全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 3 期 2011 年 3 月 •555•
益气活血方对慢性心力衰竭大鼠心肌 NCX 与 SERCA2a mRNA 及蛋白
表达水平的影响
于春泉，王 怡，李 芳，李欣桐
天津中医药大学，天津 300193
摘 要：目的 观察益气活血方（由丹参、黄芪、香加皮等组成）对慢性心力衰竭（CHF）大鼠心肌钠钙交换蛋白
（Sodium-calcium exchanger，NCX）与肌浆网钙泵-2a（SR calcium ATPase-2a，SERCA2a）mRNA 及蛋白表达水平的影响，
初步探讨益气活血方改善慢性心衰大鼠心功能的作用机制。方法 采用结扎大鼠冠状动脉左前降支的方法制备急性心肌梗死
后慢性心力衰竭模型。实验分 6 组：假手术组，模型组，卡托普利组，益气活血方高、中、低 3 个剂量组，连续 ig 给药 4
周后取材，检测心肌组织 NCX 与 SERCA2a mRNA 及蛋白表达。结果 各给药组均可不同程度的下调 NCX mRNA 的表达，
上调 SERCA2a mRNA 的表达，其中益气活血方高、低剂量组以及卡托普利组与模型组比较有显著性差异（P＜0.05）；各给
药组均能降低 NCX/SERCA2a mRNA 的比值，与模型组比较差异显著（P＜0.05）。各给药组均有下调 NCX 蛋白、上调 SERCA
蛋白表达的趋势，但与模型组相比无显著差异（P＞0.05）。结论 益气活血方能够降低 CHF 大鼠 NCX mRNA 的表达，升
高 SERCA mRNA 的表达，降低 NCX/SERCA mRNA 的比值，调节心肌细胞内钙循环，从而改善心肌的舒缩功能，其可能为
益气活血方改善心脏功能、抗心力衰竭的机制之一。
关键词：益气活血方药；心力衰竭；钠钙交换蛋白；SERCA；Ca2+-ATP 酶
中图分类号：R285 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)03 - 0555 - 04
Effect of Yiqi Huoxue Recipe on protein and mRNA expression of SERCA2a
and NCX in chronic heart failure rats
YU Chun-quan, WANG Yi, LI Fang, LI Xin-tong
Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China
Key words: Yiqi Huoxue Recipe; chronic heart failure (CHF); NCX; SERCA; Ca2+-ATPase
慢性充血性心力衰竭（CHF）属于中医学心悸、
喘证、痰饮、水肿等范畴，根据慢性心衰的演变规
律（心气阳虚→血瘀→水停）确定以益气温阳、活
血利水为基本治疗原则。益气活血方是由丹参、黄
芪、香加皮等药物组方而成，组方符合中医学对心
力衰竭的病机认识，具有益气活血、温阳利水之功
效。该方经过临床验证能够改善充血性心力衰竭肺
水肿症状，减少水钠潴留，调节神经内分泌因子和
细胞因子，具有明确的抗心力衰竭疗效[1-3]。
CHF 的发生过程有多种因素参与，其发生与细
胞内钙调节异常有关，Ca2+调节不仅决定心肌舒缩
功能，还对心脏肥厚、重塑等结构改变有重要影响[4]，
因此，Ca2+调节是心力衰竭病理生理的中心环节[5]。
本研究通过考察益气活血方对慢性心衰模型大鼠心
肌组织中钙转运过程中的重要通道蛋白 NCX 和
SERCA2a 的 mRNA 和蛋白表达水平的影响，探讨
益气活血方抗心力衰竭的机制，为临床用药提供科
学依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康 Wistar 大鼠，雄性，体质量（300±30）g，
购于北京维通利华公司，动物合格证编号：
SCXK(京)2002-0003。分笼饲养，每笼 5 只，自由
饮水。
1.2 主要仪器
LOGIQ400CL 彩色超声心动仪（美国 GE 公
司）；Allegra－64R Centrifuge 低温高速离心机
（Beckman，美国）；DU－530 紫外分光光度计（DNA/
_______________________________________
收稿日期：2010-08-23
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30672682）；天津市卫生局资助项目（07013）
