全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 10 期 2012 年 10 月

·1946·
Box-Behnken 效应面法优化多西他赛长循环脂质体处方
程 怡*，吴 琼，余秋强，赵菊香
广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006
摘 要：目的 优化多西他赛长循环脂质体（DLCL）处方。方法 采用薄膜蒸发法制备 DLCL，分别以卵磷脂（PC）与多
西他赛（DOC）质量比（X1）、PC 与胆固醇（Chol）质量比（X2）、DSPE-PEG 2000 与 PC 物质的量之比（X3）为考察对象，
包封率（Y1）、载药量（Y2）、综合指标 OD 值为评价指标，采用 Box-Behnken 效应面法筛选 DLCL 的最佳处方。结果 最优
处方为 X1＝0.616 2，X2＝1.0，X3＝−1.0；DLCL 的包封率为（94.71±1.75）%，载药量为（5.37±0.43）%，标准偏差均小
于 10%；平均粒径 139.6 nm，分布均匀，体外释放试验结果表明其具有明显的缓释效果。结论 采用 Box-Behnken 效应面
法优化 DLCL 处方是有效、可行的。
关键词：多西他赛；长循环脂质体；Box-Behnken；效应面法；体外释放
中图分类号：R283.6 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)10 - 1946 - 05
Formula optimization of Docetaxel long-circulation liposomes by Box-Behnken
design and response surface method
CHENG Yi, WU Qiong, YU Qiu-qiang, ZHAO Ju-xiang
School of Chinese Materica Medica, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China
Abstract: Objective To optimize the formula of Docetaxel (DOC) long-circulation liposomes (DLCL). Methods DLCL was
prepared by the membrane-hydration method. The effects of phosphatidylcholine (PC)-DOC (X1), PC-cholesterol (Chol) (X2), and the
amount of DSPE-PEG 2000 (X3) were observed. The encapsulation efficiency (Y1), drug loading amount (Y2), and the general
requirements (Y3) were evaluated and the formula was optimized by Box-Behnken design and response surface method. Results The
optimal formula was as following: X1＝0.616 2, X2＝1.0, and X3＝−1.0; The encapsulation efficiency was (94.71 ± 1.75)%, drug
loading amount was (5.37 ± 0.43)%. The standard deviations were all below 10%. The average particle size was 139.6 nm. Moreover,
in vitro release tests showed that the prepared DLCL had obvious sustained-release effects. Conclusion Using Box-Behnken design
and response surface method to prepare DLCL is effective and feasible.
Key words: Docetaxel (DOC); long-circulating liposomes; Box-Behnken design; response surface method; in vitro release

多西他赛（多西紫杉醇，Docetaxel，DOC）是
由浆果紫杉（Taxus baccata L.，European yew）针
叶提取物经结构修饰合成制备，为白色结晶粉末，
难溶于水，对卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌及其
他实体瘤等均有显著的抑制作用[1-2]。现上市的药物
有泰素帝（Taxotere），由法国罗纳普朗克乐安公司
开发，以注射剂为主，辅以粉针和胶囊剂，但注射
剂易引起严重的过敏反应且生物利用度低。因此研
发一种有良好溶解性能、不良反应低、生物利用度
高的新的载药系统一直是研究的热点。目前普通脂
质体、微乳、纳米粒等新剂型的开发研究已有相关
文献报道，但尚在实验阶段[3-4]，且各种给药系统都
或多或少存在缺陷，仍需继续研究。
长循环脂质体即普通脂质体经 PEG 修饰，以增
加脂质体的柔顺性和亲水性，有效阻止血浆中促吞
噬物质（如调理素、抗体、高密度脂蛋白等）的活
性，阻碍单核吞噬细胞系统（mononuclear-phagocyte
system，MPS）的吞噬作用，使得制剂的稳定性、血
浆中的稳定性等方面皆优于普通脂质体。Immordino
等[5]比较了普通脂质体和PEG化脂质体剂型的包封
率、稳定性、生物分布及药动学特征，得出以卵磷
脂/磷脂酰丝氨酸/二硬脂酰磷脂乙醇胺-聚乙二醇

