全 文 ：·制剂与质量·
基于抑制中性粒细胞呼吸爆发效应的复方丹参缓释片
体外释放行为评价研究
岳鹏飞 ,唐剑彬 ,郑 　琴 ,徐国良 ,杨 明
①
,刘荣华
(江西中医学院 现代中药制剂教育部重点实验室 ,江西 南昌 　330004)
摘 　要 :目的 　从效应动力学角度研究复方丹参缓释片体外释放行为过程 ,探讨并阐释复方丹参缓释片体外释放
行为特征。方法 　基于中性粒细胞呼吸爆发效应的生物化学发光检测技术 ,在规定的时间点对复方丹参缓释片体
外释放样品进行测定 ,以表征体外释放行为的变化。结果 　复方丹参缓释片体外可缓释 12 h ,基本达到缓释制剂
设计的要求。结论 　借鉴效应动力学的评价方法 ,成功构建了一种基于中性粒细胞呼吸爆发效应的生物化学发光
检测技术 ,为中药复方缓控释制剂的体外释放评价提供新的借鉴和参考。
关键词 :复方丹参缓释片 ;中性粒细胞呼吸爆发效应 ;生物化学发光 ;体外释放动力学
中图分类号 :R286102 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 - 2670 (2010) 06 - 0885 - 04
I n vit ro release evaluation of compound Danshen sustained2release tablet
based on inhibition of neutrophil respiratory burst
YU E Peng2fei , TAN G Jian2bin , ZH EN G Qin , XU Guo2liang , YAN G Ming , L IU Rong2hua
( Key Laboratory of Modern Preparation of Chinese Materia Medica , Minist ry of Education , Jiangxi University
of Traditional Chinese Medicine , Nanchang 330004 , China)
Abstract : Objective 　Based on t he biological effect2kinetic met hods , to st udy t he compound Danshen
sustained release tablet s i n v i t ro release kinetics of t he p rocess , and to explain t he i n v i t ro release charac2
teristics of compound Danshen tablet s1 Methods 　Biochemical effect s wit h chemiluminescene detection
technology based on the neut rop hil respiratory burst , t he i n vi t ro release samples of compound Danshen
preparations were analyzed in t he determined timepoint s , which could show t he differences of compound
Danshen tablet s i n v i t ro release1 Results 　Comp und Danshen sustained tablet s could release in 12 h , which
achieved t he quality design requirement s of sustained release p reparation1 Conclusion 　In t his study , the
biological effect2kinetic method is successf ully used1 The met hod of t he biochemical effect s of chemlumis2
cence detection technology based on neut rop hil respiratory burst is fir st const ructed and used to st udy com2
pound Danshen tablet s i n vi t ro release kinetics , which could be referred as t he i n vi t ro release evaluation of
compound Chinese medicine sustained release p reparation1
Key words : Compound Danshen preparation ; neut rop hil respiratory burst effect ; biochemical lumines2
cence ; i n vi t ro release kinetics
　　制剂体外释放测定是预测不同剂型设计的快速
筛选与评价方法。由于中药及其复方制剂含有众多
组分 ,而现行多数中药制剂释放度评价的研究模式
基本上是模仿化药缓控释制剂的控制模式[ 1 ] ,即通
过对某一指标性成分进行定性或/ 和定量分析来实
现中药缓释制剂体外释放评价 , 不能反映中药复方
作用的整体性特色 ,更难以全面反映复方制剂体内
药理效应的整体变化 ,对中药制剂体内外的相关性、
安全性和有效性可能“难控难评 ,难以预测”。复杂
多组分是中药复方缓控释制剂的基本特征 ,如何从
·588·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 6 期 2010 年 6 月
①收稿日期 :2009209211　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :“十一五”科技支撑计划项目 (2006BA109B08201) ;国家“十一五”重大新药创制专项 (2009ZX093102005) ;江西省卫生厅中医药科
研项目 (2009A059 ,2009A061)