作者简介：于春泉（1975—），男，天津中医药大学，从事中医药治疗心脑血管疾病及中医证候学研究。
Tel: 13821624788 (022)59596311 E-mail: ycq-4@163.com
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Protein Analyzer，Beckman，美国）；逆转录仪（PCR
Express，英国）；ABI®7300 实时荧光定量系统
（Applied Biosystems，美国）；DYY—IIIB 电泳仪（北
京六一仪器厂）；转膜装置（Bio-Rad，美国）；ENE
GENIUS 凝胶成像系统（Bio Imaging System，
Syngene，英国）。
1.3 受试药物和试剂
益气活血方干膏由天津中医药大学中医药研究
院药学部提供，每克干膏相当于生药 9.515 g，批号
040915；阳性对照药卡托普利（中美上海施宝贵制
药有限公司），规格 12.5 mg/片，批号 0702031G。
Trizol Reagent（invitrogen）；Reverse Transcrip-
tion Reagents Kit；Power SYBR®Green PCR Master
Mix Reagents Kit（Applied Biosystems，美国）；
RNase-free water（生工生物（上海）有限公司）；
引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。引
物序列见表 1。
表 1 引物序列
Table 1 Primer sequences
引 物 正 向 反 向
β-actin 5’-TCTGTGTGGATT-
GGTGGCTCTA-3’
5’-CTGCTTGCTGATC-
CACATCTG-3’
NCX 5’-CTGGAGCGCGAG-
GAAATGTTA-3’
5’-GACGGGGTTCTCC-
AATCTCAA-3’
SERCA2a 5’-TCTGACTTTCGTT-
GGCTGTG-3’
5’-GCCTTTGTTATCCC-
CAGTGA-3’
RIPA 裂解液（强）（碧云天生物技术研究所），
PMSF，BCA 蛋白浓度测定试剂盒，丙烯酰胺
（Solarbio），预染 marker（Fermentas）；小鼠抗大鼠
NCX（chemicon® International）、SERCA（abcam，
美国）、actin 单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，
美国）；山羊抗小鼠 IgG1 HRP 标记二抗（中杉试剂
公司），增强型化学发光底物（ImmobilonTM Western
Chemiluminescent HRP Substrate，美国）。
1.4 心力衰竭大鼠模型的制备
采用 10%水合氯醛腹腔麻醉（3 mL/kg），仰卧
位固定，在左侧 4～5 肋间开胸暴露心脏，挑破心包，
轻压右胸，将心脏轻轻挤压出胸腔外，于左心耳下
2～3 mm 左冠状动脉前降支处穿线，随后立即把心
脏送回胸腔内，轻轻挤压胸腔排出空气，关胸，恢
复动物自主呼吸，稳定 5 min 左右，结扎冠脉（假
手术组只穿线不结扎），观察心电图变化并记录，缝
合伤口后，sc 青霉素，预防伤口感染。心电图显示
ST 段显著抬高则表示急性心肌梗死造模成功。
1.5 动物分组及给药
于手术后第 5 周检测心功能，根据文献报道，
以 EF 值小于 60%作为心衰模型成功的标志[6]。剔
除死亡和未达到心衰标准的大鼠后，随机分为模型
组，益气活血方高、中、低剂量（0.84、0.42、0.21
g/kg）组，卡托普利（40 mg/kg）组，以及假手术
组。各给药组每天 ig 给药（10 mL/kg），假手术以
及模型组 ig 等体积的蒸馏水，连续给药 4 周。
1.6 RT-PCR法检测NCX和SERCA2a mRNA表达
将给药 4 周后的大鼠 ip 水合氯醛（30 mg/kg）
麻醉，腹主动脉取血，摘取心脏，取左心室梗死区
与非梗死区之间的缺血组织，装入冻存管，迅速置
于液氮中冷冻，−80 ℃冰箱保存，待测。
1.6.1 总 RNA 的提取 采用 Trizol 法提取心肌组
织总 RNA，紫外分光光度计检测，琼脂糖凝胶电泳
分析其完整性。取 0.2 μg RNA 用于反转录。RNA
的反转录：反应体系为 10×RT Buffer 1.0 μL，
