全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 10 期 2012 年 10 月

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黄花白及的 SCAR 分子标记转化研究
赵 爽 1，黄春球 2，杨耀文 1，周 敏 2，钱子刚 1*，李明静 2
1. 云南中医学院中药学院，云南 昆明 650500
2. 云南植物药业有限公司，云南 昆明 650111
摘 要：目的 建立黄花白及的 SCAR 标记，为黄花白及的分子鉴定提供科学依据。方法 用随机引物进行随机扩增多态
性 DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）标记筛选，获得特异的 RAPD 标记条带，经回收、克隆、测序后，
根据 RAPD 标记条带的两端序列设计特异引物进行常规 PCR 反应，以获得序列特征化扩增区（sequence characterized
amplified region，SCAR）标记。结果 利用 50 对随机引物筛选得到黄花白及的一条 896 bp 的特异片段，可以区别于小白
及、独叶白芨和白及。该序列设计特异引物后，经过多次重复试验，该 RAPD 标记的特异片段已成功转化为 SCAR 标记。
结论 建立的 SCAR 标记条带清晰明亮，结果稳定，可作为黄花白及分子鉴定的依据。
关键词：黄花白及；RAPD 标记；SCAR 标记；分子鉴定；特异片段
中图分类号：R282.2 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)10 - 2036 - 04
Research on SCAR molecular marker transformation of Bletilla ochracea
ZHAO Shuang1, HUANG Chun-qiu2, YANG Yao-wen1, ZHOU Min2, QIAN Zi-gang1, LI Ming-jing2
1. School of Chinese Materia Medica, Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China
2. Yunan Phytopharmaceutical Co., Ltd., Kunming 650111, China
Abstract: Objective In order to provide a scientific basis for molecular identification of Bletilla ochracea, the sequence characterized
amplified region (SCAR) marker of B. ochracea was established. Methods The random primer was used for random amplified polymorphic
DNA (RAPD) screening to obtain specific marker bands. Through separating, extracting, cloning, and sequencing, the specific primers were
designed for normal PCR reaction based on the sequences of both ends of RAPD marker bands to obtain SCAR marker. Results A specific
segment with 896 bp of B. ochracea was obtained by random screening of 50 pairs of primers, which was different from B. formosana,
Pleione yunnanensis, and B. striata. A pair of specific primers was based on the sequence of RAPD marker bands and then the RAPD marker
was successfully transformed into SCAR marker after repeated tests. Conclusion The established SCAR marker could make the band clear
and bright and be used as the basis for molecular identification of B. ochracea with the stable results.
Key words: Bletilla ochracea Schltr.; RAPD marker; SCAR marker; molecular identification; specific segment

黄花白及 Bletilla ochracea Schltr. 为兰科白
及属多年生草本植物[1]，以其假鳞茎入药，用于
肺结核出血、支气管扩张咯血、胃溃疡吐血、尿
血、便血，外用于外伤出血、烧烫伤等[2]。黄花
白及花色鲜黄靓丽，不仅具有药用价值，还具有
较高的观赏价值。近年来随机扩增多态性 DNA
（random amplified polymorphic DNA，RAPD）分子标
记广泛应用于药用植物的遗传多样性研究[3-5]，但其
重复性和稳定性较差；而利用序列特征化扩增区
（sequence characterized amplified region，SCAR）
分子标记技术可以解决 RAPD 标记的以上缺点[6]。
目前运用 SCAR 标记已对黄芪[7]、甘草[8]、杜仲[9]
等多种药用植物的分子鉴定进行研究。本研究利
用 RAPD 技术在黄花白及基因组中扩增到某一特
异条带，并将其转化为 SCAR 标记，为黄花白及
种质资源的引种栽培、资源保护和选种育种提供
一定的理论依据。
1 材料与仪器
黄花白及 Bletilla ochracea Schltr.、小白及
Bletilla formosana Schltr.、云南独蒜兰（又名独叶白
芨）Pleione yunnnanensis (Rolfe) Rolfe 和白及
Bletilla striata Rchb. f. 共 4 个种，每个种分别有 10
株新鲜植株个体，云南植物药业有限责任公司提供，
经云南中医学院钱子刚教授鉴定。

