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止颤胶囊对帕金森模型大鼠脑内单胺氧化酶 B的影响
刘亚珍1 ,施雨露2 ,刘永茂2 ,万 全3¹
( 11 吉林大学第一医院 药剂科,吉林 长春 130021; 21 吉林大学白求恩医学院, 吉林 长春 130021;
31 吉林大学生命科学学院 生物技术系,吉林 长春 130051)
摘 要: 目的 探讨止颤胶囊对帕金森病 ( PD ) 模型大鼠脑内单胺氧化酶 B ( MAO-B) 表达的调节作用。方法
应用脑内定位注射 6-羟基多巴胺 ( 6-OHDA) 方法制备部分损伤 PD 模型;采用逆转录聚合酶链反应 ( RT-PCR )
对 PD 大鼠脑内 MAO-B mRNA 的表达进行分析;采用生化法对脑内 MAO-B 活性进行测定。结果 从给药后第
10 天开始, 模型组 MAO-B mRNA 表达明显增加,扩增产物的量为止颤胶囊的 41 728 倍,远远高于止颤胶囊组和
对照组; M AO-B 的活性检测结果与 RT-PCR 分析结果一致,止颤胶囊对大鼠脑内 M AO-B 活性抑制率大于 40%。
结论 止颤胶囊对 PD 大鼠脑内 MAO-B mRNA 表达和活性有下调作用, 可使 6-OHDA 引起的脑内 MAO-B mR-
NA 高表达得到抑制。
关键词: 止颤胶囊; 帕金森病; 单胺氧化酶 B ( MAO-B)
中图分类号: R2851 5 文献标识码: A 文章编号: 0253- 2670( 2010) 06- 0963- 03
帕金森病 ( Parkinsoncs disease, PD) 是一种神
经系统疾病, 多发于中老年,呈缓慢的神经元细胞变
性。主要病理特点是黑质致密区多巴胺 ( DA ) 能
神经元严重缺失[ 1]。6-羟基多巴胺 ( 6-OHDA ) 对
黑质 DA 能神经元的损伤程度与注入的剂量有关。
调整 6-OHDA 的用量可相对保留较多的 DA 能神
经元, 从而制造部分损伤的 PD 大鼠模型, 以模拟
中、早期 PD 病人的症状 [ 2]。单胺氧化酶 ( mono-
amine oxidase, MAO) 在大脑和周围神经组织中催
化生物体产生的胺, 氧化脱氨产生过氧化氢[ 3]。因
此, MA O-B 活力的变化与 PD 密切相关。
以滋养肝肾, 育阴熄风作为根本法则, 由生黄
芪、人参、白首乌、女真子、续断、厚朴、川芍为主要组
分的止颤胶囊方药具有改善大鼠旋转行为、提高黑
质纹状体 DA 量和抗自由基酶活性的作用,临床应
用也取得一定疗效。研究表明止颤胶囊对 PD模型
大鼠血液中超氧化物歧化酶 ( SOD )、丙二醛
( MDA) 的量以及小鼠免疫功能均有影响[ 4~ 6]。本
实验主要研究止颤胶囊对 PD 模型大鼠脑内 MAO-
B 基因表达及活性变化的影响, 为止颤胶囊治疗 PD
研究提供理论依据。
1 材料与方法
11 1 药品和试剂:止颤胶囊由长春中医学院盖国忠
教授研制; 6- OHDA 是美国 Sigma 公司产品; T rizol
试剂为美国 Life Technolog ics; 逆转录试剂盒、Taq
酶、DL-2000 M ar ker、DEPC、琼脂糖均由日 本
Takar a 生物工程公司提供; MA O-B 和 B- act in PCR
引物由上海生物工程技术服务公司合成; 溴乙锭为
瑞士 Fluka 产品,其他试剂均为国产分析纯。
11 2 仪器: 日本 Narishig e 公司生产的 WDT ) Ò
脑立体定位仪; 日本岛津公司生产的 UV ) 7200 紫
外分光光度计; 美国 PE 公司生产的 9700 型 PCR
仪;杭州天能生物科技有限公司生产的凝胶成像系
统;德国 Heraeus 公司生产的 Biofuge pr imo R 高
温离心机等。