MgCl2（25 mmol/L） 4.4 μL，deoxyNTPs Mixture
（2.5 mmol/L）4.0 μL，Random Hexamers（50 μmol/L）
1.0 μL，RNase Inhibitor （20 U/L）0.4 μL，MultiScribe
Reverse Transcriptase（50 U/μL）0.5 μL。混合以上
反应物，离心，涡旋，再次离心后装入 PCR 小管，
每个 PCR 小管加入 12.3 μg RNA，用 RNase-free
water 补足反应体系至 20 μL。反应条件：25 ℃、
10 min，48 ℃、30 min，95 ℃、5 min。
1.6.2 PCR 反应 反应体系为 2×Master Mix 12.5
μL，正向引物 0.5 μL（200 nm/L），反向引物 0.5 μL
（200 nm/L），cDNA Sample 0.5 μL，RNase-free water
11 μL，反应体系为 25 μL。混合以上反应物，放入
实时定量 PCR 仪反应，扩增条件为 95 ℃预变性 10
min 后，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，扩增 40 个循
环。反应结束后，分析 PCR 过程各检测样本的域值
循环数（threshold cycle，CT）值，通过 2−ΔΔCT计算。
PCR 反应重复 3 次。
1.7 Western-blotting 法检测 NCX 和 SERCA2a 蛋
白表达情况
将所取心肌组织研磨成匀浆，测定样品中蛋白
浓度后，用十二烷基硫酸钠缓冲液与蛋白样品等体
积混合，置于水浴锅中恒温变性。将变性处理过的
蛋白样品加入浓缩胶中，每孔加蛋白20 g进行电泳，
电压 90 V。蛋白进入分离胶后，将电压调至 120 V。
电泳结束后，将分离胶上的蛋白转移至 PVDF 膜上。
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转膜条件：恒定电流 150 mA，NCX 和 SERCA 转
移 90 min。转膜结束后将膜放入封闭液中封闭。封
闭结束后膜上蛋白依次与一抗、二抗结合，一抗结
合过夜，二抗结合 1 h。二抗结合结束后，在膜上加
ECL 化学发光底物，反应 5 min 后于暗室内将胶片
置于转移膜上曝光，显影、定影后以凝胶成像系统
分析结果。
1.8 统计学处理
所有数据用 sx ± 表示，使用 SPSS11.5 统计软
件进行组间单因素方差分析比较。
2 结果
2.1 益气活血方对慢性心力衰竭大鼠心肌 NCX 与
SERCA2a mRNA 表达的影响
与假手术相比，模型组大鼠心肌 NCX mRNA 表
达显著升高（P＜0.01），SERCA2a mRNA 表达降低
（P＜0.05）。卡托普利组以及益气活血方组均能下调
NCX mRNA 表达，上调 SERCA2a mRNA 表达，其
中与模型组比较卡托普利组能显著下调NCX mRNA
的表达（P＜0.01），益气活血方高、低剂量组效果明
显（P＜0.05）；益气活血方高、中剂量组能显著上调
SERCA2a mRNA 表达（P＜0.01、0.05），卡托普利
组亦有明显效果（P＜0.05）。各给药组均能降低
NCX/SERCA2a mRNA 比值，与模型组比较差异有
统计学意义（P＜0.05），结果见表 2。
2.2 益气活血方对慢性心力衰竭大鼠心肌 NCX 与
SERCA2a 蛋白表达水平的影响
与假手术组相比，模型组大鼠心肌 NCX 蛋白
表达有升高趋势，SERCA2a 表达有降低趋势，
NCX/SERCA2a 蛋白比值有升高趋势。各给药组均
有下调 NCX 蛋白及上调 SERCA2a 蛋白表达的趋
势，并且各给药组 NCX/SERCA 蛋白比值均有降低
的趋势，结果见表 3、图 1。
表 2 益气活血方对慢性心衰大鼠心肌 NCX 和 SERCA2a mRNA 表达的影响 ( s x ± )
Table 2 Effect of Yiqi Huoxue Recipe on mRNA expression of NCX and SERCA2a in CHF rats ( s x ± )
组 别 剂量/(g·kg−1) n NCX SERCA2a NCX/SERCA2a
假手术 − 11 0.22±0.16 1.36±0.67 0.004±0.004
模型 − 12 1.24±0.32** 0.59±0.39* 0.024±0.020*