收稿日期：2012-02-20
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30772790）
作者简介：吴 琼（1988—），女，硕士研究生，研究方向为药物载体及其新型给药系统。Tel: 15915769101 E-mail: cupid881221@126.com
*通讯作者 程 怡 Tel: (020)39358041 E-mail: vip.chengyi@gzhtcm.edu.cn
网络出版时间：2012-08-14 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20120814.1117.004.html
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 10 期 2012 年 10 月

·1947·
2000/胆固醇（PC/PG/DSPE-PEG 2000/Chol 9∶1∶
2∶0.2）制备的脂质体最有效。为显著提高 DOC 脂
质体的稳定性，延长其在体内的循环时间，本实验
采用薄膜蒸发法制备DOC长循环脂质体（Docetaxel
long-circulation liposomes，DLCL），Box-Behnken
效应面法（response surface methodology，RSM）进
行处方优化，力求得到质优的 DLCL[6]。
1 仪器与材料
Dionex 高效液相色谱仪（P680 型泵，PDA-100
型检测器，ASI-100 自动进样器，美国戴安公司），
JY96-II 超声波细胞粉碎机（宁波心之生物科技公
司），Zetasizer Nano 激光粒度分析仪（英国 Malvern
公司），90-1 型恒温磁力搅拌器（上海沪西分析仪
器有限司），ZRS-8G 智能溶出试验仪（天津市盛鑫
通达科技有限公司），Sartorius BS110S 电子天平（北
京赛多利斯天平有限公司），微孔滤膜（德国
Membrana 公司），MD34 透析袋（MW 0.8×104～
1.4×104，上海百赛生物技术有限公司）。
DOC 原料药（质量分数＞99%，北京诺瑞医药
技术有限公司），DOC 对照品（质量分数 98.0%，批
号 10066-201002，中国药品生物制品检定所），注
射用蛋黄卵磷脂（PC-98T，上海艾维特有限公司），
二氢胆固醇（Chol，质量分数＞96%，Acros 公司），
DSPE-PEG 2000（德国 Lipoid 公司），甲醇、乙腈
为色谱纯，其他试剂皆为国产分析纯。
2 方法与结果
2.1 DLCL 的制备
按处方量称取 DOC、PC、Chol、DSPE-PEG 2000
等辅料溶于适量无水氯仿中，真空旋转蒸发除去有
机溶剂，制得均匀磷脂膜，置真空干燥器内干燥过
夜。加入一定体积的 PBS 7.2 溶液真空 50 ℃下水
化 30 min，超声后过 0.45、0.22 μm 的微孔滤膜即
得 DLCL，于 0 ℃下保存。
2.2 定量测定方法学的建立
2.2.1 色谱条件 色谱柱为 Diamonsil C18(2) 柱
（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（55∶
45），检测波长 230 nm，体积流量 1.0 mL/min，进
样量 20 μL，柱温 35 ℃，理论塔板数以 DOC 色谱
峰计算大于 3 000，DOC 保留时间为 8.8 min。
2.2.2 方法的专属性 100 mg/L DOC 对照品溶液；
供试品溶液：取 DLCL 脂质体 0.5 mL 置 25 mL 量
瓶中，甲醇破乳并稀释至刻度，即得；空白对照液：
按“2.1”项方法制备缺 DOC 空白脂质体，取空白
脂质体 0.5 mL 置 25 mL 量瓶中，甲醇破乳并稀释
至刻度，即得。在上述色谱条件下，DOC 与辅料分
离度良好，峰形稳定，辅料及溶剂对 DOC 的测定
无干扰，见图 1。
2.2.3 线性关系考察 取 DOC 对照品适量，精密




*DOC

图 1 DOC (A)、DLCL 供试品溶液 (B) 和空白对照液 (C) 的 HPLC 色谱图
Fig. 1 HPLC chromatograms of DOC (A), DLCL (B), and blank control solution (C)

