全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 7 期 2012 年 7 月

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黑龙江产万寿菊花醇提物的指纹图谱研究
苏 瑞 1, 2，金敏婷 1，许 鑫 1，方 舟 1，任恒鑫 1，方洪壮 1*
1. 佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007
2. 哈尔滨市第一医院 药剂科，黑龙江 哈尔滨 150010
摘 要：目的 建立黑龙江产万寿菊花醇提物的指纹图谱并定性分析共有峰，为万寿菊花的质量控制提供参考。方法 采用
HPLC 分离 UV 检测建立色谱指纹图谱，Zorbax Eclipse XDB C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），乙腈-0.2%磷酸水溶液
梯度洗脱，体积流量 1 mL/min，柱温 25 ℃，检测波长 254 nm；用 LC-MS 定性共有峰，电喷雾离子源（ESI），负离子模式
扫描，雾化器压力 241.325 kPa，干燥器温度 350 ℃，干燥气体积流量 10 L/min，扫描范围：m/z 50～1 000。结果 万寿菊
花醇提物的指纹图谱有 8 个共有峰，并具有较好的精密度、重复性和稳定性，其中 5 个共有峰所对应的化学物质为万寿菊素、
异槲皮素、异槲皮素苷和槲皮万寿菊素及其苷。结论 建立的万寿菊花醇提物的指纹图谱，为万寿菊花的质量控制提供参考。
关键词：万寿菊；指纹图谱；液相质谱联用；万寿菊素；质量控制
中图分类号：R286.02 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)07 - 1324 - 04
Fingerprint for methanol extract of Tagetes erecta flowers from Heilongjiang
Province
SU Rui1, 2, JIN Min-ting1, XU Xin1, FANG Zhou1, REN Heng-xin1, FANG Hong-zhuang1
1. College of Pharmacy, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China
2. Pharmacy Department of the First Hospital of Harbin, Harbin 150010, China
Abstract: Objective To establish fingerprint and qualitatively analyze the common peaks for the methanol extract of Tagetes erecta
flowers from Heilongjiang Province, which could provide reference for the quality control of T. erecta. Methods The fingerprint was
established with UV detection and HPLC separation. Chromatographic condition included a Zorbax Eclipse XDB column (250 mm ×
4.6 mm, 5 μm), gradient elution with acetonitrile-0.2% phosphoric acid as mobile phase, flow rate 1 mL/min, column temperature
25 ℃, and detection wavelength 254 nm. LC-MS was used for the qualitative analysis of common peaks. LC-MS performed on
electrospray ionization (ESI) source with anion-pattern scanning and atomizer-pressure 241.325 kPa as well as desiccator temperature
350 ℃, flow rate 10 L/min, and scanning area m/z 50－1 000. Results The fingerprint of the alcohol extract from T. erecta flowers
with good precision, repeatability, and stability composed of eight common peaks. The chemical compositions corresponding to five
common peaks were patuletin, isoquercitin, isoquercitrin, and quercetagetin with its glycosides. Conclusion The liquid fingerprint
established could offer reference for the quality control of T. erecta.
Key words: Tagetes erecta L.; fingerprint; LC-MS; patuletin; quality control

万寿菊 Tagetes erecta L. 为菊科万寿菊属一年
生草本植物，夏秋季开花，花期较长，花色有柠檬
黄、橙红等，其花、叶、根均可入药[1]。万寿菊原
产于墨西哥，我国现为主要产地之一。黑龙江省各
个地区均有万寿菊的大面积种植，花的颜色主要为
橙红色。万寿菊花中含有的化学成分有类胡萝卜素、
叶黄素、黄酮类及挥发油等[2]，黄酮类物质多以苷
的形式存在，如槲皮万寿菊苷、万寿菊苷等[3-4]。万
寿菊花具有镇静、降压、扩张支气管、解痉挛的作
用，其黄酮类物质具有降血糖、调血脂、镇痛和抗
炎、抗肿瘤等作用[5]。
国内外关于万寿菊研究主要集中在叶黄素的分
离、定量及药理作用方面，美国药典对叶黄素的单
体进行了定量[6]，现虽有花中黄酮类化学成分的研
究，但尚未涉及其指纹图谱。指纹图谱已成为中药
或天然药物质量控制与评价的有力工具[7]，对其特

