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HPLC fingerprint analysis on Wei Medicine Ziziphora tenuior and Ziziphora clinopodioides

维药小新塔花和芳香新塔花的HPLC指纹图谱研究



全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 12 期 2013 年 6 月

·1673·
维药小新塔花和芳香新塔花的 HPLC 指纹图谱研究
孟庆艳 1,丁 玲 2,刘 圆 2*
1. 新疆生产建设兵团 塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室,新疆 阿拉尔 843300
2. 西南民族大学 民族医药研究院,四川 成都 610041
摘 要:目的 建立小新塔花和芳香新塔花的 HPLC 指纹图谱分析方法,并同时测定 8 批小新塔花和 22 批芳香新塔花中金丝
桃苷、槲皮素、胡薄荷酮的量。方法 采用 Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以甲醇-0.08%甲酸水溶液进行梯
度洗脱,同时测定了小新塔花和芳香新塔花中金丝桃苷、槲皮素、胡薄荷酮的量,建立了不同产地 8 批小新塔花和 22 批芳香
新塔花的指纹图谱。结果 根据主成分分析、聚类分析,将 30 批药材分为 2 类,建立了 2 种新塔花的 HPLC 指纹图谱。不同
产地的 2 种新塔花中金丝桃苷、槲皮素和胡薄荷酮等成分的量存在较大差异;芳香新塔花不含槲皮素,而小新塔花中含有;芳
香新塔花中的金丝桃苷和胡薄荷酮量高于小新塔花;小新塔花中金丝桃苷量为 49.72~204.33 μg/g,槲皮素量为 161.06~213.22
μg/g,胡薄荷酮量为 36.19~93.29 μg/g;芳香新塔花中金丝桃苷量为 174.15~802.24 μg/g,胡薄荷酮量为 77.43~353.45 μg/g。
结论 不同品种的新塔花指纹图谱存在一定的差异,可为新塔花药材的质量控制、品种鉴定及划分提供一定的参考依据。
关键词:小新塔花;芳香新塔花;指纹图谱;金丝桃苷;槲皮素;胡薄荷酮;主成分分析;聚类分析
中图分类号:R286.02 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2013)12 - 1673 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.12.029
HPLC fingerprint analysis on Wei Medicine Ziziphora tenuior and Ziziphora
clinopodioides
MENG Qing-yan1, DING Ling2, LIU Yuan2
1. Key Laboratory of Biological Resource Protection and Utilization of Tarim Basin, Production and Construction Corps of
Xinjiang, Alaer 843300, China
2. Ethnic Medicine Institute of South west University for Nationalities, Chengdu 610041, China
Abstract: Objective To establish HPLC fingerprint for the analysis on Ziziphora tenuior and Z. clinopodioides and the
determination of hyperin, rutine, and pulegone in eight batches of Z. tenuior and 22 batches of Z. clinopodioides synchronously.
Methods The HPLC method was used with Kromasil C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm), and a mixture of methanol-0.08 %
HCOOH was used as mobile phase with gradient elution. The HPLC fingerprint for eight batches of Z. tenuior and 22 batches of Z.
clinopodioides was established. Results The HPLC fingerprints of the two species were obviously different, so two modes were
established for two species, respectively. The eight batches of Z. tenuior and 22 batches of Z. clinopodioides were classified into two
groups based on the result of principal component, hierarchical cluster, and similarity analyses. Hyperin and pulegone were the
common compositions; quercetin (161.06—213.22 μg/g) was founded in Z. tenuior, but not in Z. clinopodioides; the contents of
hyperin (174.15—802.24 μg/g), pulegone (77.43—353.45 μg/g) of Z. clinopodioides were higher than those of Z. tenuior (49.72—
204.33 and 36.19—93.29 μg/g). Conclusion Z. tenuior and Z. clinopodioides have the different fingerprint, which could provide the
evidence for their quality control, species identification, and classification.
Key words: Ziziphora tenuior Linn.; Ziziphora clinopodioides Lam.; fingerprint; hyperin; quercetin; pulegone; principal component
analysis; hierarchical cluster analysis