称定，加甲醇溶解并稀释成 1 mg/mL对照品储备液。
精密移取一定量的储备液，配制成 5、25、50、75、
100 mg/L 系列对照品溶液，按上述色谱条件进行测
定，记录峰面积。以质量浓度（C）为横坐标，峰
面积（A）为纵坐标进行线性回归，得回归方程 A＝
419 365 C－303 638，r＝0.999 5，结果表明 DOC 在
5～100 mg/L 与峰面积呈良好的线性关系。
2.2.4 回收率和精密度的测定 取 DOC 对照品储
备液 0.1、0.5、1 mL，分别加入 0.5 mL 空白脂质体，
甲醇定容破乳至 10 mL。重复 3 次，在 230 nm 处测
定峰面积，计算回收率，分别为 99.03%、97.82%、
98.59%，RSD 分别为 1.40%、0.91%、0.62%。
取 5、50、100 mg/L 的对照品溶液，于 1 d 内
重复进样 5 次，计算日内精密度，RSD 分别为
1.29%、1.74%、0.93%；连续 5 d 分别进样 5 次，计
算日间精密度，RSD 分别为 1.74%、1.45%、0.98%。
0 3 6 9 12 0 3 6 9 12 0 3 6 9 12
t / min
*
*
A B C
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 10 期 2012 年 10 月

·1948·
结果回收率和精密度均符合试验要求。
2.2.5 稳定性考察 取“2.2.2”项下 DLCL 供试品
溶液，分别在 2、4、6、12 h 注入液相色谱仪，记录
峰面积，结果 12 h 内峰面积值稳定，RSD 为 0.24%。
2.2.6 重复性考察 取同一批号的 DLCL 5 份，按
“2.2.2”项下配制供试品溶液，进样，液相色谱仪测
定，结果 DOC 质量浓度值稳定，RSD 为 1.13%。
2.3 包封率和载药量测定
采用透析法测定。精密移取 DLCL 1 mL 于透析
袋内，两端用透析夹夹紧后，置 150 mL 0.5%聚山
梨醇酯透析液中，0 ℃下磁力搅拌，透析 8 h 后，完
全转移透析袋内的溶液于 25 mL量瓶中，甲醇定容，
过 0.45 μm 微孔滤膜，进样，高效液相色谱仪测定
DOC 质量浓度为 C1；另取 DLCL 1 mL 置 25 mL 量
瓶中，甲醇破乳并稀释至刻度，过 0.45 μm 微孔滤
膜，进样，高效液相色谱仪测定 DOC 总质量浓度
为 C2；计算 DOC 包封率和载药量。
包封率＝C1 / C2
载药量＝mdrug / mlipid
mdrug为 DLCL 中 DOC 的质量，mlipid为 DLCL 处方的总质量
2.4 Box-Behnken 效应面法优化处方
采用 Box-Behnken 设计，在预试验的基础上选
择对 DLCL 性质影响较显著的 3 个因素，即卵磷脂
与 DOC 质量比（X1）、卵磷脂与胆固醇质量比（X2）
以及 DSPE-PEG 2000 与 PC 物质的量之比（X3），以
包封率（Y1）、载药量（Y2）为评价指标，建立模型，
优化 DLCL 处方。试验设计见表 1。
在多指标的优化试验中，每个指标优选的条件
可能会相互矛盾，因此引入综合指标 OD 值[7-8]可考
察各指标的综合效果，得到较优的结果。本试验中
Y1、Y2 都欲达到最大化的指标，因此需要采用 OD
值进行综合评价。计算出 Y1、Y2 两指标的 di 值后，
即可计算 OD 值。
di＝(Yi－Ymin) / (Ymax－Ymin)
OD＝(d1d2d3……dn)1/n
Yi 为实测值，Ymin和 Ymax 分别为各指标可以接受的最小值和
最大值
最小值的选择依据是试验结果中的较低值或满
足药典规定的最低要求；最大值的选择依据是当指
标值超过最大值时，产品质量无明显改善。因此，
当某个试验的指标≥Ymax 时，将 di 设为 1；反之，
当指标≤Ymin 时，di 则设为 0。根据试验目的和结果，
设定每个评价指标的最小值和最大值：Y1 80%～
表 1 Box-Behnken 设计表及效应值 (n＝3)
Table 1 Box-Behnken design and OD values (n＝3)
标准序 运行序 X1 X2 X3/% Y1/% Y2/% OD
8 1 10 (−1) 3 (−1) 4 (0) 87.44 2.82 0
15 2 20 (1) 3 (−1) 4 (0) 85.89 4.08 0.252
6 3 10 (−1) 5 (1) 4 (0) 91.59 3.05 0.076
10 4 20 (1) 5 (1) 4 (0) 88.91 4.06 0.307
4 5 10 (−1) 4 (0) 2 (−1) 76.39 5.14 0
12 6 20 (1) 4 (0) 2 (−1) 84.62 4.44 0.258
13 7 10 (−1) 4 (0) 6 (1) 98.19 2.92 0
1 8 20 (1) 4 (0) 6 (1) 79.46 3.11 0
5 9 15 (0) 3 (−1) 2 (−1) 77.36 3.18 0
9 10 15 (0) 5 (1) 2 (−1) 94.58 5.53 0.607
7 11 15 (0) 5 (1) 6 (1) 85.69 2.88 0
14 12 15 (0) 4 (−1) 4 (1) 91.36 3.13 0.122
2 13 15 (0) 4 (0) 4 (0) 92.62 3.17 0.146
3 14 15 (0) 4 (0) 4 (0) 92.48 3.09 0.106
11 15 15 (0) 4 (0) 4 (0) 91.86 3.21 0.158