收稿日期：2011-11-04
作者简介：苏 瑞（1985—），男，黑龙江省哈尔滨市人，硕士研究生，研究方向为中药分析。E-mail: surui_2008@163.com
*通讯作者 方洪壮 Tel: (0454)8611265 E-mail: fhz-chjms@sohu.com
网络出版时间：2012-05-16 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20120516.1417.004.html
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 7 期 2012 年 7 月

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征峰的定性，是指纹图谱深层次研究的重要内容之
一。本研究采用 HPLC 法建立黑龙江产万寿菊花中
醇提取物黄酮的指纹图谱，并利用 LC-MS/MS 对部
分共有色谱峰定性分析，为万寿菊花质量评价与控
制提供依据。
1 仪器与试药
Agilent 1200 LC/DAD/MS 系列高效液相-质谱
联用色谱仪（美国 Agilent 公司）：G1322A 脱气机，
G1311A 四元泵，G1329A 自动进样仪，G1316A 柱
温箱，G1315D DAD 检测器，6310 质谱仪，Sartorius
BP211D 电子分析天平（德国 Sartorius 公司）。
万寿菊花 24 批，分别于 2009 年 8 月采集于黑
龙江省 9 个不同地区，经佳木斯大学药学院宗希明
高级实验师鉴定为菊科万寿菊属植物万寿菊
Tagetes erecta L. 的花，见表 1。乙腈、甲醇为色谱
纯，磷酸、甲醇为分析纯。

表 1 万寿菊花样品
Table 1 Samples of T. erecta flowers
批次 采集地 色泽 批次 采集地 色泽 批次 采集地 色泽
W1 萝北县共青农场 1 队东部 橙红 W9 萝北县共青农场 15 队东部 橙红 W17 哈尔滨松北区乐业镇 橙红
W2 萝北县共青农场 1 队南部 橙红 W10 萝北县共青农场场部西部 橙红 W18 大庆市大同区 橙红
W3 萝北县共青农场 3 队南部 橙红 W11 勃利县小五站 橙红 W19 齐齐哈尔哈拉海农场 橙红
W4 萝北县共青农场 6 队南部 橙红 W12 勃利县双河镇 橙红 W20 黑龙江明水县崇德镇 土黄
W5 萝北县共青农场 8 队东部 橙红 W13 勃利县大四站 橙红 W21 佳木斯市西林公园 黄
W6 萝北县共青农场 8 队北部 橙红 W14 勃利县勃利镇 橙红 W22 佳木斯大学校园 土黄
W7 萝北县共青农场 9 队西部 橙红 W15 青冈县中和镇 橙红 W23 佳木斯大学校园 橙红
W8 萝北县共青农场 14 队西部 橙红 W16 肇州县二井镇 橙红 W24 佳木斯大学校园 黄

2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备
取万寿菊花粗粉（过 60 目药筛）约 0.25 g，精
密称定，置 250 mL 圆底烧瓶中，加入 50 mL 甲醇，
称定质量。加热回流提取，保持微沸 2 h，冷却，再
称定质量，加入甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过
至 50 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得供试品
溶液。冷藏，备用。
2.2 检测条件
2.2.1 色谱条件 Zorbax Eclipse XDB-C18 分析柱
（250 mm×4.6 mm，5 μm），Zorbax Eclipse XDB C18
保护柱（12.5 mm×4.6 mm，5 μm），柱温 25 ℃；
0.2%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相；梯度
洗脱程序：0～5 min，10%～15% B；5～21 min，
15%～23% B；21～35 min，23%～62% B；体积流
量 1 mL/min；进样量 10 μL。
2.2.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）；负离子扫
描模式；雾化器压力 241.325 kPa；干燥器温度 350
℃；干燥气体积流量 10 mL/min；相对分子质量扫
描范围 50～1 000；碎裂电压 1.0 V。
2.3 测定波长的选择
取供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件进样，
记录保留时间下的 200～400 nm 色谱光谱数据，绘
制万寿菊花中醇提取物溶液色谱-光谱等值线图，见
图 1。可知分离出的大多数物质在 254 nm 处有较大
的吸收，故选择254 nm为测定波长，谱带宽为4 nm。
2.4 共有峰的选取与分析
2.4.1 共有峰选取 在确定的色谱条件下，供试品
溶液和空白溶液（甲醇）的色谱图见图 2。由图可
知实验所用的试剂对样品的测定无干扰，样品色谱
图中，有 8 个峰面积较大的符合指纹图谱共有峰要
求的色谱峰，其峰面积总和占色谱图总峰面积的
95%以上。8 个色谱峰分别用 1～8 来标记，其保留
时间分别为 10.22、12.91、16.46、17.04、21.16、24.70、
27.35、29.18 min。



