全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 5 期 2011 年 5 月

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云南青阳参遗传多样性的 AFLP 研究
王 斌，王德斌，翟书华，岑晓江，郭 庆，王定康*
昆明学院 生命科学与技术系，云南 昆明 650031
摘 要：目的 探讨云南青阳参居群内、居群间和种子间的遗传多样性。方法 利用 AFLP 分子标记技术检测云南不同生态
环境中青阳参居群间、居群内及不同植株间和同一植株不同双生蓇葖果的不同种子间遗传多样性。结果 居群内遗传多样性
比居群间遗传多样性丰富，居群间有效基因等位数（Ne）、Nei’s 基因多样性（H）、Shannon’s 指数（I）分别为 1.172、0.105、
0.161，居群内最高为 1.217、0.121、0.177；种子之间遗传多样性 H 值为 0.095，I 值为 0.145）高于双生蓇葖果间（H 值为
0.121，I 值为 0.182）。结论 云南青阳参遗传多样性较低，需要进行保护；在云南 3 个生态环境中，楚雄的青阳参遗传多样
性较其他地区丰富，AFLP 图谱中也出现与该生态环境相一致的特异条带。
关键词：青阳参；遗传多样性；AFLP 分子标记；不同生态环境；特异条带
中图分类号：R282.2 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)05 - 0985 - 06
Study on genetic diversity of Cynanchum otophyllum in Yunnan by AFLP
WANG Bin, WANG De-bin, ZHAI Shu-hua, CEN Xiao-jiang, GUO Qing, WANG Ding-kang
Department of Life Science and Technology, Kunming University, Kunming 650031, China
Abstract: Objective To approach genetic diversity of Cynanchum otophyllum among populations, within population and seeds.
Methods AFLP molecular markers were used to analyze the genetic diversity among populations in different ecological
environments, different plants, and different seeds of twins follicles. Results The results showed that the genetic diversity within
population was more abundant than that among populations. The effective number of alleles (Ne), Nei’s (1973) gene diversity (H) and
Shannon’s Information index (I) were 1.172, 0.105, and 0.161 within population, and 1.217, 0.121, and 0.177 among populations. The
seeds level had lower genetic diversity than twins’ follicles level, their H and I were 0.095, 0.145 and 0.121, 0.182, separately.
Conclusion The genetic diversity of C. otophyllum in Yunnan is so lower that the protection is needed. Otherwise, in the three
ecological environments discussed in Yunnan, C. otophyllum in the Chuxiong ecological environment has richer diversity than those in
other regions. According to the AFLP map, a specific band consistent with Chuxiong ecological environment has been found.
Key words: Cynanchum otophyllum Schneid; genetic diversity; AFLP molecular marker; different ecological environments; specific
bands

青阳参 Cynanchum otophyllum Schneid 隶属萝
科（Asclepiadaceae）鹅绒藤属（Cynanchum L.），
为我国特有的一种药用植物。其具有祛风除湿、解
毒镇痉、补气益肾、强筋壮骨、活血散瘀、祛痰止
咳、解狂犬毒等功效[1]，主要分布于湖南、广西、
云南、西藏，是云南省彝族、白族、纳西族等少数
民族的常用草药，为“青阳参片”和“排毒养颜胶
囊”的主要原料。青阳参民间用作滋补强壮以及腰
痛、风湿骨痛、小儿惊风症、头晕、耳鸣、心慌、
毒蛇咬伤等疾病的治疗，还可用于癫痫病、脑震荡
后遗症、美尼尔氏综合症等的治疗[2]。野生青阳参
由于生长环境条件差异较大，遗传基础多样，其品
质和成分差异较大[3]。由于野生药材来源的不足，
青阳参的人工繁育一直是人们关心的问题，然而，
关于青阳参的传粉机制仍不明确。王定康等[4]在观
察了青阳参的虫媒授粉过程后，推测青阳参的双生
蓇葖果可能由分别接受了不同来源花粉的花房发育
而来。因此，需要从多层次开展野生青阳参的遗传
多样性研究。以此作为青阳参保护、道地药材确立
的基础依据[5]。