100%，Y2 3%～8%。试验结果见表 1。
2.4.1 模型拟合 采用 Minitab 15 软件对各因素进
行拟合，根据各项指标 F 检验的结果，剔除 P＞0.1
项后，再进行二次拟合，得到简化模型。
Y1＝91.93－1.84 X1＋2.34 X2＋2.72 X3－3.17 X12－4.38
X32－6.74 X1X3－5.72 X2X3（R2＝0.954）
Y2＝3.35＋0.22 X1＋0.28 X2－0.78 X3＋0.43 X32－0.65
X2X3（R2＝0.804）
OD＝0.095＋0.093 X1＋0.077 X2－0.093 X3＋0.075 X22－
0.065 X1X3－0.182 X2X3（R2＝0.899）
2.4.2 方差和显著性检验 其中方程 OD 的 R2 为
0.899，方差分析结果显示回归（regression）、线性
（linear）、平方（square）、交互作用（interaction）的
P 值皆＜0.05，方程失拟（reaidual error）检验的 P
值＞0.05，说明该回归模型拟合情况良好。方程 Y1
和 Y2 的 R2 分别为 0.954 和 0.804，方差分析结果显
示回归、线性、平方、交互作用的 P 值皆＜0.1，方
程失拟检验的 P 值＜0.05 说明该回归模型拟合情况
不是很理想，不能准确分析预测包封率和载药量。
从表 2回归系数显著性检验结果可知，模型OD
除 X2X2 项不显著（P＞0.05）外，大多数项都很显
著（P＜0.05）；模型 Y1 各项都很显著（P＜0.05）；
模型 Y2 大多数项都不显著。综合考虑选用模型 OD
对 DLCL 处方进行分析和预测。
2.4.3 效应面优化和预测 应用 Mintab 15 软件绘
制较显著的 2 个因素对评价指标 OD 的三维曲面图
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 10 期 2012 年 10 月

·1949·
（另一自变量设为中心点值），见图 2，考察较显著
的 2 个因素对评价指标 OD 的影响。
2.4.4 优化工艺验证试验 根据 Box-Behnken 效应
面法试验设计结果，得到优化后的处方为 X1＝
0.616 2，X2＝1.0，X3＝−1.0。按最优处方制备 3 批
DLCL，测定其包封率和载药量，结果见表 3。
试验值与模型预测值对比，结果偏差绝对值均
小于 10%，说明模型 OD 可较好地描述因素与指标
之间的关系，能较好地预测分析 DLCL 的处方。
2.5 粒径的测定
将按优化处方制备的 3 批 DLCL 混悬液，分别
用水稀释到适当质量浓度，加入粒径分析仪的石英
测量池中，测其粒径大小及分布情况，结果见图 3。
粒径分布呈单峰正态，范围在 50～200 nm，平均粒

