全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 2 期 2012 年 2 月

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HPLC-MS 法测定大鼠注射丹红注射液后血浆中 3 种酚酸类成分
王小平 1, 2，刘 峰 2，杨东华 1，屠鹏飞 3，马存德 2
1. 陕西中医学院，陕西 咸阳 712046
2. 陕西步长制药有限公司，陕西 咸阳 712000
3. 北京大学，北京 100191
摘 要：目的 建立定量测定大鼠注射丹红注射液后血浆中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸 B 的方法。方法 采用 HPLC-MS
法，Diamonsil（钻石）C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，乙腈-0.4%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱；体积流量 1.0 mL/min，
MS 检测器选用正离子模式。结果 迷迭香酸在 0.45～100.0 μg/mL（r2＝0.996 5）线性关系良好，回收率在 85.0%～101.4%，
日内、日间精密度的 RSD＜8%；紫草酸在 0.45～100.0 μg/mL（r2＝0.995 9）线性关系良好，回收率在 84.4%～93.94%，日
内、日间精密度的 RSD＜9%；丹酚酸 B 在 0.7～200.0 μg/mL（r2＝0.998 9）线性关系良好，回收率在 80.0%～97.4%，日内、
日间精密度的 RSD＜5%。结论 所建立的方法灵敏度好、准确率高，可用于丹红注射液中酚酸类成分药动学研究。
关键词：丹红注射液；迷迭香酸；紫草酸；丹酚酸 B；HPLC-MS 法
中图分类号：R286.02 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)02 - 0275 - 04
Determnation of three kinds of phenolic acids in rat plasma after iv
administration of Danhong Injection by HPLC-MS
WANG Xiao-ping1, 2, LIU Feng2, YANG Dong-hua1, TU Peng-fei3, MA Cun-de2
1. Shaanxi University of Traditinal Chinese Medicine, Xianyang 712046, China
2. Shaanxi Buchang Pharmaceuyical Co., Ltd., Xianyang 712000, China
3. Peking University, Beijing 100191, China
Abstract: Objective To establish an HPLC-MS method for determining the level of three kinds of phenolic acids (rosmarinic acid,
lithospermic acid, and salvianolic acid B) in rat plasma. Methods Diamonsil C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) was used.
Acetonitrile-0.4% formic acid solution was used as the mobile phase at a flow rate of 1 mL/min, and electrospray ionization mass
spectrometry (ESI-MS) was used to detect and quantify. Results Rosmarinic acid had a good linear relationship during 0.45—100.0
μg/mL (r2 = 0.996 5), with absolute recoveries 85.0%—101.4%. The RSD values of intra- and inter-day were less than 8%.
Lithospermic acid had a good linear relationship during 0.45—100.0 μg/mL (r2 = 0.995 9), with absolute recoveries 84.4%—93.94%.
The RSD values of intra- and inter-day were less than 9%. Salvianolic acid B had a good linear relationship during 0.7—200.0 μg/mL
(r2 = 0.998 9), with absolute recoveries 80.0%—97.4%. The RSD values of intra- and inter-day were less than 5%. Conclusion The
method is simple, quick, and convenient for the pharmacokinetic study on phenolic acids in Danhong Injection.
Key words: Danhong Injection; rosmarinic acid; lithospermic acid; salvianolic acid B; HPLC-MS

丹红注射液（Danhong Injection，DHI）是步长
集团独家拥有自主知识产权的主导品种之一[1-2]，具
有活血化瘀、通脉舒络功能，用于瘀血闭阻所致的
胸痹及中风、冠心病、心绞痛、心肌梗死等症，临
床疗效确切[3-6]。本实验建立测定大鼠血浆中丹红注
射液中酚酸类成分的方法，为研究丹红注射液的药
动学特征奠定基础。
1 仪器与材料
Agilent 1200 型高效液相色谱仪、Agilent XCT
6320 质谱仪（美国 Agilent 公司）；MVS—1 型涡旋
混合器（北京金北德工贸有限公司）；TGL—16G—A
高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）。Discovery

收稿日期：2011-07-23
作者简介：王小平（1976—），女，陕西宝鸡人，副教授，博士，从事中药药效物质基础及新药研究。
Tel: 13992052795 E-mail: wangxiaoping323@126.com
网络出版时间：2012-01-13 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20120113.1029.003.html
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 2 期 2012 年 2 月

