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不同来源丹参种质遗传多样性的 SRAP 标记分析
王维婷,单成钢, 倪大鹏,王志芬* *
(山东省农业科学院 药用植物研究中心,山东 济南 250100)
摘 要:目的 解决丹参育种工作中的丹参种质资源的鉴别与分类。方法 利用 SRAP 分子标记技术对 48 个不
同来源的丹参种质进行了遗传多态性的分析,并对其进行了类群的划分。结果 利用筛选到的 15 对 SRAP 引物
组合从材料中检测到了 120 个等位位点。利用不加权成对群算术平均法 ( UPGMA) 对丹参种质进行聚类分析可
以将其分为两大类群,每一类群包含 3 个亚群。结论 不同丹参种群间遗传距离与空间距离之间的关系较为复
杂,不同地区间丹参种质的遗传分化不均衡。随着丹参种质驯化程度的增加,种质间的遗传距离有所增加。
关键词:丹参; SRAP; 遗传多样性分析
中图分类号: R282 7 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2010) 04-0632-04
SRAP Analysis of genetic diversity about germplasm in Salvia miltiorrhiza from different sources
WANG We-i t ing, SHAN Cheng-gang, NI Da-peng, WANG Zh-i fen
( Resear ch Center o f Medicinal Plant, Shandong Academy of Ag ricultur al Sciences, Jinan 250100, China)
Abstract: Objective To solve the key problem on classif icat ion and ident if ication of Salv ia mil t iorr hi-
z a, w hich w as ur gent ly needed to be so lved in breeding of S. mi lt ior rhi z a. Methods Sequence-related
amplif ied polymorphism ( SRAP) w as car ried out to analyze the genet ic v ar iat ion of 48 germplasm in S.
mil t iorr hiz a f rom dif ferent sources. Results The data show d that 120 al leles had been found using 15
pairs of primer w hich had been selected f rom 100 pairs. Unw eighted pair-group method w ith ar ithmet ical
av er ages ( U PGMA) cluster analy sis w as used to classify the germplasm of S. mi l tiorr hi z a. Tw o g roups
could be div ided and three subgroups w ere contained in every group. Conclusion A complex relat ionship
ex ists betw een the genet ic distance and space distance of dif ferernt S. mi lt ior rhi z a. T he genet ic div ersity
in different g eographical populations of S. m il tiorr hi z a in China is rich. The results show that the genetic
distance of different g ermplasm wil l increase w ith the stag e of domesticat ion.
Key words: Salvia mi l tior r hi z a Bunge; sequence-related amplif ied po lymo rphism ( SRAP) ; analysis
of genet ic diversity
丹参 Salv ia mil tiorr hiz a Bunge为常异花授粉
植物, 其种内的遗传多样性极为丰富。不同产地丹
参种质的产量和药用成分量差异很大, 严重影响丹
参药材质量的稳定性, 给丹参的规范化生产带来多
重困难,因此有必要对现有丹参种质资源进行分类
鉴别和亲缘关系的研究。
近年来, 中草药指纹图谱研究领域受到普遍关
注,通过生化标记对丹参种质进行分类的研究报道
632 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 4 期 2010 年 4 月