收稿日期:2012-09-15
基金项目:国家科技支撑计划项目(2012BAI27B07);国家科技部“重大新药创制”科技重大专项(2011ZX09307-002-01);塔里木盆地生物
资源保护利用重点实验室开放课题项目(BRYB1005);四川省科技支撑计划(2011SZ0233);中央高校基本科研业务费专项资金项
目优秀科研团队及重大孵化项目(11NZYTH02);四川省杰出青年学术技术带头人后续计划(2011JQ0051)
作者简介:孟庆艳(1982—),女,吉林磐石人,现为新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室助理研究员。
E-mail: hongyan_meng@sina.com
*通信作者 刘 圆 E-mail: 499769896@qq.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 12 期 2013 年 6 月

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小新塔花 Ziziphora tenuior Linn. 和芳香新塔
花 Z. clinopodioides Lam. 均为唇形科(Labiatate)
新塔花属 Ziziphora Linn. 植物,分布于中亚及蒙古,
在我国仅分布于新疆[1]。此 2 种新塔花皆为新疆民
间中草药,也是新疆地区民族常用药物,维医用于
治疗虚劳咳嗽、水肿、肋下疼痛及慢性气管炎等疾
病[2]。小新塔花为一年生草本,其精油中含有大量
的胡薄荷酮,具有抗炎作用[3],在伊朗常作为调料
使用或用于观赏[4]。芳香新塔花为多年生半灌木,具
有薄荷香味,是提炼芳香油很有前景的香料作物[5]。
现代药理研究表明芳香新塔花的挥发油具有抗菌
和抗氧化的作用[6]。小新塔花和芳香新塔花为同属
的 2 种植物,具有类似的功效和药效,原植物和药材
性状特征均有差异。本实验首次采用 HPLC 指纹图谱
方法对来自不同产地的小新塔花和芳香新塔花进行
鉴定,以 8 批小新塔花和 22 批芳香新塔花分别生成
对照指纹图谱,并测定各批药材中金丝桃苷、槲皮素、
胡薄荷酮的量。方法重现性和精密度良好,为新塔花
药材种属的鉴别和质量控制提供了科学依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Waters 2695 高效液相色谱仪;Waters 2996 检
测器;Empower Pro 色谱工作站;KQ5200E 型超
声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Mettler
AE240 型电子分析天平[梅特勒-托利仪器(上海)
有限公司]。
1.2 试药
小新塔花药材由塔里木盆地生物资源保护利用
重点实验室孟庆艳于 2010 年 7 月采集并鉴定,为了
样品更具有代表性,每个产地相隔 1 公里采 2 批样
品,来源见表 1 。金丝桃苷对照品(批号
111521-200303)、槲皮素对照品(批号 100081-200907)、
表 1 小新塔花和芳香新塔花样品来源
Table 1 Sources of Z. tenuior and Z. clinopodioides samples
编号 名 称 产 地 编号 名 称 产 地
S1 小新塔花 伊犁州昭苏格登山 S16 芳香新塔花 阿尔泰
S2 小新塔花 伊犁州昭苏格登山 S17 芳香新塔花 伊犁州新源南山
S3 小新塔花 博乐塞里木湖畔 S18 芳香新塔花 伊犁州新源南山
S4 小新塔花 博乐塞里木湖畔 S19 芳香新塔花 伊犁州昭苏牧马场
S5 小新塔花 伊犁州牧马场 S20 芳香新塔花 伊犁州昭苏牧马场
S6 小新塔花 伊犁州牧马场 S21 芳香新塔花 昌吉州木垒县博斯坦
S7 小新塔花 伊犁州巩留野核桃沟 S22 芳香新塔花 昌吉州木垒县博斯坦
S8 小新塔花 伊犁州巩留野核桃沟 S23 芳香新塔花 伊犁州霍城果子沟
S9 芳香新塔花 塔城 166 团 S24 芳香新塔花 伊犁州霍城果子沟
S10 芳香新塔花 塔城 166 团 S25 芳香新塔花 昌吉州木垒县龙王庙水库
S11 芳香新塔花 伊犁州巩留野核桃沟 S26 芳香新塔花 昌吉州木垒县龙王庙水库
S12 芳香新塔花 伊犁州巩留野核桃沟 S27 芳香新塔花 昌吉州木垒县水磨沟
S13 芳香新塔花 博乐塞里木湖畔 S28 芳香新塔花 昌吉州木垒县水磨沟
S14 芳香新塔花 博乐塞里木湖畔 S29 芳香新塔花 伊犁州昭苏格登山
S15 芳香新塔花 阿尔泰 S30 芳香新塔花 伊犁州昭苏格登山