收稿日期：2010-09-13
基金项目：教育部科学技术研究重点项目（209115）；云南省应用基础研究计划项目（2007C262M）；云南省教育厅科研基金重点项目（07Z10351）
作者简介：王 斌（1976—）男，云南昆明人，讲师，硕士，研究方向为分子生物学与生物技术。 E-mail: wangbbiomed@126.com
*通讯作者 王定康 E-mail: wdk117@163.com
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AFLP（amplify fragment length polymorphic,扩
增片段长度多态性）分子标记技术具有限制性片段
长度多态性（RFLP）的高重复性与 PCR 的高效性，
已广泛应用于遗传多样性分析、居群遗传结构分析、
系统分类和进化等方面研究[6-10]，本实验以青阳参
为材料，对不同来源地的不同居群、不同植株的双
生果和同一植株的双生果进行 AFLP 分析，对其遗
传多样性和双生果的父本来源进行初步探讨。
1 材料和方法
1.1 材料
挑选了 45 个青阳参植株样品，分别来自云南昆
明、宣威和楚雄，分为 4 组进行测试。选取不同产
地的不同植株，两个蓇葖果分为第 1 组（表 1）；在
同一植株（CX3）中取 5 份不同双生果的种子为第
2 组（含双生果 CX3-1 和 CX3-2 的种子萌发植株）
和第 3 组（含双生果 CX3-3 和 CX3-4 的种子萌发植
株。其中 CX3-1 和 CX3-2 属一个双生蓇葖果，CX3-1
含 CX3-1a、CX3-1b、CX3-1c、CX3-1d、CX3-1e 5
个种子；CX3-2 含 CX3-2a、CX3-2b、CX3-2c、
CX3-2d、CX3-2e 5 个种子；CX3-3 和 CX3-4 属一
个双生蓇葖果，CX3-3 含 CX3-3-a、CX3-3-b、
CX3-3c、CX3-3d、CX3-3e 5 个种子；CX3-4 含
CX3-4a、CX3-4b、CX3-4c、CX3-4d、CX3-4e 5 个
种子。按地理居群的不同划分为第 4 组（表 2）。每
一组植株样品在同一块聚丙烯酰胺凝胶上电泳。将
收集到的植株及果实的种子分别播种在花盆中，每
盆播种一个果实的所有种子，待萌发植株长至约 30
cm 时，取其叶片于−80 ℃冰箱中贮藏备用。种子
在有光条件下层积 1 周后转移到 25～15 ℃的黑暗
条件下萌发，在黑暗环境中层积 2～3周后转入 30～
20 ℃ 和 25～15 ℃进行变温处理[4]。
PTC—200 PCR 仪、Eppendorf 5415D 离心机、
Bio-Rad Power/PAC300 电泳系统、BioImaging UVP
紫外凝胶成像系统。用 ABI 3730xl 测序仪（北京三
博远志公司）完成测序。
AFLP 引物及接头均由上海生物工程有限公司
合成；化学试剂由博大泰克生物基因技术有限责任
公司提供；Mse I、ECOR I（10 U/μL）；T4 DNA Ligase
（30 U/μL）。
表 1 不同生态环境不同植株的双生蓇葖果
Table 1 Twins follicles of different plants
from various environments
母本株型 蓇葖果 1 萌发株 蓇葖果 2 萌发株
CXa a11 a12
CXb b11 b12
CXb b21 缺
CXc c11 c12
CXc c21 c22
CXd d11 d12
XWx x11 x12
表 2 不同生态环境的青阳参植株
Table 2 Plants of C. otophyllum from various ecological environments
植株编号 采集地 生态类型 经纬度 果实播种地点
XWY 宣威杨梅山 低海拔短日照 104°09′E, 26°11′N 昆明学院
XWH1 宣威小河边 低海拔短日照 104°09′E, 26°11′N 昆明学院
XWH2 宣威小河边 低海拔短日照 104°09′E, 26°11′N 昆明学院
XWD 宣威大落洞 低海拔短日照 104°09′E, 26°11′N 昆明学院
XWL 宣威大梁子 低海拔短日照 104°09′E, 26°11′N 昆明学院
KM1 昆明黑龙潭 高海拔长日照 102°75′E, 26°02′N 昆明学院
KM2 昆明石林 高海拔长日照 103°40′E, 24°23′N 昆明学院
KM3 昆明明朗水库 高海拔长日照 102°65′E, 24°43′N 昆明学院
CX1 楚雄武定 高海拔长日照 102°45′E, 25°58′N 楚雄农业学校
CX2 楚雄元谋 高海拔长日照 101°54′E, 25°01′N 楚雄农业学校
CX3 楚雄南华 高海拔长日照 101°26′E, 25°21′N 楚雄农业学校
CX4 楚雄姚安 高海拔长日照 101°24′E, 25°4′N 楚雄农业学校