收稿日期：2012-02-06
作者简介：赵 爽（1980—）女，山东汶上人，博士，助理研究员，研究方向为药用植物生物技术。Tel: 15911633836 E-mail: zm_zs@126.com
*通讯作者 钱子刚 Tel: (0871)5919769 E-mail: qianzig@yahoo.com.cn
网络出版时间：2012-09-06 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20120906.1614.003.html
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 10 期 2012 年 10 月

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2 方法
2.1 DNA 提取
取植株嫩叶，采用改良 CTAB 法提取白及基因
组 DNA[10]，利用 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA
浓度和质量，最后将质量浓度调至 20 ng/μL。
2.2 RAPD 分析
采用分离群体分组分析（ bulked segregate
analysis，BSA）法[11]，分别将每一个白及种 10 个
个体的 DNA 等量混合，建立基因池。
PCR 反应体系：30 ng/μL 模板 DNA 1.0 μL，
10×PCR 缓冲液（不含 Mg2+）2.5 μL，25 mmol/L
MgCl2 1.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，5 μmol/L
RAPD 引物 2 μL，5 U/μL Taq 酶 0.2 μL，加 ddH2O
17.3 μL，总体系达到 25 μL。
PCR 扩增反应程序：95 ℃预变性 5 min；94 ℃
变性 45 s，34 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1.5 min，
40 个循环；72 ℃延伸 5 min。
扩增完毕后，在 3～5 V/cm 条件下用 1.5%琼脂
糖凝胶电泳分离扩增产物，凝胶成像系统检测目的
片段是否存在。
2.3 RAPD 特异片段的回收和克隆测序
利用 TransGen 快速凝胶回收试剂盒，参照相关
说明书对目的片段进行回收；将回收到的目的片段
与博迈德生产的快速克隆载体 pBM19-T 进行连接，
15 min 后转化大肠杆菌感受态细胞 Top10，涂布于
涂有 IPTG 和 X-gal 的 LB 加 Amp 的固体培养基上，
过夜培养。将生长出的白色克隆进行菌落 PCR，所
用引物为载体上的通用引物 M13F 和 M13R，将扩
增出的目的条带克隆测序。
2.4 SCAR 引物设计和 PCR 验证
根据测序结果，在 RAPD 引物的基础上向内再
延长 10～18 bp，设计特异引物，并用软件 primer5
进行引物分析，用其对模板 DNA 进行扩增。只对
退火温度和循环次数进行优化，其他 PCR 反应条
件、体系和 RAPD 筛选时的反应条件、体系相同。
3 结果与分析
3.1 黄花白及总 DNA 的提取
黄花白及叶片 DNA 在 1.0%琼脂糖凝胶电泳检
测结果见图 1，所提取的 DNA 整齐，说明 DNA 纯
度较高，可以用于后续 RAPD 引物筛选和 SCAR 标
记的优化试验。
3.2 RAPD 引物筛选及特异片段的获得
以黄花白及、小白及、独叶白芨和白及的 DNA
基因池为模板，共筛选 RAPD 随机引物 50 条。其
中利用 RAPD 随机引物 OP J5（CTCCATGGGG）
筛选出黄花白及的特异片段（图 2）。