表 2 回归方程系数的显著性检验
Table 2 Significance test of coefficient in regression equation
Y1 Y2 OD 考察项
SE T P SE T P SE T P
常量 0.928 99.109 0.000 0.179 18.695 0.000 0.027 3.568 0.007
X1 0.683 −2.699 0.031 0.168 1.311 0.222 0.025 3.702 0.006
X2 0.683 3.426 0.011 0.168 1.720 0.119 0.025 3.078 0.015
X3 0.683 3.983 0.005 0.168 −4.655 0.001 0.025 −3.712 0.006
X1X1 1.002 −3.169 0.016 剔除 剔除
X2X2 剔除 剔除 0.037 2.050 0.075
X3X3 1.002 −4.374 0.003 0.246 1.779 0.109 剔除
X1X2 剔除 剔除 剔除
X1X3 0.965 −6.982 0.000 剔除 0.035 −1.823 0.106
X2X3 0.965 −5.928 0.001 0.237 −0.274 0.023 0.035 −5.151 0.001
SE-系数标准误；T-回归方程系数 t-检验的统计量；P-P 概率
SE-standard error of coefficient; T-statistic of t-test; P-P value




图 2 X1和 X3 对效应值 OD 的等高线图 (A)
和三维曲面图 (B)
Fig. 2 Contour (A) and three dimension surface chart (B)
of X1 and X3 against OD

表 3 优化处方的预测值和观察值 ( x ±s，n＝3)
Table 3 Predicted and observed values of optimized
formula ( x ±s，n＝3)
指 标 预测值 观察值 预测误差 / %
包封率 / % 94.71 95.24±1.75 0.56
载药量 / % 5.63 5.37±0.43 4.62
OD 值 0.62 0.63±1.65 1.61
预测误差＝(预测值－观察值)/预测值
Predicted error = (predicted value－observed value) / predicted value



图 3 DLCL 粒径分布图
Fig. 3 Particle size distribution of DLCL

径为 139.6 nm。
2.6 DLCL 体外释放度的测定
取 DOC 溶液、DOC 普通脂质体及 DLCL 各 2.0
mL（DOC 质量浓度相同），分别加入预处理好的透
析袋中，两端扎牢，绑于溶出仪的搅拌浆上，按照
《中国药典》2010 年版第三法测定释放度。释放条
件：pH 7.4 的 PBS 250 mL（脱气），（37±0.5）℃，
100 r/min。定时取样 2 mL，并及时补充等温的同体
积空白介质。微孔滤膜滤过后进样，高效液相色谱
仪测其累积释放量（Mn），进而计算累积释放度，结
果见图 4。DOC 普通脂质体及 DLCL 药物累积释放
X 3

1.0

0.5

0

−0.5

−1.0
0.3
0.2
0.1
0
O
D

−1.0 0 1.0
X1
−1.0 0
1.0X1
−1.0
0
1.0
X3
A B
1 10 100 1 000 10 000
粒径 / nm
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 10 期 2012 年 10 月