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DV215CD 型双量程电子分析天平（瑞士梅特勒-托
利多国际股份有限公司）。
丹酚酸 B 对照品（批号 111562-200807）、肉
桂酸对照品（批号 110786-200503）均由中国药品
生物制品检定所提供；迷迭香酸对照品（批号
090327，质量分数 98.5%）购自上海融禾医药科技
发展有限公司；紫草酸对照品（批号 070304，质
量分数 99.5%）购自上海友思生物技术有限公司；
丹红注射液（批号 20101120）由山东菏泽步长制
药有限公司提供；乙腈（色谱纯）美国迪马公司；
其他试剂均为分析纯。
雄性 SD 大鼠（220～250 g），由北京大学医学
部实验动物部提供，使用许可证号：SYXK（京）
2002-0002，合格证号：SCXK（京）2002-0001。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取迷迭香酸、紫
草酸对照品各 1.0 mg，丹酚酸 B 对照品 2.0 mg，置
10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。
用甲醇稀释成系列质量浓度的对照品溶液（含丹酚
酸 B 分别为 0.7、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0、
200.0 μg/mL）。
2.1.2 内标溶液的制备 精密称取肉桂酸对照品
2.18 mg，置 50 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻
度，摇匀，即得。
2.2 检测条件
2.2.1 色谱条件 色谱柱为 Diamonsil（钻石）C18
柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.4%
甲酸水溶液，梯度洗脱：0～5 min，5%～12%乙腈；
5～10 min，12%～15%乙腈；10～15 min，15%～
20%乙腈；15～25 min，20%～23%乙腈；25～55
min，23%～30%乙腈；体积流量 1.0 mL/min，检测
波长 288 nm，进样量 20 μL，柱温 25 ℃。
2.2.2 质谱条件 EI 离子源，分别以正、负离子模
式检测，m/z：100～1 500，干燥气体积流量 12.0
L/min，干燥气温度 350 ℃，干燥气为氮气；氮气
压力 241.325 kPa；毛细管电压 3 500 V。
2.3 血浆样品的预处理
精密吸取大鼠血浆样品 200 μL，精密加入内标
溶液 50 μL，涡旋混合 1 min，再加入 20%盐酸溶液
50 μL，涡旋混合 2 min，加入醋酸乙酯 2 mL，涡旋
混合 2 min。分取上层有机相，常温下氮气吹干，残
渣精密加入甲醇 150 μL，涡旋 1 min，0.22 μm 微孔
滤膜滤过，即得。
2.4 专属性考察
精密取大鼠空白血浆 200 μL、含药血浆 200
μL，分别精密加入内标溶液 50 μL，涡旋混匀 1 min，
其余按照“血浆样品预处理”项下方法操作，按
“2.2”项下检测条件测定，结果见图 1。








1-迷迭香酸 2-紫草酸 3-丹酚酸 B IS-内标物
A-空白血浆样品 B-空白血浆＋对照品（迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸
B）＋内标（肉桂酸） C-静脉注射丹红注射液 1 min 的血浆样品＋内标
1-rosmarinic acid 2-lithospermic acid 3-salvianolic acid B IS-internal
standard A-blank rat plasma sample B-blank rat plasma sample spiked
with mixed reference substances and IS C-rat plasma sample of 1 min
after iv DHI and IS

图 1 3 种酚酸类成分和内标物在大鼠血浆中的总离子流图
Fig. 1 Total ion chromatograms of three kinds
of phenolic acids and IS in rat plasma
after iv administration of DHI