11 3 动物: SD 大鼠 150~ 160 g, 白求恩医学院实
验动物中心生产,清洁级动物。
11 4 PD 动物模型制备: 参照陈生弟等[ 7] 方法, 选
用体质量 150~ 160 g SD 大鼠, 麻醉后固定于立体
定向仪上,确定黑质坐标: 前囱后 4. 4 mm , 中线旁
开 1. 1 mm, 硬膜下 7. 5 mm, 以微量注射器向上述
坐标点注入 6-OHDA 10 LL/ min,注药后留针 1~ 5
#963#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 6 期 2010年 6月
¹ 收稿日期: 2009-11-27 基金项目:吉林省自然科学基金资助项目 ( 2000006)作者简介:刘亚珍( 1959 ) ) ,女,吉林省长春市人,主管药师,研究方向为中药治疗帕金森病作用机制。
Tel: ( 0431) 85619709 E-mail: l ymmm8338@ sin a. com
min,缝合伤口后抗感染治疗 3~ 5 d,两周后大鼠 sc
阿朴吗啡 0. 25 mg / kg,诱发大鼠旋转, 记录 40 min
总的旋转次数及方向, 确定旋转模型成功的大鼠。
11 5 分组及给药:实验分 3组, 包括对照组、模型组
和止颤胶囊试验组。止颤胶囊试验组: PD 模型大
鼠 30 只, 每天 ig 给予止颤胶囊 2 g / kg。对照组 10
只和模型组 30 只大鼠,每天 ig 给予等体积的生理
盐水。自给药开始,每隔 10 天为一个时间点,每个
时间点模型组和给药组各随机取 5只, 处死后超净
工作台内无菌取脑组织, - 80 e 保存备用。
11 6 MAO-B 的 mRNA 表达的 RT-PCR 分析
11 61 1 合成的 PCR 引物序列:见表 1。
表 1 MAO-B和 B-actin引物序列
Table 1 Primer sequence of MAO-B andB-actin
基因名称 引物核苷酸序列 片段长度/ bp
MAO-B 正向: 3c-AGAAGCTCCAGT TGCCTACACG-5c 268
反向: 3c-AGAGAAATCTGAGAGTGTTCAT-5c
B-actin 正向: 3c-TCCGGCATGT GCAAGGCCGG-3c 570
反向: 3c-AGAGGATGCGGCAGTGGCCA-3c
11 61 2 脑内总 RNA 的制备和鉴定:按照 T rizol试
剂盒说明提取脑内总 RNA。每个脑组织标本取约
10 mg 于玻璃匀浆器中,加 Trizo l试剂 1 mL, 在冰
上将组织匀浆。再将组织裂解液转移至 11 5 mL
EP 管中,并用 1 mL 枪头反复吹打直至裂解液中无
明显沉淀,在室温下放置 5 min, 使得核酸蛋白复合
物完全分离; 各组裂解液中各加入氯仿 01 3 mL,盖
紧离心管管盖, 用手上下振荡 15 s, 室温静置
3 min; 12 000 @ g、4 e 离心 15 min,小心吸取无色
上清水相移至另一离心管中,加入等体积的异丙醇,
轻轻混匀, 室温静置 10 min; 12 000 @ g、4 e 离心
10 min,弃上清,缓慢沿管壁加入 1 mL 75% 乙醇,
轻轻混匀。12 000 @ g、4 e 离心 10 min,小心吸尽
上清,室温干燥沉淀 2~ 5 min,每管加入 50 LL 的
无 RNase水溶解 RNA 沉淀,待完全溶解后于 - 70
e 保存;吸取 RNA 样品各 5 LL,加载到 1% 琼脂
糖凝胶上进行电泳, EB 染色分析提取细胞总 RNA
的纯度。吸取 RNA 样品各 5 LL, 用 1 @ TE 缓冲液
稀释样品 100倍,测定样品在 260 nm 和 280 nm 的
吸光度值确定 RNA 的纯度。
11 61 3 逆转录反应将 RNA 逆转录为 cDNA: 按