收稿日期: 2009-08-20 基金项目:国家航天工程项目 ( 2006H T 10-0165) ; 山东省良种工程项目 (鲁科农社字[ 2008] 167号) ; 山东省农科院高技术自主创新基金项目 ( 2007YCX012) ; 山东省农科院博士基金项目 ( 2006YBS003)作者简介:王维婷( 1981 ) ,女,山东莱州人,山东农科院药用植物研究中心博士后,主要从事丹参分子生物学研究。
E-mail: w angw eitin g0619@ 163. com
* 通讯作者 王志芬 T el: 0531- 83179283 E-mail: w zfchm@ 163. com
较多。徐德然等 [ 1]对不同产地丹参脂溶性成分指纹
图谱进行比较, 发现采用无性繁殖的相同产地的家
种丹参指纹图谱具有很好的相似性,相应的品系药
材可以归入同一类。而野生丹参则不可按其地理区
域进行归类。但是由于丹参药材质量受环境影响较
大[ 2] , 利用生化标记的方法只能对成品药材的质量
进行精确鉴定, 不有精确的定位种质的来源和同批
材料的种质的一致性, 因此该类指纹图谱在丹参育
种工作中的作用有限。
近些年, 有关丹参基因工程方面的研究有报
道[ 3] ,关于丹参种质的分类鉴别、遗传多态性及有效
成分的分子标记研究报道较少。郭宝林等[ 4] 利用
RAPD 分析了 9 个居群的 44 个丹参样本, 认为丹
参居群内遗传多样性十分丰富, 地区间居群的遗传
分化不均衡,但 RAPD 技术稳定性差,扩增产率低。
温春秀等[ 5] 利用 AFLP 方法分析了 55 份丹参种
质,发现不同产地的丹参遗传特性很不一致, 这与郭
宝林等的研究结果基本吻合, 但四川中江丹参与山
东丹参具有很大的相似性, 此与郭宝林等的结果不
一致。与 RA PD 技术相比, AFLP 在产生的总条带
数、多态性条带、多态率、每一引物和每一份种质产
生的多态性条带都明显高于 RAPD分析方法,表现
出高效、快速、准确和多态性丰富的优点。但 AFLP
操作步骤繁琐、技术难度高。汪红等[ 6] 研究丹参
IT S 片段的遗传多样性, 找到了两段可以作为中药
丹参分子鉴定的标记, 但由于唇形科是一个高度进
化的类群, ITS 序列分析仅反映了鼠尾草属植物遗
传背景的一个方面, 并且 IT S 成本较高,耗费较大。
与其他几种分子标记技术相比, SRAP 标记技术具
有简便、稳定、中等产率、便于克隆、测序目标片段的
特点。李廷春等[ 7] 以丹参总 DNA 为模板, 建立并
优化了丹参 SRAP 反应体系,为丹参植物种质资源
的鉴别及功能基因的研究奠定了基础。
本研究从来源于 30个不同产地的 600份材料中
挑选性状一致,长势良好的优系,利用扦插手段, 获得
了近百个丹参无性繁殖系作为丹参育种的种质资源,
利用 SRAP 技术对其中 48 份栽培性状稳定,表现优
良的材料进行遗传多态性分析,对解决当前丹参种质
资源混杂和指导丹参品种选育具有重要意义。
1 材料与方法
1 1 试验材料: 本研究所采用的试验材料见表 1。
每种材料随机挑选 3株, 进行取样。
1 2 试验方法
1 2 1 总 DNA 的提取: 利用 CT AB 法对丹参
DNA 进行提取 [ 7]。
1 2 2 SRAP 扩增引物:引物序列见表 2。
表 1 试验材料
Table 1 Tested Materials
材料来源 材料来源 材料来源 材料来源 材料来源
Y 沂山大官乡 Y山东平邑 Z泰山白花 Y 山东九山 Z四川中江小叶
Y 沂山辛庄 Z山东平邑 1 BY 泰山大津口 Z山东九山 Z四川中江大叶
Y 沂山北门 Z平邑魏刘 Y蒙阴垛庄 1 Z山东临朐 Z山西运城
Y 沂山南坡 Z平邑毛家庄 Y蒙阴垛庄 2 Z山东曲阜 Z浙江磐安
BY沂山北门 Z山东平邑 2 BY 蒙阴垛庄 1 Z安徽毫州 Z河北安国
BY沂山吕匣 Z江苏东台 1 BY 蒙阴垛庄 2 Z安徽毫州 2 Z河北安国 2
BY山东沂山 Z江苏东台 2 Y鲁山山顶 Z河南南阳 1 Z陕西商洛
Z沂山沙沟镇 Y泰山白花 Y鲁山南坡 Z河南南阳 2 Z陕西渭南
Z沂山南坡 Y泰山紫花 Y山东崂山 Z河南卢氏 1
Y 平邑蒙山 Y泰山天柱峰 BY 山东崂山 Z河南卢氏 2
Y:野生种质,为野生状态下收集的种质 BY: 半野生种质, 为
野生状态下收集后栽培驯化不足 5 年的种质 Z:栽培种质,为栽培
驯化 5年以上的种质
Y-w ild germplasm w hich h ad been collected f rom w ild envir on-
ment w ithout dom est icated BY-im perfect ly domes ticated germ-
plasm w hich had been collected from wild en vi ronmen t with domes t-i
cated no more than 5 years Z-cu lt ivat ion g ermplasm w ith cult ivated
more than five y ears
表 2 试验所用引物的序列
Table 2 Sequences of primers used in this study
引物编号 引物序列 引物编号 引物序列
me1 TGAGTCCAAACCGGAT A em1 GACTGCGT ACGAATT AAT