·1950·



图 4 累积释放曲线
Fig. 4 Cumulative release curves

度（Q）对时间（t）进行模型拟合，结果符合 Higuchi
方程，分别为 Q＝−0.159＋0.186 t1/2（r＝0.944 0）和
Q＝−0.118＋0.134 t1/2（r＝0.956 7）。
Mn＝cnV0＋
1
1
n
i
−
=
∑ cn－1V
V0 为释放介质体积（mL），cn 为第 n 次取样时的质量浓度
（mg/mL），V 为取样体积（mL）
3 讨论
Box-Behnken 效应面法是近年来国外药学工作
者常用的试验设计方法，适用于多因素多水平试验
设计，解决了正交设计、均匀设计试验精度不够，
无法精确得到最佳点，不能灵敏地考察各因素的交
互作用等缺点，相比于中心复合设计法试验次数少，
节约成本。
本实验采用 Box-Behnken 效应面法优化 DLCL
的处方，构建了 3 个模型，其中模型 OD 拟合情况
良好。研究结果表明，影响脂质体质量的主要因素
是卵磷脂与 DOC 质量比和 DSPE-PEG 2000 与 PC
物质的量之比，但卵磷脂与 DOC 质量比与包封率
成负相关、与 OD 值成正相关；DSPE-PEG 2000 与
PC 物质的量之比与包封率成正相关、与 OD 值成负
相关，评价指标 Y1和 OD 出现了相互矛盾的情况，
且模型 Y1 方程失拟的 P 值＜0.05，方程失拟，所以
选择 OD 值为最重要指标，其值越大越好，得到最
佳优化处方。经验证优化处方的包封率、载药量的
预测值与试验值吻合情况良好，基本达到脂质体设
计的指标[9-10]。
通过激光粒度分析仪测定优化的 3 批 DLCL 的
粒径大小及分布情况，结果平均粒径为 139.6 nm，
分布均匀，符合药典规定的粒径要求。
体外释放度试验表明，DOC 普通脂质体和
DLCL 体外释药过程相似，有明显的缓释效果，相
比于 DOC 溶液在前 7 h 已经释放 95%左右的药物，
DLCL 的释放量仅为 25%左右，DOC 普通脂质体释
放量为 40%左右。DLCL 与普通脂质体相比，DSPE-
PEG 2000 修饰可降低脂质体中药物的释放速率，单
位时间内DLCL的累积释放量和 24 h总释药量均明
显低于普通脂质体，此外 2 种脂质体在前 0.5 h 释放
速率较快，与 DOC 溶液相似，可能是未包封进脂
质体内的游离药物所致。
参考文献
[1] 王子平, 孙 燕, 张湘茹, 等. 多西他赛治疗晚期乳腺
癌的临床研究 [J]. 中华肿瘤杂志 , 2006, 28(6):
468-470.
[2] 郑 颖, 刘建华, 杜 敏, 等. 多西他赛治疗非小细胞
肺癌患者过敏反应的护理 [J]. 护理学报, 2005, 13(8):
62-64.
[3] 张翠霞, 王东凯, 张文涛, 等. 多西紫杉醇脂质体的制
备及其性质考察 [J]. 中国新药杂志 , 2007, 16(10):
780-783.
[4] 张晓燕, 平其能. 多西紫杉醇白蛋白纳米粒的制备及
体外评价 [J]. 药学进展, 2008, 32(5): 223-226.
[5] Immordino M L, Brusa P, Arpicco S, et al. Preparation,
characterization, cytotoxicity and pharmacokinetics of
liposomes containing docetaxel [J]. J Controlled Release,
2003, 91(3): 417-429.
[6] 郭 洁, 洪子雯, 方晓玲. Box-Behnken 实验设计法优
化表阿霉素脂质体的处方工艺 [J]. 复旦学报: 医学版,
2007, 34(6): 816-820.
[7] 李 娟, 陆 洋, 王广基. Box-Behnken 效应面法优化
甘草次酸长循环脂质体的处方 [J]. 中国药科大学学
报, 2007, 38(2): 120-124.
[8] 杨 勇, 奉建芳, 张 慧, 等. 星点设计效应面法优化
蟾酥固体脂质纳米粒制备工艺 [J]. 中国中药杂志 ,
2006, 31(8): 650-653.
[9] 郝吉福, 房信胜, 王建筑, 等. 应用 Box-Behnken 实验
设计优化水飞蓟素固体脂质纳米粒处方研究 [J]. 中草
药, 2011, 42(11): 2221-2225.
[10] 杨春荣, 孙 忻, 赵秀峰, 等. Box-Behnken 效应面法
优化石杉碱甲纳米结构脂质载体处方 [J]. 沈阳药科大
学学报, 2011, 28(10): 769-773.
DLCL
DOC 普通脂质体
DOC 溶液
0 6 12 18 24
t / h
累
计
释
放
率
/
%

100

80

60

40

20

0