全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 1 期 2012 年 1 月

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七叶皂苷钠抑制人白血病 Jurkat 细胞增殖的机制研究
万贵平，张真真，蔡雪婷，卢悟广，曹 鹏*
江苏省中医药研究院 细胞与分子生物学实验室，江苏 南京 210028
摘 要：目的 研究七叶皂苷钠抑制人白血病 Jurkat 细胞增殖的作用及其机制。方法 MTT 法分析七叶皂苷钠对 Jurkat 细
胞增殖的抑制作用，Hoechst 33258 染色、FITC-Annexin V/PI 双染、DNA Ladder、流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期，
Western blotting 法分析凋亡相关蛋白变化。结果 七叶皂苷钠呈质量浓度和时间相关方式抑制 Jurkat 细胞增殖；经七叶皂苷
钠处理后的 Jurkat 细胞出现凋亡的形态学特征、DNA 条带，Annexin V+/PI−细胞（早期凋亡细胞）显著增加；七叶皂苷钠可
活化 Jurkat 细胞中 Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3，引起 PARP 的切割，并减少 Bcl-2 蛋白的表达。结论 七叶皂苷钠能
有效地通过诱导细胞凋亡抑制 Jurkat 细胞增殖。
关键词：七叶皂苷钠；白血病 Jurkat 细胞；细胞凋亡；细胞增殖；抗肿瘤
中图分类号：R282.710.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)01 - 0106 - 05
Mechanism of escin sodium in inhibition of human leukemia Jurkat cells
proliferation
WAN Gui-ping, ZHANG Zhen-zhen, CAI Xue-ting, LU Wu-guang, CAO Peng
Laboratory of Cellular and Molecular Biology, Jiangsu Province Acacemy of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210028, China
Abstract: Objective To investigate the effects of escin sodium on proliferation of human leukemia Jurkat cells and its possible
mechanism. Methods The reduction of cellular viability was determined by MTT assay. Hoechst 33258 staining, DNA fragmentation
assay, FITC-Annexin V-FITC/PI staining assay, and cytometric analysis were used to confirm the features of apoptosis and cell cycle.
Western blotting assays were performed to explore the apoptotic pathway. Results Escin sodium inhibited the proliferation of Jurkat
cells in both dose- and time-dependent manners. The morphological apoptosis, DNA fragmentation pattern, and the percentage of
Annexin V+/PI− (early apoptosis) cells were markedly increased in escin sodium-treated Jurkat cells. Escin sodium activated
Caspase-8, Caspase-9, and Caspase-3, degraded poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), and attenuated Bcl-2 expression. Conclusion
Escin sodium could inhibit the proliferation of Jurkat cells via the induction of apoptosis effectively.
Key words: escin sodium; leukemia Jurkat cells; apoptosis; cell proliferation; antitumor

细胞凋亡的缺失在肿瘤发生、发展过程中起重
要作用，并影响肿瘤转移及预后。肿瘤细胞逃避凋
亡的能力在其对常规治疗药物产生抗药性中发挥重
要作用。因此，选择性地诱导肿瘤细胞凋亡已成为
抗肿瘤药物研发的一个重要策略[1-3]。
七叶皂苷钠是从天师栗 Aesculus wilsonii Rehd.
的干燥成熟果实中提取的三萜皂苷钠盐的天然混合
物，含有七叶皂苷钠 A、B、C、D 4 种成分，在临
床上作为抗水肿、抗渗出及血管保护药物。大量临
床资料表明，七叶皂苷钠药理作用可靠，不良反应
小，治疗范围广，在临床备受医生和患者的青睐[4]。
但关于七叶皂苷钠抗肿瘤作用的报道较少[5]，而抑
制人急性淋巴细胞白血病 Jurkat 细胞株增殖的作用
更是鲜见报道。因此，本实验研究了七叶皂苷钠对
Jurkat 细胞增殖的抑制作用及其机制，为将七叶皂
苷钠开发成为抗肿瘤药物提供实验基础。
1 材料
1.1 药物与试剂
七叶皂苷钠（批号：ZL-09010A，质量分数
99.24%），购自山东绿叶制药有限公司；抗 Caspase-8、
抗 Caspase-9、抗 Caspase-3、抗（ADP-核糖）聚合
酶（PARP）、抗 Bcl-2、抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶

收稿日期：2011-06-24
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30873410）
作者简介：万贵平，主任医师，副教授。E-mail: wanguiping@263.net
*通讯作者 曹 鹏 Tel/Fax: (025)85608666 E-mail: pcao79@yahoo.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 1 期 2012 年 1 月

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（GAPDH）抗体购自Cell Signaling Technology公司；
辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠、羊抗兔二抗购自
Santa Cruz Biotechonlogy 公司；MTT、RNA 酶、蛋
白酶 K、碘化丙啶（PI）、二甲基亚砜（DMSO）购
自 Sigma 公司；Hoechst 33258 凋亡检测试剂盒购自
南京凯基生物科技发展有限公司；RPMI 1640 培养
基购自 Invitrogen 公司。
1.2 细胞
人急性淋巴细胞白血病 Jurkat 细胞株（clone
E6-1）购自中国科学院上海细胞研究所，接种于含
10%小牛血清、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100
μg/mL）的 RPMI 1640 培养基中，置于 37 ℃、5%
CO2、饱和湿度培养箱中悬浮培养。
1.3 仪器
Class II A2 型生物安全柜（美国 Labconco 公
司），Axio observer A 荧光倒置显微镜（德国 Zeiss
公司），CKX31 倒置显微镜（日本 Olympus 公司），
HERA cell 150 CO2 细胞培养箱、NanoDrop—1000
超微量核酸蛋白测定仪、Multiskan spectrum 全波长
酶标仪（美国 Thermo Scientific 公司）。
2 方法
2.1 MTT 法检测细胞增殖
将对数生长期 Jurkat细胞接种于96孔板，37 ℃
培养过夜。用不同质量浓度（10、15、20、25、30
μg/mL）的七叶皂苷钠处理 Jurkat 细胞 12～48 h，每
孔加入 5 mg/mL 的 MTT 10 μL，37 ℃孵育 4 h 后弃
去培养基，每孔加入 DMSO 100 μL，振荡 10 min，
于 570、630 nm 波长处测定各孔的吸光度（A）值。
细胞存活率＝（A570－A630）实验组 /（A570－A630）对照组
2.2 FITC-AnnexinV/PI 双染法和 Hoechst 33258
染色检测细胞凋亡
收集经七叶皂苷钠处理的 Jurkat 细胞，冷 PBS
洗两次，FITC-Annexin V 避光染色 10 min，离心，
弃上清，加入 20 μg/mL 的 PI 工作液 100 μL，染色
10 min，离心，弃上清。结合缓冲液重悬细胞，流
式细胞仪检测细胞凋亡情况。
收集经七叶皂苷钠处理后的 Jurkat 细胞，4%甲
醛溶液 4 ℃固定 30 min。冷 PBS 洗 1 次，Hoechst
33258 工作液避光染色 10 min，离心弃固定液，加
PBS 重悬，放入 24 孔板中，荧光显微镜（×400）
观察细胞凋亡情况。
2.3 DNA Ladder 法检测细胞凋亡
收集经七叶皂苷钠处理后的 Jurkat 细胞，加入
溶解缓冲液 20 μL [20 mmol/L EDTA、100 mmol/L
Tris，pH 8.0、0.8%十二烷基磺酸钠（SDS）]、RNA
酶/T1 混合液 10 μL，37 ℃水浴 2 h。加入 20 mg/mL
的蛋白酶 K 10 μL，50 ℃水浴过夜。2%琼脂糖凝胶、
电压 30 V 电泳 5 h。
2.4 Western blotting 检测细胞凋亡相关蛋白
收集经七叶皂苷钠处理的 Jurkat 细胞，RIPA 裂
解液分离出蛋白。SDS-PAGE 分离蛋白样品，并将
其转移到 PVDF 膜上，脱脂奶粉室温封闭 2 h，一
抗 4 ℃孵育过夜，TBST 洗 3 次，每次 5 min；二
抗室温孵育 1 h，TBST 洗 3 次，每次 5 min。将膜
置于暗室曝光，显影定影。
2.5 流式细胞仪检测细胞周期
收集经七叶皂苷钠处理的细胞，用乙醇 4 ℃固
定过夜，离心去固定液，冷 PBS 洗两遍，每管细胞
加入 425 μL 冷 PBS、50 μL RNA 酶、25 μL PI，37 ℃
避光水浴 30 min，上机检测。
2.6 数据分析
采用 SPSS 18.0 软件进行统计学分析，数据以
sx ± 表示，单因素方差分析组间差异，两样本均数
差异比较采用 t 检验。各试验重复 3 次。
3 结果
3.1 对 Jurkat 细胞增殖的影响
经七叶皂苷钠处理后，Jurkat 细胞的存活率以
时间、质量浓度相关方式下降，七叶皂苷钠处理
Jurkat 细胞 24、48 h 的 IC50 值分别为（24.5±0.35）、
（19.2±0.78）μg/mL。结果见表 1。
3.2 对 Jurkat 细胞凋亡的影响
Hoechst 33258 染色结果显示，对照组 Jurkat 细
胞的细胞核呈圆形且染色均匀，而经 20、30 μg/mL
七叶皂苷钠处理 24 h 的 Jurkat 细胞出现核聚缩和颗
粒状的凋亡体，见图 1。
细胞凋亡的一个典型特征是染色体 DNA 在核
小体之间被切断，产生的 DNA 长度约为 180～200
bp 的整数倍，电泳呈梯形条带[6]。七叶皂苷钠处理
Jurkat 细胞 17 h 后，琼脂糖凝胶电泳结果显示，对
照组细胞中为大分子的基因组 DNA，而经七叶皂苷
钠 20、30 μg/mL 处理的 Jurkat 细胞中出现明显的
DNA 梯形条带，见图 2。
在细胞凋亡过程中，细胞膜的不对称性消失，
磷脂酰丝氨酸从细胞膜内侧转移到细胞膜外侧。
Annexin V 是一种钙依赖的磷脂结合蛋白，与磷脂酰
丝氨酸有高度的亲和力，所以标记 FITC 的 Annexin V
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表 1 七叶皂苷钠对 Jurkat 细胞存活率的影响 ( 3=± n , sx )
Table 1 Effects of escin sodium on survival rate of Jurkat cells ( 3=± n , sx )
细胞存活率 / % 组 别 ρ / (μg·mL−1)
12 h 24 h 48 h
对照 － 100.0±4.6 100.0±4.1 100.0±2.5
七叶皂苷钠 10 102.7±4.8 100.6±3.3 95.9±1.3
15 98.6±0.4 94.2±4.5 94.0±3.5
20 99.8±4.8 84.3±3.6** 35.6±4.5***
25 98.5±7.0 45.5±3.1*** 16.1±4.6***
30 76.0±6.3 ** 22.2±2.6*** 6.1±0.6***
与对照组比较：**P＜0.01 ***P＜0.001
**P<0.01 ***P<0.001 vs control group