GenAmp RNA PCR 试剂盒操作说明, 取 01 5 mL
EP 管, 按下列次序加入溶液: dN TPs ( 10 mmol/ L )
40 LL、RNase 抑制剂 01 5 LL、随机引物 01 5 LL、总
RNA 2 LL, 点动离心,于 70 e 孵育 5 min, 冰浴冷
却后,再加入逆转录酶 01 5 LL, 5 @ 逆转录缓冲液
51 0 LL, DEPC 水 101 5 LL。稍离心, 37 e 孵育 60
min, 90 e 孵育 5 min 后,迅速冰浴冷却,此即 cD-
NA 溶液。
11 61 4 PCR 反应: 将正、反向引物用无 RN ase 无
菌水稀释为 10 pmol/ L, 按 PCR反应体系加入下列
溶液至 01 2 mL EP 管中: 10 @ T aq酶缓冲液 5 LL、
dNT Ps ( 10 mmo l/ L ) 2 LL、目的基因正反向引物各
10 LL、内参正反向引物各 5 LL、cDNA 溶液 5 LL、
Taq 酶 3 LL、DEPC 处理水 5 LL、总反应体积 50
LL, 先 94 e 预变性 5 min, 94 e 变性 1 min, 58 e
退火 1 min, 72 e 延伸 2 min,完成 35 个循环,最后
72 e 延伸 10 min。
11 61 5 产物分析:吸取待测 PCR 扩增产物 10 LL,
加 6 @样品缓冲液 2 LL, 混合后, 分别加到各上样
孔内;上 01 5% 琼脂糖凝胶电泳, 电压为 10 V/ cm,
在低温条件下电泳 30 min,通过凝胶成像系统进行
拍照,记录结果。
11 7 大鼠脑组织 MAO-B 活性测定: 参照王本祥
等[ 8]方法测定脑组织中 MAO-B活性。酶活力计算
以 3 h 产生 01 01个吸光度值 ( 242 nm ) 改变为一
个活性单位,表示为 U / ( mg # h)。计算抑制率[抑
制率= (模型组酶活力- 止颤胶囊组酶活力) /模型
组酶活力 @ 100%]。
2 实验结果
21 1 止颤胶囊对 PD 模型大鼠脑内 MAO-B mR-
NA 表达的影响:利用 RT-PCR 方法对 PD 模型大
鼠脑内 MAO-B mRNA 表达情况进行检测分析, 用
B-act in 为内标基因, 结果表明从给药后第 10 天的
时间点开始,模型组 MAO-B 基因明显增加, 扩增产
物的量远远高于止颤胶囊组和对照组 (只测定 0 d
结果) ,并且在观察期内持续高表达。而止颤胶囊组
在给药后第 10天的时间点 MAO-B mRNA 表达最
高,之后随着用药时间的延长, M AO-B mRNA 表达
量逐渐降低,到第 50天的时间点时几乎与对照组相
当。RT-PCR 产物的电泳结果见图 1。
图 1 大鼠脑内 MAO-B mRNA 表达
Fig. 1 MAO-B mRNA Expression in brain of rats
#964# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 6 期 2010年 6月
21 2 止颤胶囊对 PD 模型大鼠脑内 MAO-B 活性
的影响: 实验各组大鼠脑中 MAO-B 活性检测分析
的统计学结果见表 2。对照组 0 d MAO-B 活性为
( 351 354 ? 01 596) U/ ( mg # h ) ( n = 10) , 模型组
MAO-B 活性明显高于对照组; 止颤胶囊组大鼠脑
MAO-B活性明显低于模型组,止颤胶囊对 MAO-B
活性的抑制率均值大于 40%, 至给药的第 50 天时
已降到接近对照组水平。
表 2 止颤胶囊对大鼠脑组织 MAO- B活性的影响 ( x? s, n= 5)
Table 2 Effect of Shiver-stopping Capsula on MAO-B activity in brain of rats (x ? s, n= 5)