益气活血方 0.84 11 0.64±0.43# 1.38±0.82# 0.008±0.003#
0.42 10 0.86±0.19 2.05±1.05## 0.009±0.004#
0.21 13 0.65±0.42# 0.98±0.53 0.008±0.003#
卡托普利 0.04 10 0.71±0.25## 1.36±0.73# 0.006±0.004#
与假手术组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01
*P<0.05 **P<0.01 vs Sham group; #P<0.05 ##P<0.01 vs model group
表 3 益气活血方对慢性心衰大鼠心肌 NCX 和 SERCA2a 蛋白表达的影响 ( s x ± )
Table 3 Effect of Yiqi Huoxue Recipe on protein expression of NCX and SERCA2a in CHF rats ( s x ± )
组 别 剂量/(g·kg−1) n NCX SERCA2a NCX/SERCA2a
假手术 − 11 0.68±0.10 0.53±0.17 1.72±0.89
模型 − 12 0.73±0.22 0.46±0.18 1.89±1.25
益气活血方 0.84 11 0.67±0.20 0.50±0.21 1.54±0.84
0.42 10 0.63±0.21 0.52±0.24 1.52±1.19
0.21 13 0.63±0.21 0.49±0.11 1.36±0.65
卡托普利 0.04 10 0.73±0.16 0.50±0.14 1.54±0.59

3 讨论
在慢性心衰发生发展的过程中，心肌细胞的钙
稳态遭到破坏，胞内钙瞬变减小和衰减减慢，这种
变化被认为与细胞膜表面的 NCX、SERCA2a、L-
型钙通道（LTCC）及肌浆网钙释放通道（ryanodine
receptor，RyR)蛋白等钙调蛋白的改变有关[7]，其中
NCX 和 SERCA2a 的变化对衰竭心脏细胞钙瞬变影
响最为显著[8]。大量研究表明，在衰竭心脏中，
SERCA2a 的蛋白和mRNA水平明显降低[9]，而NCX
却显著增高[10-12]。又有研究显示，NCX 的 Na+/Ca2+
交换活性增强可以代偿 SERCA 摄取 Ca2+的功能降
低[13-15]，增强心脏的舒张及收缩功能，但同时过度
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图 1 益气活血方各组 NCX、SERCA2a 蛋白印迹分析
Fig. 1 Blotting analysis of NCX and SERCA2a protein
in Yiqi Huoxue Recipe different groups
增强的 Na+/Ca2+交换活性又可导致 Ca2+过度外排，
SR 钙负荷减少，从而影响心脏收缩性能[16]。因此，
NCX 与 SERCA 在降低胞内钙方面不能协调一致，
导致细胞内钙稳态失衡，心脏功能逐步恶化，这就
是通常所说的“NCX 与 SERCA 平衡假说”。
本研究依据“NCX 与 SERCA 平衡假说”，通
过检测 NCX 与 SERCA2a 在 mRNA 及蛋白水平的
变化以及 NCX 与 SERCA2a 比值，从心肌细胞内钙
循环方向进一步探讨了益气活血方治疗心衰的作用
机制。研究显示，本方药能够降低 NCX mRNA 水
平，升高 SERCA2a mRNA 的表达水平，并且各剂
量组NCX与 SERCA2a比值与模型组比较均具有显
著差异（P＜0.05），表明本益气活血组方能调节失
衡的 NCX 和 SERCA2a，增强细胞内的钙稳态，从
细胞和分子水平影响心衰大鼠的心功能。虽然本方
对NCX与 SERCA2a的蛋白表达水平的影响无统计
学意义，但是其趋势与 mRNA 的变化一致，其原因
可能是转录后修饰的结果或是组织放置后导致蛋白
降解引起蛋白水平下降。因此，本研究可以得出益
气活血方通过改善NCX与SERCA2a mRNA表达水
平，从而促进舒张期肌浆网 Ca2+的摄取以及心肌细
胞内Ca2+的泵出，降低舒张期心肌细胞内Ca2+浓度，
增强心肌舒缩力。这可能是其增强心功能，治疗心
力衰竭的机制之一。
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β-actin
SERCA2a
NCX
假手术 模型 0.84 0.42 0.21 卡托普利
益气活血方/ (g·kg−1)