2.5 线性关系考察
精密取大鼠空白血浆 200 μL，分别精密加入系
列质量浓度的混合对照品溶液 200 μL，内标溶液 50
μL，涡旋混匀 1 min，其余按照“血浆样品预处理”
项下方法操作，得到系列质量浓度的血浆对照品溶
液，每个质量浓度平行制备 3 份。将制备好的血浆
对照品溶液在上述色谱条件下分析测定，每个样品
进样 2 次，记录各对照品与内标峰面积比，以峰面
积比（Y）为纵坐标，对照品质量浓度（X）为横坐
标进行线性回归，得回归方程及相关系数（r），要
求生物样品的 r 大于 0.99。所得回归方程分别为：
迷迭香酸 Y＝0.017 X＋0.033 3，r2＝0.996 5，迷迭
香酸血浆质量浓度在 0.45～100 μg/mL 线性关系良
好；紫草酸 Y＝0.015 6 X＋0.044 4，r2＝0.995 9，紫
草酸血浆质量浓度在 0.45～100 μg/mL 线性关系良
好；丹酚酸 B Y＝0.018 6 X＋0.048 4，r2＝0.998 9，
1
2
3
IS
1
2
3
IS
A
B
C
0 10 20 30 40 50
t / min
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丹酚酸B血浆质量浓度在 0.7～200 μg/mL线性关系
良好。
2.6 最低定量限试验
在空白血浆中精密加入一定量的混合对照品溶
液适量，混匀，逐步稀释，以对照品峰信号与噪音
信号比 10∶1 为最低定量质量浓度，重复测定 3 次。
迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸 B 最低定量限分别为
0.45、0.45、0.70 μg/mL。
2.7 稳定性试验
精密取大鼠空白血浆 200 μL，分别精密加入
高、中、低（含丹酚酸 B 200.0、8.0、2.0 μg/mL）3
个质量浓度的混合对照品溶液 200 μL，内标溶液 50
μL，涡旋混匀 1 min，其余按照“血浆样品预处理”
项下方法操作，得到高、中、低质量浓度的血浆质
控样品，每个质量浓度平行制备 5 份样品。将高、
中、低 3 个质量浓度的血浆样品于常温下保存 12 h，
4 ℃下保存 24 h，每 4 h 测定 1 次，迷迭香酸高、
中、低质量浓度的 RSD 分别为 5.6%、3.2%、2.5%；
紫草酸高、中、低质量浓度的 RSD 分别为 5.2%、
3.0%、4.8%；丹酚酸 B 高、中、低质量浓度的 RSD
分别为 9.9%、6.8%、3.5%；在冻融-冷冻循环试验
中，将质控样品置于 4 ℃下 24 h，取出后于室温下
自然融解后，再置于 4 ℃下 24 h，如此冻融-冷冻
循环至少 2 次后测定，迷迭香酸高、中、低质量浓
度的 RSD 分别为 8.1%、7.8%、4.7%；紫草酸高、
中、低质量浓度的 RSD 分别为 7.7%、6.2%、2.9%；
丹酚酸 B 高、中、低质量浓度的 RSD 分别为 7.4%、
6.8%、3.6%；长期稳定性试验中，将质控样品于−60
℃保存 15 d 后进行测定，迷迭香酸高、中、低质量
浓度的 RSD 分别为 9.4%、5.4%、4.8%；紫草酸高、
中、低质量浓度的 RSD 分别为 8.2%、7.9%、4.7%；
丹酚酸 B 高、中、低质量浓度的 RSD 分别为 8.6%、
3.5%、2.5%。说明样品可以在常温下保存 12 h、4 ℃
下冻融-冷冻循环至少 2 次、−60 ℃保存 15 d，药物
质量浓度无明显变化，基本稳定。
2.8 重现性试验
取空白血浆 200 μL，按“2.3”项下方法配制质
控样品相当于迷迭香酸、紫草酸质量浓度为 4.0、
10.0、100.0 μg/mL 的血浆样品，相当于丹酚酸 B 质
量浓度为 2.0、8.0、200.0 μg/mL 的血浆样品各 6 份，
依法测定，迷迭香酸高、中、低质量浓度的 RSD 分
别为 3.43%、2.86%、4.14%，紫草酸高、中、低质
量浓度的 RSD 分别为 3.85%、2.45%、4.04%，丹酚
酸 B 高、中、低质量浓度的 RSD 分别为 2.81%、
2.05%、4.62%。
2.9 回收率试验
按“2.7”项下的方法制备高、中、低质量浓度
的血浆质控样品，照“2.2”项下色谱条件分析，连
续进样 6 次，记录峰面积，与未经处理的相应质量
浓度的对照品溶液的峰面积比较，计算提取回收率
（表 1）。同法测定并计算内标提取回收率，其 RSD
均小于 10%。

表 1 3 种酚酸类成分和内标物的回收率
Table 1 Recoveries for three kinds of phenolic acids and IS
分析成分
加入量 /
(μg·mL−1)
回收率 / % 标准偏差 / % RSD / %
4.0 85.0 4.25 5.00
10.0 90.0 3.25 3.61
迷迭香酸
100.0 101.4 2.13 2.10
4.0 84.4 7.78 9.22
10.0 93.9 1.97 2.10
紫草酸
100.0 93.1 3.63 3.90
2.0 80.0 3.92 4.90
8.0 93.0 5.21 5.60
丹酚酸 B
200.0 97.4 3.31 5.30
肉桂酸 43.6 98.4 9.74 9.90