组别 MAO-B/ ( U # mg
- 1 # h- 1)
0 d 10 d 20 d 30 d 40 d 50 d
模型 851 384 ? 11 015* * 861 369 ? 11 208* * 891 284 ? 1 635* * 851 376? 11 289* * 831 216? 11 365* * 811 342? 11 280* *
止颤胶囊 851 384 ? 11 015* * 551 442 ? 11 009* * v v 531 382 ? 01 989* * v v 511 349? 11 386* * v v 451 263? 11 568* * v v 411 487? 11 634* * v v
与对照组比较: * * P< 01 01; 与模型组比较: v v P < 01 01
* * P < 01 01 v s cont rol group; v v P < 01 01 v s model group
3 讨论
据报道, 6-OHDA 部分损伤大鼠模型比较稳
定,适合各种程度 PD的研究 [ 7]。本研究将 MAO-B
mRNA 表达和活性作为判断 PD 大鼠模型形成及
症状恢复的生化判定指标来分析止颤胶囊对 PD 大
鼠的治疗作用。从实验结果看, 从给药后第 10天开
始, PD 模型组 MAO-B mRNA 表达明显增加, 并且
在近两个月的时间内持续高表达。而止颤胶囊组在
给药后第 10 天的 MAO-B mRNA 表达最高, 为对
照组的 41 728 倍,之后随着用药时间的加长, MAO-
B mRNA 表达量逐渐降低, 至第 50天时几乎与对
照组相当。活性检测结果与 RT-PCR 分析结果一
致。说明用止颤胶囊后对帕金森病大鼠脑内 MAO-B
的 mRNA 表达和活性均有下调作用, 可缓解由 6-
OHDA 引起的 MAO-B 表达增高。这些结果充分说
明止颤胶囊在一定程度上缓解了 PD 大鼠的临床症
状,使 6-OHDA 引起的脑内 MAO-B 高表达得到抑
制,并且随给药时间的加长, 抑制率不断升高。提示
止颤胶囊作为 PD 治疗中药,有一定开发价值。
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中药辅助治疗带状疱疹后遗神经痛疗效分析
杨丽姣,李繁荣¹ ,陈天葆
(杭州市第三人民医院,浙江 杭州 310009)
摘 要:目的 观察带疱痛方辅助治疗带状疱疹后遗神经痛的疗效。方法 维生素新 B1片 102 例患者随机分成
治疗组和对照组, 均予以神经阻滞治疗 4 周,治疗组服用带疱痛方 ,对照组服用弥可保片和呋喃硫胺片, 口服 8 周,
分别于治疗2、4、6、8 周后观察疼痛视觉模拟评分 ( VAS) 和生活质量评分 ( QLS) 的变化。结果 8 周后治疗组的
VAS 评分和 QLS 评分与对照组比较有显著差异, 说明带疱痛方治疗的远期疗效明显优于对照组。结论 传统中
药结合神经阻滞治疗带状疱疹后遗神经痛疗效显著,值得推广。
关键词: 带状疱疹后遗神经痛; 辅助治疗; 神经阻滞
中图分类号: R2861 1 文献标识码: A 文章编号: 0253- 2670( 2010) 06- 0965- 03
#965#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 6 期 2010年 6月
¹ 收稿日期: 2009-11-20 作者简介:杨丽姣( 1978 ) ) ,女,学士,主管中药师,主要从事中药制剂研究。E-m ail: aaaa102077@ sina. com
* 通讯作者 李繁荣 Tel: ( 0571) 87823122 E- mail : aaaa102077@ s ina. com