me3 TGAGTCCAAACCGGAAT em2 GACTGCGT ACGAATT TGC
me5 TGAGTCCAAACCGGAAG em3 GACTGCGT ACGAATT GAC
me6 TGAGTCCAAACCGGTAG em4 GACTGCGT ACGAATT TGA
me7 TGAGTCCAAACCGGTTG em5 GACTGCGT ACGAATT AAC
me8 TGAGTCCAAACCGGTGT em6 GACTGCGT ACGAATT GCA
me9 TGAGTCCAAACCGGTCA em7 GACTGCGT ACGAATT ATG
me11 TGAGTCCAAACCGGGCC em8 GACTGCGT ACGAATT AGC
me15 TGAGTCCAAACCGGACG em10 GACTGCGT ACGAATT TAG
me18 CTGGCGAACT CCGGATG em15 GACTGCGT ACGAATT CTG
me19 GGT GAACGCTCCGGAAG em18 AGGCGGTTGTCAATTGAC
me20 AGCGAGCAAGCCGGTGG em19 T GTGGTCCGCAAATTTAG
1 2 3 SRA P 反应程序: 94 预变性 2 min, 94
变性 1 m in, 35 退火 1 min, 72 延伸 1 m in,循
环 5次, 94 变性 1 min, 55 退火 1 min, 72
延伸 1 min,循环 35次。扩增产物在 6% 的聚丙烯
酰胺凝胶中进行电泳后,银染并照相。
1 2 4 数据处理:样品的电泳条带按有或无进行记
录,有带赋值为 1(强带和弱带同记) ,无带记为 2。
2 结果与分析
2 1 引物筛选:本研究组配了 100 对引物组合,从
中筛选得到 15 对多态性条带最清晰的引物组合。
利用这 15 对 SRAP 引物组合从 48 份丹参种质中
检测到了 120 个等位位点,每对引物可检测到的位
点为 3~ 17 个,平均 8 个。在 120 条 DNA 扩增条
633中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 4 期 2010 年 4 月
带中有 109 条带呈多态性, 占所观察到的总条带的
90 83%。从上述分析发现, 48 个不同来源的丹参
具有丰富的遗传多态性, 图 1 为引物 me9~ em8 的
扩增结果。
M-m ark er 1- Z河南南阳 1 2- Z河南南阳 2 3-Y 泰山白花
4-Y 泰山紫花 5-Y 泰山天柱峰 6-Z 河南卢氏 1 7-Z 河南
卢氏 2 8-Y 沂山大官乡 9-Y 沂山辛庄 10-BY 沂山北门
11-BY 沂山吕匣 12-BY 山东沂山 13-Y 沂山北门 14-Y
沂山南坡 15-Y 山东平邑 16-Z 山东平邑 1 17-Z平邑
魏刘 18-Z 平邑毛家庄 19-Z山东平邑 2
M-m ark er 1-Z Henan Nanyang 1 2-H enna Nayang 2 3-Y
Taishan Baih ua 4-Y T aishan Zihu a 5- Y T aishan T ianzhufeng
6-Z H enna Lushi 1 7-Z H enn a Lush i 2 8- Y Yishan Daguan x-
iang 9-Y Yishan Xinzh uan g 10-BY Yishan Beimen 11-BY
Yishan Lxia 12-BY Shandon g Yish an 13-Y Yishan Beimen
14-Y Yishan Nanpo 15-Y Shandong Pin gyi 16-Z Shandong
Pin gyi 1 17- Z Pingyi Weil iu 18-Z Pin gyi Maojiazhuang
19-Z Shandon g Pingyi 2
图 1 引物 me9~ em8 组合对不同丹参种质的扩增结果
Fig. 1 PCR Results from primer pair me9 em8
to germplasm of S. miltiorrhiza
f rom diff erent sources
2 2 不同来源丹参遗传聚类分析: 目前, 丹参的育
种工作处于起步阶段, 不同来源丹参之间的亲缘关
系尚不明确,急需对其进行深入研究。利用 GD 值
按照不加权成对群算术平均法 ( U PGMA) 对 48 份
丹参种质进行遗传相似性的聚类分析, 见图 2。
聚类结果表明, 48 份丹参种质按其遗传距离可
以分为两大类群,每一类群包含 3个亚群,类群划分
结果见表 3。聚类结果明确了不同来源丹参之间的
亲缘关系,可为丹参品种改良及亲本选配提供依据。
从聚类结果里看,各地区丹参种质的遗传多样性不
同,其中来自江苏东台和河北安国的栽培品种按地
区来源可被划分在同一亚群中, 说明这些地区栽培
品种的遗传多样性相对简单, 来源于山东泰山的野
生及半野生品种均可被划分在同一亚群中, 也说明
泰山地区的野生丹参种质遗传背景较为单一。而来
自四川中江的丹参种质被划分在同一类群中的两个
亚群之中,来自河南南阳的丹参种质被划分在不同
图 2 48 份不同来源丹参种质遗传聚类分析图
Fig. 2 Dendrogram obtained using 48 germplasm in S.