胡薄荷酮对照品(批号 111706-201004)均由中国
药品生物制品检定所提供。甲醇、乙腈为色谱醇,
水为二次蒸馏水;其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为 Kromasil C18 柱(250 mm×4.6 mm,
5 μm),检测波长 254 nm,柱温 35 ℃,体积流量 1
mL/min,进样量 15 μL,流动相为甲醇(A)-0.08%
甲酸水溶液(B),洗脱程序:0~20 min,10% A;
20~28 min,32% A;28~30 min,33% A;30~50
min,41% A;50~55 min,52% A;55~65 min,
53% A;60~90 min,100% A。所有组分在 90 min
内检测完成,色谱图见图 1。
2.2 溶液制备
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取金丝桃苷、槲
皮素、胡薄荷酮对照品适量,置 10 mL 量瓶中,用
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 12 期 2013 年 6 月

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8-金丝桃苷 12-槲皮素 15-胡薄荷酮
8-hyperin 12-quercetin 15-pulegone
图 1 芳香新塔花(A)、小新塔花 (B) 和混合对照品
(C) HPLC 图谱对比
Fig. 1 Comparison on HPLC chromatograms of Z.
clinopodioides (A), Z. tenuior (B), and mixed
reference substances (C)
甲醇稀释至刻度,摇匀,制成含金丝桃苷 150
μg/mL、槲皮素 150 μg/mL、胡薄荷酮 214 μg/mL 的
混合对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 取新塔花药材粉末(过
3 号筛)约 0.8 g,精密称定,置 50 mL 锥形瓶中,
精密加入甲醇 25 mL 称定质量,超声 45 min,冷却
至室温,补足减失的质量,滤过,至于 25 mL 量瓶
中,过 0.45 μm 微孔滤膜,即得。
2.3 指纹图谱的方法学考察
2.3.1 精密度试验 取 S25 药材粉末 0.8 g,按“2.2.2”
项下方法制备供试品溶液,按照“2.1”项下色谱条件,
重复进样 6 次,记录色谱图。利用中药色谱指纹图谱
相似度评价系统 A 版软件计算相似度,结果均大于
0.9;以胡薄荷酮为参照峰,计算各主要色谱峰相对保
留时间 RSD 小于 0.15%,相对峰面积的 RSD 小于
2.71%,符合指纹图谱的要求。
2.3.2 重复性试验 取 S25 药材粉末 6 份,按
“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按照“2.1”项
下色谱条件,进样分析,记录色谱图,相似度计算
结果均大于 0.9;各主要色谱峰相对保留时间 RSD
均小于 0.37%,相对峰面积 RSD 小于 2.89%,表明
该方法重复性良好,符合指纹图谱要求。
2.3.3 稳定性试验 取 S25 供试品溶液,按照“2.1”
项下色谱条件,分别在 0、4、8、12、24 h 进样,
检测指纹图谱,相似度计算结果均大于 0.9;各主要
色谱峰相对保留时间 RSD 小于 0.26%,相对峰面积
RSD 小于 2.43%,表明供试品溶液在 24 h 内稳定。
2.4 化学模式识别
2.4.1 主成分分析[7-8] 30 批样品的色谱数据,各
色谱峰面积百分比作为数据的信息,每一个数据为
一个数据向量生成样本数据,30 个样本数据组成新
塔花样本指纹信息数据矩阵。以 SPSS 17.0 数据统
计系统,对数据矩阵进行主成分分析(PCA)后,
进行投影得到所有样品的 PCA 平面图,见图 2,样
品间内在的相互关系通过投影图表现出来,进而实
现样品间的分类。从图中可以看出新塔花色谱数据
可以将新塔花分为 2 大类。