1.2 AFLP 分析
1.2.1 酶切连接体系 参照 Shasany 等[6]的方法；
AFLP 反应体系及银染参考文献方法[11-13]。
1.2.2 选择性扩增引物组合 经 8 个 EcoRI 引物和
8 个 MseI 引物组成的 64 对引物组合筛选后，挑选
出选择性扩增引物组合为 E-ACC/M-CAA（E5M1）、
E-ACG/M-CTT（E6M8）、E-AGG/M-CTA（E7M3）
（表 3）。
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表 3 3 对选择性扩增引物组合
Table 3 Three pairs of AFLP selective amplification primer sequences
引 物 ECORI 酶切端口 MseI 酶切端口
E5M1 GACTGCGTACCAATTC ACC GATGAGTCCTGAGTAA CAA
E6M8 GACTGCGTACCAATTC ACG GATGAGTCCTGAGTAA CTT
E7M3 GACTGCGTACCAATTC AGG GATGAGTCCTGAGTAA CTA

1.3 数据分析
AFLP 带为显性标记，按照扩增条带的有无分
别记为“1”和“0”。其结果为一个二元矩阵，将其
输入 POPGENE1.32 软件处理分析，计算其多态性
位点数（PPL）、多态性位点比率（PPB）、有效等
位基因数（Ne）、Nei’s 基因多样性指数（H）、
Shannon’s 多样性指数（I），相似性大于 90%归为一
个遗传谱系[14]。采用 MEGA4.1 软件进行 UPGMA
聚类分析。
2 结果与分析
2.1 不同抽样类群的遗传多样性分析
通过 3 对引物分 4 组对 45 个样品扩增后，分析
遗传多样性。第 1 组检测不同植株上各 2 个蓇葖果
萌发植株，共扩增到 125 个位点，PPL 为 44 个，PPB
为 28.76%，Ne值为 1.207，H值为 0.121，I值为 0.182；
第 2、3 组 4 个蓇葖果 20 粒种子萌发株，共扩增到
126 个位点，PPL 为 35 个，PPB 值为 22.88%；第 4
组样品共扩增到 98 个位点，PPL 为 38 个，PPB 值
为 24.84%（图 1，表 4）。从 4 组结果来看，所采集
的青阳参样本主要分布于云南 3 个地区，其中楚雄
为主要药材产地，青阳参 Ne值、H 值、I 值分别位
于 1.164～1.207、0.095～1.121、0.141～0.182，表
明上述 3 个采样点青阳参遗传多样性较低。
2.1.1 不同植株双生果实遗传关系 通过对第 1 组
AFLP 结果的遗传距离和遗传相似性分析（表 5）和
UPGMA 聚类图（图 2），可以看出，所用材料聚为
3 个类群，其中，第 1 个类群和第 2 个类群之间遗
传距离为 0.091，区别不是很明显，第 2 个类群和第
3 个类群之间遗传距离为 0.123，表明 2、3 类群遗
传距离部分大于 0.1，差异显著。但从果实之间的遗
传距离来看，同一植株上的双生果之间均小于 0.1。
表明同一植株果实来源于不同父本的可能性较小。
2.1.2 相同植株不同双生果间的遗传背景分析 第
2、3 组实验材料来源于同一植株双生蓇葖果的 20
粒种子萌发植株，由聚类拓朴（图 3）可以看出，
同一植株的双生果之间存在遗传差异，但没有按蓇