miltiorrhiza varieties with SRAP marker
的两大类群中,甚至来自山东沂山的野生、半野生及
栽培品种则分布在两大类群的 4 个亚群当中,说明
这些地区的丹参种质遗传多样性丰富。此外,丹参
材料按其驯化阶段可以划分为野生、半野生(野生引
种栽培 5年以下)、栽培 3 种类型, 这 3 种驯化阶段
的丹参材料在两大类群中均有分布。
2 3 不同驯化阶段丹参遗传多样性分析: 目前, 不
同驯化阶段的材料其遗传基础差异程度是否不同尚
未见报道。本研究采用的材料包括 15个野生种质,
7个半野生种质和 26个栽培种质, 每个种质随机挑
选 3株取样, 对其种间遗传距离进行分析 (表 4)。
由表中可以看出, 随着丹参种质驯化程度的增加,种
质间的遗传距离逐渐增加, 但变化不大。
3 讨论与结论
SRAP是于20 01年建立的新型分子标记。目
前, SRA P 技术已被成功应用于栽培黄连 [ 9]、红
花[ 1 0]等药用植物的遗传多样性和重要性状基因连
634 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 4 期 2010 年 4 月
表 3 丹参种质遗传聚类结果
Table 3 Cluster result of S. miltiorrhiza germplasm
名称 类群 类群
亚群 1 Y 沂山大官乡、Y沂山北门、Y 鲁山山顶、Z河
南南阳 2、Y 泰山白花、Y 泰山紫花、Z泰山
白花、Y沂山辛庄、Y 泰山天柱峰、Z山西运
城、Z沂山南坡、Y 山东九山、Z山东曲阜、Z
安徽亳州 2、Z四川中江大叶、BY 泰山大津
口
BY 沂山北门、Y 平邑
蒙山
亚群 2 Y 沂山南坡、Z山东平邑 2、Z陕西商洛、BY 沂
山吕匣、Z河南卢氏 2、Y 平邑野生、Y 蒙阴
垛庄、Y 山东崂山、Z河南卢氏 1、Z四川中
江小叶
BY 山东沂山、BY 蒙阴
垛庄 2、Z 沂山 沙沟
镇、Z 平邑魏刘、Z 河
北安国 1、Z 山 东九
山、Y 鲁山南坡、Z陕
西渭南、Z 河北安国
2、Y 蒙阴垛庄 1、Z河
南南阳 1、Z 浙 江磐
安、Z山东平邑 1
亚群 3 Z平邑毛家庄、Z山东临朐、BY 蒙阴垛庄、Z安
徽亳州、BY 山东崂山
Z江苏东台 1、Z江苏东
台 2
表 4 不同驯化阶段丹参种质间的平均遗传距离
Table 4 Average genetic distance between S. miltiorrhiza
under diff erent stages of domestication
驯化阶段 平均遗传距离 品种数量 等位位点 平均位点数
野生 0 453 15 248 3 875
半野生 0 455 7 106 1 656
栽培 0 494 26 549 8 578
锁标记的研究。李廷春等[ 7] 以丹参总 DNA 为模
板,建立并优化了丹参 SRA P 反应体系,为丹参植
物种质资源的鉴别及功能基因的研究奠定了基础。
同时,李廷春等 [ 11]利用该技术对 6个丹参材料的遗
传多样性和亲缘关系进行分析,初步证明了 SRAP
分析方法具有较高的准确性和可靠性。但该研究所
应用的丹参种质较少, 不足以为丹参育种工作提供
亲本组配的理论依据 [ 11]。
根据建立的 U PGMA 聚类图,本研究所采用的
48份丹参种质可以分为两大类群, 其中每个类群可
以划分为 3个亚群。李廷春[ 11] 、徐红 [ 12]等人的研究
结果认为,丹参种群间的遗传关系较为复杂, 遗传距
离与空间距离并不存在可见的相关性。本研究结果
与其不完全一致,认为不同产地的丹参种质其遗传
多样性不同,遗传距离与空间距离存在着一定程度
上相关。江苏东台、河北安国及山东泰山的丹参种
质,其遗传背景较为单一, 而山东沂山、山东平邑和
山东蒙阴的丹参种质其遗传多样性极为丰富,不同
丹参种群间遗传距离与空间距离之间的关系较为复
杂,这可能与近年来丹参各主要产区的引种和人工
选育有关。同时, 本研究结果与郭宝林等人[ 4] 的研
究结果在一定程度上相似,均能反映出不同地区间
丹参种质的遗传分化不均衡。
从本研究结果中可以看出, 随着丹参驯化程度
的增加其种间遗传距离也有所增加。由于丹参为常
异花授粉植物,人工选择及杂交育种均有可能造成
丹参种质间的遗传距离增大,从而导致某些隐性性
状不表达,据此推测不规范的丹参品种选育方式可
能会造成栽培丹参药用品质的下降。
上述研究结果为丹参种质的分类、鉴定和品种
选育提供了重要的研究依据。通过对不同驯化阶段
丹参种内遗传距离的比较,推测不规范的丹参品种
选育方法可能造成栽培丹参药用品质的下降,因此
在人工选择或培育丹参品种时需要改良现有的选择
方法及杂交技术。
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