2.10 精密度试验
按“2.7”项下的方法制备高、中、低质量浓度
的血浆质控样品。按照“2.2”项下色谱条件分析，
每个浓度连续进样 6 次，测定日内精密度。重复操
作，连续测定 3 d 并随行回归曲线，测定日间精密
度，RSD 均小于 5%，结果见表 2。
2.11 血浆中 3 种酚酸类成分的测定
雄性 SD 大鼠 6 只，正常饲养 3 d，试验前禁食
24 h，自由饮水。iv 给予丹红注射液（10 mL/kg）。
分别于注射后 1、5、10、15、20、30、45、60、90
min 取血，采用眼眶静脉丛取血 0.5 mL，血样用肝
素浸润过的离心管收集。所取血液在冰浴中放置 30
min 后，6 000 r/min，0 ℃离心 10 min，分离血浆，
按“2.3”项下方法处理，在“2.2”项的色谱条件下
进样 20 μL，记录峰面积，代入回归方程，计算血
浆中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸 B 的量（表 3）。
3 讨论
3.1 色谱条件的优化
考察了多种不同的流动相组成[7-10]，结果发现，
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表 2 3 种酚酸类成分日内、日间精密度
Table 2 Intra- and inter-day precision data for three kinds of phenolic acids
日内（n＝6） 日间（n＝3） 分析成分 加入量 / (μg·mL−1)
实测值 / (μg·mL−1) 回收率 / % RSD / % 实测值 / (μg·mL−1) 回收率 / % RSD / %
迷迭香酸 4.0
10.0
100.0
3.40±0.23
9.00±0.36
101.40±5.36
85.0
90.0
101.4
6.76
4.00
5.29
3.20±0.25
9.34±0.42
100.30±4.63
80.0
93.4
100.3
7.81
4.50
4.62
紫草酸 4.0
10.0
100.0
3.38±0.18
9.39±0.27
93.10±3.63
84.4
93.9
93.1
5.33
2.88
3.90
4.09±0.33
9.26±0.53
100.10±4.02
102.2
92.6
100.1
8.07
8.72
4.02
丹酚酸 B 2.0
8.0
200.0
1.60±0.04
7.44±0.19
194.80±6.73
80.0
93.0
97.4
2.50
2.55
3.45
1.67±0.05
7.27±0.31
191.40±6.50
83.5
90.8
95.7
2.99
4.26
3.40

表 3 样品测定结果
Table 3 Determination of samples
质量浓度 / (μg·mL−1)
t / min
迷迭香酸 紫草酸 丹酚酸 B
1 80.94±8.10 70.08±5.13 120.05±4.10
5 79.05±4.51 51.02±3.23 104.22±1.05
10 63.32±6.70 48.25±3.55 75.09±8.10
15 53.73±2.27 31.05±1.25 40.09±4.51
20 42.02±1.86 20.25±1.34 20.65±2.81
30 22.92±0.92 15.77±1.52 10.62±1.09
45 11.12±1.51 8.31±1.15 5.62±0.36
60 7.08±0.46 5.99±0.49 3.99±0.09
90 4.08±0.15 4.17±0.18 2.00±0.11

“2.2”项下的色谱条件能够使待测成分和内标得到
理想的分离。
3.2 内标的选择
考察了不同化合物如肉桂酸、甲基肉桂酸、3, 4-
二羟基苯乙酸等，结果表明肉桂酸与其他待测成分
有很好的分离度，确定肉桂酸为内标。
3.3 血浆样品处理方法优化
在预试验中对血浆样品的处理方法进行了优
化，比较了沉淀法、萃取法、固相萃取（SPE）法[11]
对 3 种酚酸类成分和内标物的提取效果。结果表明，
采用沉淀蛋白法，3 种酚酸类成分和内标的提取回
收率较低；SPE 法在生物样品的前处理过程中被广
泛使用，但在本实验中，要达到 75%以上的回收率
需要洗脱剂的体积较大，耗费时间和费用，因此没
有选择；采用液-液萃取法，考察了不同的萃取试剂，
结果表明，将血浆样品酸化后，以醋酸乙酯作为萃
取试剂，3 种酚酸类成分和内标均具有较高的提取
回收率且较少引入杂质，样品处理快速，省时省力，
故最终确定液-液萃取法为血浆样品的处理方法。
参考文献
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