图 1 AFLP 扩增图谱
Fig. 1 AFLP amplication maps
葖果进行严格聚类，表明蓇葖果种子之间遗传距离
较小，难以区分开，推测来源不同父本的可能性较
小。另外，每一个蓇葖果来源的种子（表 4）间遗
传多样性均显著低于不同植株间，进一步表明同一
植株上各个蓇葖果来源于不同花粉的可能性较小。
2.1.3 不同地理居群的遗传多样性 第 4 组材料来
自宣威、昆明、楚雄等 3 个不同生态环境，分别代
表较低海拔、较短日照、红壤、紫色土、冲积土、
水稻土为主的滇东北（宣威）生态类型；以较高海
拔、较长日照，以红壤为主的滇中生态类型和以更
高海拔、更长日照、以紫棕色和砂壤土为主的滇西
北生态类型。聚类结果获得两个明显的类群（图 4），
昆明和宣威聚为一类，位于昆明、楚雄交果的 KM3
采样点与楚雄划为同一居群。居群间遗传多样性 Ne
为 1.172、H 为 0.105、I 为 0.161；对于楚雄居群的
多样性，在第 1 组和第 4 组分析中出现了不同的结
果，见表 6，第 1 组中采样数为 11 个，第 4 组采样
数为 4 个，第 1 组 Ne、H、I 值分别为 1.217、0.121、
第 1 组 第 2 组
第 3 组 第 4 组
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表 4 所选样品按类群的 AFLP 分析结果
Table 4 Genetic variation for all populations by AFLP analysis
不同居群抽样 Ne H I PPL/个 PPB/%
双生果 1 1.188 0.105 0.154 33 21.57
双生果 2 1.214 0.121 0.178 39 25.49
第 1 组
双生果间 1.207 0.121 0.182 44 28.76
CX3-1 1.089 0.050 0.073 16 10.46
CX3-2 1.106 0.060 0.087 19 12.42
CX3-3 1.083 0.050 0.076 15 9.8
CX3-4 1.079 0.042 0.059 9 5.88
第 2 组

第 3 组
种子间 1.164 0.095 0.141 35 22.88
宣威居群 1.161 0.089 0.129 25 16.43
昆明居群 1.091 0.053 0.078 16 10.46
楚雄居群 1.080 0.046 0.069 15 9.8
第 4 组
居群间 1.172 0.105 0.161 38 24.84

表 5 第 1 组样品遗传相似性和遗传距离
Table 5 Genetic similarity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) of group one
a11 a12 b11 b12 b21 c11 c12 c21 c22 d11 d12 x11 x12
a11 0.063 0.044 0.029 0.089 0.069 0.067 0.086 0.094 0.102 0.099 0.095 0.124
a12 0.937 0.058 0.131 0.104 0.111 0.101 0.110 0.137 0.128 0.124 0.110 0.130
b11 0.957 0.942 0.053 0.065 0.064 0.052 0.071 0.089 0.097 0.094 0.079 0.099
b12 0.971 0.869 0.947 0.061 0.078 0.057 0.086 0.094 0.102 0.109 0.085 0.114
b21 0.911 0.896 0.935 0.939 0.054 0.060 0.069 0.087 0.113 0.110 0.087 0.106
c11 0.931 0.889 0.936 0.922 0.946 0.059 0.050 0.076 0.093 0.099 0.113 0.113
c12 0.933 0.900 0.948 0.943 0.940 0.941 0.056 0.074 0.053 0.049 0.093 0.122
c21 0.914 0.890 0.929 0.914 0.931 0.950 0.944 0.028 0.053 0.078 0.083 0.093
c22 0.906 0.863 0.911 0.906 0.913 0.924 0.926 0.972 0.052 0.096 0.073 0.082
d11 0.898 0.873 0.903 0.898 0.887 0.907 0.947 0.947 0.948 0.055 0.060 0.090
d12 0.901 0.876 0.906 0.891 0.890 0.901 0.952 0.922 0.904 0.945 0.036 0.076
x11 0.906 0.890 0.921 0.915 0.914 0.887 0.907 0.917 0.928 0.940 0.965 0.066
x12 0.876 0.870 0.901 0.886 0.894 0.887 0.878 0.907 0.918 0.910 0.924 0.934


图 2 UPGMA 法构建不同植株双生果的拓扑图
Fig. 2 UPGMA dendrogram for twins follicles of different plants
0.177；第 4 组检测结果则极低，为 1.080、0.046 和
0.069。从取样数来看，第 1 组结果更可信。