图 1 Hoechst 33258 染色法检测 Jurkat 细胞凋亡
Fig. 1 Detection of Jurkat cells apoptosis by Hoechst 33258 staining

图 2 DNA Ladder 法检测 Jurkat 细胞凋亡
Fig. 2 Detection of Jurkat cells apoptosis via DNA Ladder
可作为识别外翻的磷脂酰丝氨酸的灵敏探针。
FITC-Annexin V/PI 双染法可同时区分出活细胞
（A−/PI−）、早期凋亡细胞（A+/PI−）、晚期凋亡及坏
死细胞（A+/PI+）[7]。七叶皂苷钠处理 Jurkat 细胞后，
早期和晚期凋亡细胞明显增加，并与其质量浓度呈
相关性，而活细胞减少，见图 3。七叶皂苷钠 10、
20、30 μg/mL 处理 Jurkat 细胞 14 h 后，凋亡细胞（早
期和晚期凋亡细胞）所占比例从对照组的（4.53±
0.45）%，分别增加至（5.95±1.33）%、（44.99±
2.06）%、（69.52±1.98）%。
3.3 对 Caspase 活化的影响
Western blotting 检测结果显示，用七叶皂苷钠
处理人急性淋巴细胞白血病 Jurkat 细胞 14 h 后，相
对分子质量为5.7×104的pro-Caspase-8降解为相对分
子质量为 4.1×104或 4.3×104活化形式的 Caspase-8。
酶原形式且相对分子质量为 4.7×104 的 pro-
Caspase-9 则被切割为相对分子质量为 3.7×104 的
Caspase-9，而且酶原形式的 pro-Caspase-3 的量也减
少。PARP 作为活化 Caspase-3 的下游作用底物，在
细胞凋亡过程中被切割[8]。七叶皂苷钠作用 Jurkat
细胞 14 h 后，相对分子质量为 1.16×105的 PARP
被切割为相对分子质量为 8.6×104。这些结果均有
力地证明了在七叶皂苷钠诱导 Jurkat 细胞凋亡的过
程中，发生了 Caspase 级联活化。结果见图 4。
对照 七叶皂苷钠 10 μg·mL−1 七叶皂苷钠 20 μg·mL−1 七叶皂苷钠 30 μg·mL−1