图 1 黄花白及 DNA
Fig. 1 DNA of B. ochracea

1-黄花白及 2-小白及 3-独叶白芨 4-白及 M-marker
1-B. ochracea 2-B. formosana 3-P. yunnnanensis 4-B. striata M-marker
图 2 随机引物 J5 筛选出黄花白及的特异片段
Fig. 2 Specific segments of B. ochracea
screened by random primer J5
3.3 特异片段的回收、克隆和测序
利用凝胶回收试剂盒对上述特异片段进行回收
后，将目的片段进行克隆后测序。黄花白及的特异
片段序列为 896 bp（图 3）。
3.4 SCAR 标记特异引物的设计及验证
利用 primer 5 软件对上述黄花白及的特异片段设
计 SCAR 标记的特异引物：BJ1J5 上游：5’-CTCCA-
TGGGGTATACAAAGAC-3’；BJ1 J5 下游：5’-CTC-
CATGGGGCCTTGACCTAGG-3’。
利用合成好的特异引物，对模板 DNA 进行特
异性扩增，其中对退火温度和循环次数进行优化
处理。在 30 个循环，退火温度为 59.5 ℃时，其
他 PCR 反应条件、体系和 RAPD 筛选时间相同，
特异片段只在黄花白及中出现，在小白及、独叶
白芨和白及 3 个种中未出现；而且在黄花白及的
随机个体中出现，证明黄花白及的 SCAR 标记转
化成功（图 4）。
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1 2 3 4
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CTCCATGGGGTATACAAAGACTACACAACTCTACCAGGTATATGGAGATTACTCAACTCCATCAAGTATATAGA
AATTGCCCAACTCCACCAATTTTATGGAGACTACCCAACTCCATTAAGTATATAGAGACTACCCAACTCTATTT
AGTTTATAAAGACTACCTCACTCCGTCGAAACTGTGATGCGAAACTATAATTCTATTCCATGAATGTCAACATT
CCCTCTTGACGACCTTATGGAACATCAGTTGGTAAGAACTTCCTCTTTAAGATAGAAGCCTCATTATCGACCA
CTTTTGTTATAATGCATGTTAATCACATGATTTTCATATCACATATTCAAAAGATTAAAGAGGGGGAGGGGGGG
TAGCCCAATCCACATCCCCAAACCCTTTCTATTAGTATGGATAGAAATTATGGTTGCTAAGTCATTAGCCTATGC
CAAAAGGTGCCATGGAAACTTCTCCTTCAGTATTAATAAATGCTATGGTCATTGAGGCATTAGCCCTGAACAT
GACCCAAAGGAAACTCCTCCTTTAATAGTGATTGAAGTTATGGTCGGTGAAGCATTAGCTCTAGCCATGACCC
CAAGAAAACTTCTCCCTTCCTTCAGCATGACTAGAGTTATGGTTTCTAGGGCATAACTATAATGACTCTCCCCC
ATCTTTAAAATTTTTTACTCCAACACATCAAGAATCTTCTAGAGAGATAGTCCCCATGAGGGCTAGCCAGTTA
GAAAGCCTTATAGGGAACTTAGTTTTGGATAGGGTCTTCTATGAAAGTCATTATCACGGAGGCATTAGCCCAG
TCCACATCCTCAAGTAAACCCTTTATTTTAGTATGGACATAAATTACAATTGCCAAGTCATTATCCTAGGTCAA
GGCCCCATGGAG

下划线部分为 RAPD 随机引物 J5 序列
Underline part was the sequence of the random primer J5
图 3 黄花白及特异片段的序列
Fig. 3 Sequence of specific segment of B. ochracea



1-黄花白及 2-小白及 3-独叶白芨 4-白及 M-marker
1-B. ochracea 2-B. formosana 3-P. yunnnanensis 4-B. striata M-marker
图 4 黄花白及的 SCAR 分子标记
Fig. 4 SCAR molecular marker of B. ochracea
4 讨论
自从 1990 年 RAPD 标记技术诞生以来，以其
操作简便、快速、DNA 用量少等优点在各种研究领
域中发展迅速，但是该技术由于其稳定性差、重复
性差等缺点又限制了其进一步发展。与RAPD相比，
用 SCAR 引物扩增的 DNA 条带清晰明显，对反应
条件的敏感程度较低，而且特异性和重复性较好，
可以解决 RAPD 标记的不稳定性和 AFLP 标记的繁
琐、高成本的问题，这也进一步证实了 SCAR 标记
的优越性[12]。虽然目前已有不少 RAPD 标记成功转
化成 SCAR 标记的例子[13-15]，但通常情况下 SCAR
标记转换的成功率是很低的，可能是由于引物设计
不合适、序列相似或多拷贝、DNA 甲基化和回收的
DNA 片段污染等原因所导致的[16]。因此一般会选
择适当的引物长度、适当提高 PCR 扩增时的退火温
度、多次纯化回收的 DNA 片段等多方面进行优化
处理[17]，以获得成功的 SCAR 标记。
本研究在 SCAR 标记验证的过程中，对退火温
度和循环次数进行优化处理，得到一条清晰明显的
条带，表明黄花白及的 SCAR 标记已经转化成功。
由于 SCAR 标记克服了 RAPD 重复性欠佳的弱
点，并且有可能将RAPD标记由显性转化为共显性，
从而可以成为黄花白及种质鉴别的可靠依据。
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500 bp
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100 bp
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