图 2 样品主成分得分图
Fig. 2 Principal component analysis on samples
2.4.2 聚类分析[9-12] 采用 DPS 2000 数据统计软
件,将 30 个样品的主成分数据,选用欧式距离法,
以最短距离作为测度进行聚类,聚类结果见图 3。
从树状图中可以看到,30 个样品大体聚为 2 类,样
品 S1~S8 为一类,共 8 批;样品 S9~S30 为第二
类,一共 22 批。与主成分分析结果基本一致。
2.5 指纹图谱的建立[13-15]
聚类分析将 30 批药材分为 2 类,第 1 类为小新
塔花药材,第 2 类为芳香新塔花药材,分别建立指
纹图谱。
2.5.1 小新塔花药材 HPLC 指纹图谱的建立 取
S1~S8 药材粉末 0.8 g,按“2.2.2”项下方法制备供
试品溶液,按照“2.1”项下色谱条件,分别进样,进
行 HPLC 分析,得到 8 批小新塔花药材的指纹图谱及
16 个共有峰,见图 4,并生成对照图谱(R),见图 5;
计算其与对照指纹图谱比较的相似度,结果见表 2。





0 13.04 26.09 39.13 52.18 65.22 78.27 91.31
0 13.04 26.09 39.13 52.18 65.22 78.27 91.31
0 13.04 26.09 39.13 52.18 65.22 78.27 91.31
t / min
A
B
C
8
12
15
8
12
15
8
12 15

−1.0 −0.5 0.0 0.5 1.0
S8
S7
S6
S5
S2
S1
S4 S3S18
S17 S12 S11
S14 S9
S10
S27S28
S21 S22
S13
成分 1
1.0
0.5
0.0
−0.5
−1.0


2
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图 3 小新塔花和芳香新塔花样品主成分系统聚类分析图
Fig. 3 Hierarchical cluster analysis on principal components
in Z. tenuior and Z. clinopodioides

8-金丝桃苷 12-槲皮素 15-胡薄荷酮
8-hyperin 12-quercetin 15-pulegone
图 4 小新塔花指纹图谱及共有峰标识
Fig. 4 Fingerprint of Z. tenuior and assignment
of common peaks

图 5 8 批小新塔花指纹图谱及生成的共有模式
Fig. 5 Fingerprint of eight batches of Z. tenuior
and common mode
表 2 不同批次小新塔花药材与共有模式比较的相似度
Table 2 Similarities between various batches
of Z. tenuior and common mode
批号 相似度 批号 相似度
S1 0.960 S5 0.986
S2 0.984 S6 0.976
S3 0.957 S7 0.978
S4 0.982 S8 0.971
由表 2 可以看出,不同产地的小新塔花相似度
均在 0.9 以上,批间差异较小,说明不同产地的小
新塔花之间化学成分及成分量差别较小。
2.5.2 芳香新塔花药材 HPLC 指纹图谱的建立 取
不同来源的芳香新塔花药材(S9~S30 号样品),按
照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按照“2.1”
项下色谱条件,分别进样,进行 HPLC 分析,得到
22 批芳香新塔花药材的指纹图谱及 15 个共有峰,
见图 6,并生成对照图谱(R),见图 7;计算其与
对照指纹图谱比较的相似度,结果见表 3。