1 2 3 4 Marker
1-对照 2～4 七叶皂苷钠 10、20、30 μg·mL−1
1-control 2—4-escin sodium 10, 20, and 30 μg·mL−1
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图 3 FITC-Annexin V/PI 双染法检测 Jurkat 细胞凋亡
Fig. 3 Detection of Jurkat cells apoptosis by FITC-Annexin V/PI staining
3.4 对 Bcl-2 蛋白表达的影响
Western blotting 检测结果显示，Jurkat 细胞经
七叶皂苷钠处理后，Bcl-2 的表达减少并呈质量浓度
相关性，结果见图 5。
3.5 对 Jurkat 细胞周期的影响
流式细胞检测结果显示，七叶皂苷钠对 Jurkat
细胞周期无阻滞作用，进一步表明七叶皂苷钠抑制
Jurkat 细胞增殖是通过诱导凋亡而非阻滞细胞周期
实现的。

图 4 七叶皂苷钠诱导 Jurkat 细胞 Caspase 活化
Fig. 4 Caspase activation in Jurkat cells
induced by escin sodium

图 5 七叶皂苷钠对 Jurkat 细胞 Bcl-2 蛋白表达的影响
Fig. 5 Effects of escin sodium on protein expression
of Bcl-2 in Jurkat cells
4 讨论
本实验发现七叶皂苷钠通过诱导细胞凋亡抑制
人白血病 Jurkat 细胞增殖。细胞凋亡分为内源凋亡
途径和外源凋亡途径两大类[9]。在内源凋亡途径中，
线粒体通透性改变，细胞色素 C 从线粒体释放到细
胞质，和接头分子 Apaf-1、pro-Caspase-9 一起组成
凋亡小体，pro-Caspase-9 通过二聚化而活化，活化
的 Caspase-9 可以介导反馈线粒体损伤，从而放大
线粒体途径的凋亡信号[10]。基因敲除 Caspase-9 能
延缓线粒体膜电位的下降[11]；Bcl-2 家族参与细胞
凋亡过程中线粒体通透性的调节 [12]。本实验中
Caspase-9 的活化及 Bcl-2 表达的减少，均提示在七
叶皂苷钠诱导 Jurkat 细胞凋亡的过程中可能涉及内
源性凋亡途径。
目前抗肿瘤药物的研发与应用已经成为生物医
药科学的一个快速发展的重要领域，从药用植物中
寻找新的抗肿瘤化合物已成为抗肿瘤研发的重要方
向。七叶皂苷钠作为一种植物药制剂，符合未来用
药趋势，而且在临床上广泛应用多年，与很多新药
相比更易获得、更安全、更便宜。如果能将其开发
为抗肿瘤药物，将对临床上疗效良好、使用安全的
药物拓展新的适应症提供参考和借鉴。
参考文献
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100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104
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AnnexinV
对照 七叶皂苷钠 10 μg·mL−1 七叶皂苷钠 20 μg·mL−1 七叶皂苷钠 30 μg·mL−1
PI

PI

PI

PI

Caspase-8
Caspase-9
pro-Caspase-3
PARP
GAPDH
5.7×104
4.3×104
4.1×104
4.7×104
3.7×104
3.2×104
1.2×105
8.5×104
3.6×104
对照 10 20 30
七叶皂苷钠 / (μg·mL−1)
对照 10 20 30
七叶皂苷钠 / (μg·mL−1)
2.6×104
3.6×104
Bcl-2
GAPDH
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