图 1 万寿菊花醇提取物色谱-光谱等值线图
Fig. 1 Contour map of chromatography-spectra
for methanol extract of T. erecta flowers
0 5 10 15 20 25 30 35
t / min
400
360
320
280
240
200
波
长
/
n
m

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图 2 空白溶液 (A) 和供试品溶液 (B) 的 HPLC 色谱图
Fig. 2 HPLC chromatograms of blank solution (A)
and sample solution (B)
2.4.2 色谱峰鉴定 供试品溶液在 HPLC 上经 0.2%
甲酸水-乙腈的流动相梯度洗脱后，记录各色谱峰的
DAD 数据；同时按设定的质谱条件，获取一级质谱
数据，并分别以准分子离子峰为母离子，再提高相
对碰撞能，利用 ESI-MSn 离子阱的步进式碰撞技术
进行多级质谱分析，获得相应的子离子质谱信息。
结合各色谱峰的紫外光谱和质谱及色谱峰的保留时
间，对其色谱图中的部分色谱峰进行结构归属的判
断，结果见表 2。可知，2 号峰的母离子为 m/z 479，
经 MSn 的碎裂生成 m/z 317、299、271 离子，其中，
m/z 317 是由母离子失去 1 个六碳糖基而形成，m/z
299、271 分别来自于 317 丢失 H2O 和 H2CO2（CO＋
H2O）；5 号峰的母离子及 MS2 离子与 2 号峰 MSn
的离子相同，结合文献数据[8-9]及化合物的极性，推
断 2 和 5 号峰分别为槲皮万寿菊苷、槲皮万寿菊素。
4 号峰的母离子 m/z 463 的 MSn 碎裂失去 1 个六碳
糖生成 m/z 301 离子，再由 m/z 301 分别失去 H2O
和 CO 产生 283 和 273 两个离子，这两个离子与 7
号峰的离子碎片相同，根据色谱峰的保留时间和文
献数据[10-11]推断，4、7 号色谱峰属同类物质，分别
为异槲皮素苷和异槲皮素。8 号峰母离子 m/z 331，
MS2 的碎裂生成 m/z 301、288、271，这 3 个离子分
别为 m/z 331 丢失 CH3、CO 和 H2O＋CO 的碎片，
经与文献数据[9]比较，推断 8 号峰为万寿菊素。

表 2 部分共有峰的归属
Table 2 Attribution of some common peaks
色谱峰 保留时间 / min 波长 / nm [M－H]− (m/z) MSn 化合物
2 12.91 358、260 479 317, 299, 271, 227, 199, 167, 139, 111 槲皮万寿菊苷
4 17.04 345、274 463 301, 283, 273, 255, 245, 227, 217, 201, 183 异槲皮素苷
5 21.16 358、258 317 299, 271, 227, 215, 199, 167, 139, 111 槲皮万寿菊素
7 27.35 350、274 302 283, 273, 255, 245, 227, 217, 201, 183 异槲皮素
8 29.18 371、258 331 316, 288, 271, 255, 243, 229, 194, 179, 166, 138 万寿菊素