8-金丝桃苷 14-胡薄荷酮
8-hyperin 14-pulegone
图 6 芳香新塔花指纹图谱及共有峰标识
Fig. 6 Fingerprint of Z. clinopodioides
and assignment of common peaks
由表 3 可知,除 S13、S14、S17 和 S18 外,各
不同产地的芳香新塔花相似度均在 0.9 以上,说明
芳香新塔花药材存在物种的特性,由于产地、光照、
水分、土壤等因素不同,芳香新塔花中的化学成分
及成分的量发生了变化。
2.6 新塔花药材中金丝桃苷、槲皮素、胡薄荷酮的
测定[16-19]
2.6.1 线性关系考察 分别精密量取金丝桃苷对照
品溶液(0.026 mg/mL)0.4、2.0、4.0、6.0、8.0 mL
定容到10 mL量瓶中;分别取槲皮素(0.02 mg/mL)
对照品溶液 2.0、3.0 mL定容至10 mL量瓶中,分别取
5.0、6.0、7.0 mL定容于20 mL量瓶中;分别精密量取
胡薄荷酮对照品溶液(0.171 mg/mL)25、100、150、

S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S19
S20
S23
S24
S11
S12
S25
S26
S27
S28
S29
S30
S13
S14
S15
S16
S21
S22
S17
S18
0 503412 1006823 1510234 2013464 2517058

0 13.04 26.09 39.13 52.18 65.22 78.27 91.31
t / min
1
2 3 4
5
6
7
8
9
10
11 12
13
14 15 16

0 13.04 26.09 39.13 52.18 65.22 78.27 91.31
t / min
R
S7
S6
S5
S2
S4
S3
S1
S8

0 13.04 26.09 39.13 52.18 65.22 78.27 91.31
t / min
1
2 34 5 6
7
8 9
10
12 13 1415
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图 7 22 批芳香新塔花指纹图谱及生成的共有模式
Fig. 7 Fingerprint of 22 batches of Z. clinopodioides
and common mode
表 3 不同批次芳香新塔花与共有模式比较的相似度
Table 3 Similarities between various batches of Z.
clinopodioides and common mode
批号 相似度 批号 相似度
S9 0.985 S20 0.980
S10 0.978 S21 0.914
S11 0.971 S22 0.908
S12 0.972 S23 0.983
S13 0.731 S24 0.986
S14 0.734 S25 0.984
S15 0.946 S26 0.983
S16 0.943 S27 0.960
S17 0.835 S28 0.949
S18 0.831 S29 0.988
S19 0.979 S30 0.988

350、500、700 μL 定容到 10 mL 量瓶中。按照“2.1”
项下色谱条件测定峰面积,以进样质量浓度为横坐
标(X),峰面积为纵坐标(Y),进行线性回归,得
金丝桃苷、槲皮素、胡薄荷酮的标准曲线方程分别
为金丝桃苷 Y=43 002 X+172 568,r=0.999 9,在
1.04~26.00 μg/mL 线性关系良好;槲皮素 Y=58 822
X-49 768,r=0.999 7,在 4.0~7.0 μg/mL 线性关
系良好;胡薄荷酮 Y=67 277 X-5 258.2,r=0.999 7,
在 0.427 5~11.97 μg/mL 线性关系良好。
2.6.2 样品的测定 取不同产地的小新塔花
(S1~S8)与芳香新塔花(S9~S30),按照“2.2.2”
项下方法制备供试品溶液,按照“2.1”项下色谱
条件,分别进样,记录峰面积并计算质量分数。结
果见图 8。由于品种和产地的不同,新塔花中金丝
桃苷、槲皮素和胡薄荷酮的有无和量的高低存在较
大差异;小新塔花中含有槲皮素,而芳香新塔花中
无;金丝桃苷、胡薄荷酮为芳香新塔花和小新塔花
的共有成分,芳香新塔花中的金丝桃苷和胡薄荷酮
量高于小新塔花;本实验结果为小新塔花和芳香新
塔花的药材定性鉴别、新药开发和临床应用提供有
价值的参考。