图 3 第 2、3 组材料合并后的进化树拓朴图
Fig. 3 Phylogenic tree of integrated second and third groups
a11
b12
b11
c12
b21
c11
c21
c22
d11
x12
d12
x11
a11
第 1 类群
第 2 类群
第 3 类群
CX3-1a
CX3-1b
CX3-4b
CX3-4c
CX3-3c
CX3-3d
CX3-3a
CX3-3b
CX3-3e
CX3-4a
CX3-4d
CX3-4e
CX3-1c
CX3-1e
CX3-1d
CX3-2b
CX3-2c
CX3-2a
CX3-2d
CX3-2e
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图 4 UPGMA 法构建的不同地理居群的系统图谱
Fig. 4 UPGMA dendrogram for various populations
2.2 与产地一致的分子标记
比较 12 个不同地区（表 2）青阳参材料的 3 对
引物的 AFLP 扩增图谱（图 5，引物为 E7M3），发
现第 4 组 AFLP 图谱中多处存在只有 KM3、CX1、
CX2、CX3、CX4 等样品才出现的特异性条带，这
可能与这些样品正好与楚雄产地相近的生态环境有
关，KM3 产地昆明明朗水库与楚雄接壤，生态环境
相近。E7M3 引物对 AFLP 图谱中存在 460、400、
280 bp 等多处特异性条带，对其中 460 bp 条带回收
并测序，得到与产地有关的候选分子标记。
3 讨论
3.1 双生蓇葖果及种子之间遗传背景
表 6 楚雄居群青阳参遗传多样性
Table 6 Genetic diversity of Chuxiong populations
居 群 Ne H I PPL/个 PPB/%
第 1 组中楚雄居群 1.217 0.121 0.177 39 25.49
第 4 组中楚雄居群 1.080 0.046 0.069 15 9.8


图 5 E7M3 引物组合的扩增多态性及 SCAR 标记片段
Fig. 5 Polymorphism and SCAR fragment of AFLP bands
obtained by selective amplification using primer
pair E7M3
利用 AFLP 方法，对青阳参不同生态环境，不
同植株不同双生蓇葖果的遗传多样性分析，结果表
明双生蓇葖果的遗传多样性小于植株水平。对同一
植株不同双生蓇葖果遗传多样性分析表明，种子水
平的遗传多样性远小于双生果之间，且聚类分析表
明，来自同一植株不同的双生蓇葖果间的种子萌发
株，并没有按双生蓇葖果的不同聚为不同的类群。
综合这些结果分析，同一植株青阳参双生蓇葖果来
自接受了不同花粉的花房的推测没有分子依据。即
同一植株不同果实父本来源的不同的假设不成立。
3.2 青阳参不同层次遗传多样性
对青阳参居群间、居群内及植株间、种子间遗
传多样性分析表明，居群间遗传多样性 Ne为 1.172、
H 为 0.105、I 为 0.161；居群内遗传多样性最高为
楚雄居群，Ne、H、I 值为 1.217、0.121、0.177；种
子间遗传多样性 Ne为 1.164、H 为 0.095、I 为 0.145。
居群内遗传多样性高于居群间，居群间高于同一母
本种子萌发株水平。与 RAPD[11]的研究结果一致，
青阳参中居群内多样性大于居群间多样性，推测生
态环境差异导致的变异低于居群内变异；同一植株
内不同种子聚类分析的进化树拓扑图与居群内相
似，同样分成 3 个分支，与 RAPD[15]结果一致，表
明遗传变异更多来自种子间。
居群间遗传多样性表明，虽然云南独特的生态
多样性导致了地理隔离，但是青阳参遗传多样性较
低。来自云南宣威、昆明和楚雄 3 个地理居群中，
楚雄居群遗传多样性较高。总体来说青阳参作为一
种天然药物，其遗传资源基础较狭窄。
XWD
XWL
XWH2
XWH1
XWY
KM1
KM2
KM3
CX1
CX2
CX3
CX4
0.030 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005 .000
XWY XWH1 XWH2 XWD XWL KM1 KM2 KM3 CX1 CX2 CX3 CX4
460 bp
400 bp
280 bp
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3.3 遗传多样性与分子标记
杨竹雅等[15]进行的青阳参 RAPD 的遗传多样
性研究中，比较了云南丽江、下关、洱源、楚雄等
地青阳参材料，发现楚雄长日照和高海拔、四季温
差变化不大，青阳参的居群遗传多样性最丰富，且
楚雄居群及丽江居群与其他产地分别聚为不同的类
群。AFLP 分析结果表明，楚雄居群遗传多样性最
丰富，且有许多特异性条带。通过回收测序，成功
地获得一条代表楚雄居群的特异性序列，可作为楚
雄居群的分子标记。
居群间的聚类分析将楚雄青阳参（其中，KM3
产地与楚雄接壤，生态环境一致）与其他地区居群
明显分开，进一步表明楚雄生态环境对青阳参的独
特意义。不同居群青阳参在青阳参苷、多糖硫酸
酯[16]等主要药用成分方面是否存在质的区别，尚待
进一步研究。
参考文献
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