2.5 方法学考察
2.5.1 精密度试验 取 W1 批样品制备的供试品溶
液，在上述色谱条件下重复进样 6 次，记录色谱图。
计算各色谱峰相对于参照峰的相对保留时间和相对
峰面积。结果表明，各色谱峰相对峰面积的 RSD＜
3%，相对保留时间的 RSD＜1%。
2.5.2 重复性试验 取 W1 批的样品 6 份，按供试
品溶液制备项下方法操作，在上述色谱条件下分别
进样，记录色谱图。计算各色谱峰相对于参照峰的
相对峰面积和相对保留时间。结果表明，各色谱峰
相对峰面积 RSD＜3%，相对保留时间 RSD＜1%，
符合指纹图谱的要求。
2.5.3 稳定性试验 取 W1 批的供试品溶液，分别
于 0、2、4、8、12、24 h，在上述色谱条件下分别
进样，记录色谱图。计算各色谱峰的相对峰面积和
相对保留时间。结果表明，各色谱峰相对峰面积
RSD＜3%，相对保留时间 RSD＜1%，表明供试品溶
液在 24 h 内稳定。
2.6 指纹图谱的建立
2.6.1 共有模式建立 取 10 批产地有代表性的橙
红色花样品，用于指纹图谱的建立。10 批样品分别
为 W1、W5、W8、W11、W12、W15、W16、W17、
W18 和 W19。按上述方法制备供试品溶液并测定，
获取指纹图谱。按峰方式以均值法、中位数法分别
建立对照图谱（R），以对照图谱（均值和中位数）作
为指纹图谱的共有模式，结果见图 3。根据样品和其
共有模式的各峰的峰面积，计算各批样品与其共有
模式的相似度，结果表明，10 批样品与其共有模式
的相关系数均大于 0.95，符合指纹图谱的技术要求。
2.6.2 共有模式检验 取剩余 14 批样品，制备供试
品溶液，按上述色谱条件测定，记录指纹图谱，并
计算各批万寿菊花醇提取物的色谱峰与所建立共有
模式的相关系数，结果见表 3。可知 14 批样品与所
建立共有模式的相似度均大于 0.85，表明不同产地
1
3
4
5
6 7 8
2 (S)
0 5 10 15 20 25 30 35
t / min
B
A
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的各种颜色万寿菊花的指纹图谱在总体特征上基本
接近，所建立的指纹图谱能够满足万寿菊花质量控
制的要求。



图 3 10 批万寿菊花的 HPLC 指纹图谱
Fig. 3 HPLC fingerprint for ten batches of T. erecta flowers

表 3 14 批样品与共有模式相似度
Table 3 Fingerprint similarity for 14 batches of T. erecta
flowers with common pattern
样品 均值法 中位数法 样品 均值法 中位数法
W2 0.976 7 0.976 3 W13 0.982 2 0.979 1
W3 0.983 3 0.981 8 W14 0.980 3 0.978 8
W4 0.975 2 0.973 5 W20 0.950 3 0.945 3
W6 0.964 6 0.964 2 W21 0.896 9 0.891 3
W7 0.977 8 0.976 6 W22 0.867 9 0.861 6
W9 0.971 2 0.970 6 W23 0.876 1 0.873 4
W10 0.966 7 0.964 2 W24 0.871 9 0.875 9

3 讨论
3.1 提取溶剂的选择
考察了 75%、100%甲醇，100%甲醇盐酸水解
及盐酸水解后氯仿萃取不同提取溶剂法。实验表明，
100%甲醇提取率较高，化合物种类较多，因此本实
验采用 100%甲醇提取。
3.2 色谱条件选择
万寿菊指纹图谱按设定的色谱条件，在 35 min
后，流动相中乙腈的比例升至 100%，继续洗脱至 1
h，未见色谱峰出现，因此将 35 min 以前的色谱图
作为万寿菊药材的指纹图谱。
由于磷酸水溶液较难挥发，易污染质谱检测器，
不适宜作为 LC-MS 联用时的流动相。因此，样品
质谱分析时，将 0.2%磷酸水溶液换成与其 pH 值相
似且易挥发的 0.2%甲酸水溶液。
3.3 LC-MS 峰的归属
LC-MSn 检测并结合文献推断出万寿菊花中 8
个主要共有峰中的 5 个物质，即第 2、4、5、7 和 8
号峰分别为槲皮万寿菊素苷、异槲皮素苷、槲皮万
寿菊素、异槲皮素及万寿菊素。其他 3 个色谱峰由
于无文献数据支持，未推断其化合物的归属，有待
进一步研究。
3.4 指纹图谱相似性
虽然用于共有模式验证的万寿菊花指纹图谱较
接近，但 W21～W24 批样品与所建立的共有模式的
相似度显然较另外 10 批样品的相似度低。分析其原
因，W21～W24 批均为供观赏的园林培育品种，而
另 10 批来自于大面积生产种植。不同颜色万寿菊花
的指纹图谱虽有一定的差异，但差异的程度要小于
同一颜色的园林与生产品种间的差异。
参考文献
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10
↑
1
R 中位数
R 均值
0 5 10 15 20 25 30 35
t / min