图 8 小新塔花和芳香新塔花中金丝桃苷、槲皮素、胡薄荷
酮的测定结果
Fig. 8 Determination of hyperin, quercetin, and pulegone
in Z. tenuior and Z. clinopodioides
3 讨论
3.1 药材提取方法的选择
分别对提取溶剂(醋酸乙酯、氯仿、水、50%
甲醇、甲醇)进行考察,发现用甲醇所得到的色谱
峰总数较多,且峰面积较大;对提取方式(超声、
加热回流)进行考察,2 种提取方式效率相当,故
选择操作简便的超声提取法;对提取时间(30、45、
60 min)进行考察,发现超声提取 45 min 已将药材
中主要成分提取完全。
3.2 流动相系统的选择
考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.08%甲酸水
溶液 3 种流动相系统,结果表明用甲醇-0.08%甲酸
水溶液作为流动相进行梯度洗脱时,出峰较多,各
色谱峰分离较好,且基线平稳。样品 120 min 图谱
显示 90 min 后无特征峰出现,故确定分析时间为
90 min。
0 13.04 26.09 39.13 52.18 65.22 78.27 91.31
R
S27
S20
S19
S18
S17
S16
S15
S14
S13
S12
S11
S10
S9
S24
S23
S22
S21
S30
S29
S26
S25
S28
t / min

金丝桃苷
胡薄荷酮
S1 S3 S5 S7 S9 S11 S13 S15 S17 S19 S21 S23 S25 S27 S29
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0




/


g−
1 )


槲皮素
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8
250
200
150
100
50
0质



/


g−
1 )

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3.3 检测波长的选择
使用二极管阵列检测器对样品进行 210~400
nm 的全波长扫描,并对各波长下的色谱图进行分
析比较。结果表明在 254 nm 下,各峰分离效果较
好,且出峰较多,特征峰明显,峰型较好,故确定
指纹图谱的测定波长为 254 nm。
3.4 检测有效成分的选择
金丝桃苷、胡薄荷酮、槲皮素为新塔花药材的
主要有效成分。实验结果表明,小新塔花中含有槲
皮素,而芳香新塔花中不含有;金丝桃苷、胡薄荷
酮为芳香新塔花和小新塔花的共有成分,芳香新塔
花中的金丝桃苷和胡薄荷酮量高于小新塔花;本实
验结果为小新塔花和芳香新塔花的药材定性鉴别、
新药开发和临床应用提供有价值的参考。本研究首
次测定新塔花中金丝桃苷的量,为新塔花属植物种
属的鉴别提供一定的实验依据。
3.5 指纹图谱的建立
原计划建立一个共有模式作为新塔花药材的质
量评价控制的依据,但实验过程中发现,小新塔花
和芳香新塔花药材内在成分上差别大,所以建立了
2 组指纹图谱,以便更好更全面地控制新塔花药材
的质量。
新塔花中含有多种化学成分,建立 HPLC 指纹
图谱的分析方法可以更全面地反映药材的整体特
征。本实验对芳香新塔花和小新塔花药材分别建立
指纹图谱可以更好地反应 2 个种的整体信息,通过
测定金丝桃苷、槲皮素和胡薄荷酮的量可以进一步
比较 2 种药材,以便对新塔花药材质量进行控制。
从整体上看,芳香新塔花中的金丝桃苷和胡薄荷酮
的量高于小新塔花,不同产地的新塔花药材中,化
学成分量存在较大差别。实验结果表明,同属不同
种药材和不同产地的同种药材之间存在差异,有必
要建立合理的研究方法对其进行鉴别和质量控制。
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