细胞凋亡。同时过量 Ca2+沉积于线
粒体，使线粒体氧化磷酸化失偶联进一步加重，膜

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FITC
对照 模型 丹红注射液100 μL·mL−1 丹红注射液50 μL·mL−1 丹红注射液25 μL·mL−1
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电位丧失，呼吸链解体，导致细胞能量的严重丢失，
产生的大量自由基与脂质、蛋白质、核酸发生反应，
引起膜脂质过氧化，导致膜损伤[10-12]。
缺氧发生时，Ca2+大量内流引起脑细胞损伤，
血脑屏障破坏，激活一系列的酶促反应，造成细胞
内 LDH 大量外释，且诱导脑细胞的进一步损伤，产
生大量氧自由基，诱导细胞凋亡，因此通过细胞上
清液中 LDH 水平的测定，可以反映细胞膜的通透
性和完整性等。本实验结果表明，丹红注射液对由
缺氧所致 rBMECs 损伤具有保护作用，能明显抑制
细胞上清液中 LDH 量的增加，保护细胞膜的稳定
性，显著增强细胞内 SOD 的活性，改善能量代谢，
有效抑制缺氧诱导的 rBMECs发生G1/S期阻滞和早
期凋亡，且使受损细胞形态得到明显改善。
综上所述，丹红注射液对缺氧所致乳鼠 rBMECs
损伤具有显著的保护作用，其机制可能与抑制细胞
凋亡、减少氧自由基生成、提高细胞对氧自由基的
清除能力有关。
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