作者简介 :岳鹏飞 (1982 —) ,男 ,山东淄博人 ,硕士 ,讲师 ,主要从事药物新剂型与新技术研究。
Tel : (0791) 7119010 　E2mail : ypfpharm @1261com3 通讯作者　杨　明　E2mail :yangming16 @1261com
整体角度对中药复方缓控释制剂进行体外释放评
价 ,已成为制约中药剂型发展的难点问题[2 ] 。以生
物药理效应为基础的药理信息学的发展 ,为阐明决
定中药疗效的多组分因素 ,以整体性理论研究中药
缓控释制剂提供了新的契机。本研究以临床疗效显
著、药效物质基础及作用机制研究相对清楚的复方
丹参方为模型方 ,以自制复方丹参缓释片为研究对
象 ,针对中药复方缓释剂型研究发展的难点问
题 ———如何对中药复方缓释剂型体外释放行为进行
评价 ,以中性粒细胞呼吸爆发效应的生物化学发光
值及抑制率为评价指标 ,通过观察不同时间点自制
复方丹参缓释片体外溶出物抑制中性粒细胞呼吸爆
发效应的生物效应变化 , 表征复方丹参缓释片体外
释放行为特征 ,旨在建立适用于复方丹参缓释制剂
体外释放行为的快速、灵敏的评价技术方法 ,该法具
备灵敏、快速、高效的特点 ,期望为中药复方缓控释
制剂的体外释放行为评价提供新的借鉴和参考。
1 　仪器、试剂与材料
BPCL 型超微弱化学发光分析仪 (中国科学院
生物物理研究所) ;ZRC —8D 型智能溶出测定仪 (天
津大学精密仪器厂) 。
复方丹参缓释片 (以丹酚酸 B 计 ,含丹参水溶
性部位 3115 mg/ 片 ;以三七皂苷 Rg1 计 ,含三七总
皂苷 9315 mg/ 片 ;本实验室自制) 。淋巴细胞分离
液 (上海浩然生物技术有限公司) ;葡聚糖 T500 (上
海源叶生物科技发展有限公司) ; H EPES 试剂 (北
京东胜创新生物科技有限公司) ; Tris 试剂 (京东胜
创新生物科技有限公司) ;32氨基邻苯二甲酰肼 (上
海 Sigma 公司) ;趋化三肽 (上海 Sigma 公司) ,其他
试剂均为市售分析纯。SD 大鼠 (250～300 g) ,雌雄
均可。
2 　方法与结果
211 　大鼠中性粒细胞的分离与制备[3 ] :取 SD 大
鼠 ,乙醚麻醉 ,眼眶取血 , 1 %肝素钠抗凝 ,葡聚糖
T500 沉降红细胞 ,淋巴细胞分离液分离 ,低渗除去
残留红细胞 ,得纯度和活度均为 95 %以上大鼠
PMN ,用细胞稀释液 (2 %小牛血清的 HBSS 液) 调
整 PMN 细胞为 2 ×105 个/ mL ,4 ℃保存 ,在 12 h
内使用 ,PMN 活力恒定 ,对实验结果无影响。
212 　抗大鼠中性粒细胞 ( PMN) 呼吸爆发的生物化
学发光值的测定[4 ] : PMN 在受到外源性刺激剂
PMA 激活后发生呼吸爆发 ,产生大量的活性氧自
由基 ,自由基被发光剂 luminol 捕获产生化学发光
(chemiluminesence , CL ) , PMN2CL 强度与 PMN 的
细胞数量及 PMN 的呼吸爆发和吞噬功能正相关。
　　取 PMN 悬液 1 mL 放入微弱发光测量仪发光
杯中 ,加入 luminol 50μL ,置于 37 ℃发光池中孵育
10～12 min ,同时监测其自发光过程 ,按 5 s 记数 1
次 ,然后加入各溶出时间点溶出液 10μL (以 10μL
空白辅料溶出液为对照)继续测定 5 min ,再加入 20
μL PMN 刺激剂 ,继续测定 15～20 min ,连续记录
测定结果。PMN2CL 强度以峰高表示。分别采集 2
组数据 : PMN 自发光稳定期的 CL 值 ,以此为本底 ;
PMN 刺激后的 PMN2CL 最高峰值。PMN 呼吸爆
发的发光值 PMN2CL 以 PMA 刺激后的 PMN2CL
最高峰值减去本底来表示即 PMN2CL呼吸爆发 =
PMN2CL PMN刺激后 - PMN2CL自发光稳定期 。
213 　方法学考察
21311 　专属性试验 :分别考察对照组 (蒸馏水) 、
DMSO、空白辅料的溶出液对中性粒细胞呼吸爆发效
应的影响。结果表明蒸馏水、DMSO、空白缓释片辅
料的溶出介质均对生物化学发光法检测方法无干扰。
21312 　量效关系曲线 :按复方丹参方 1 d 处方量称
取复方药材提取物用 DMSO 配成 20 mL 溶液备
用 ,再稀释适当比例 (50、100、200、400、800、1 600、
3 200 倍)分别作为不同质量浓度稀释液测定。复
方丹参标准液抑制中性粒细胞呼吸爆发效应的量效
曲线见图 1 ,结果显示复方丹参成分有抑制中性粒
细胞呼吸爆发的药理效应 ,与文献报道一致[2 ,3 ] 。
生物化学发光值与稀释倍数剂量单位之间存在良好
的指数线性关系 (图 2) ,化学发光值转换为对数值
后 ,在制剂处方稀释 50～3 200 倍的剂量 ,稀释倍数
剂量单位与化学发光对数值之间存在良好的线性关
系 ,见图 3 ,回归方程为 Y = 01634 9 X + 91874 3 ,
R2 = 01995。
图 1 　复方丹参方不同稀释倍数标准液的化学发光值
Fig11 　Chemlumiscence values of different dilution standard
solution of compound Danshen prescription
214 　体外释放行为过程
21411 　复方丹参缓释片等效完全释放标准液 :取复
方丹参储备液稀释配成等效于复方丹参缓释 900
·688· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 6 期 2010 年 6 月
图 2 　复方丹参方不同稀释倍数标准工作液发光值
Fig12 　Chemlumiscence values of different dilution standard
solution of compounad Danshen prescription
图 3 　化学发光值经过对数变换后与稀释倍数的线性关系
Fig13 　Linear relationship of dilution multiple dose
with chemlumiscence after logarithmic
transformation
mL 溶出液完全释放 ,得到的标准液。
21412 　复方丹参缓释片体外释放样品液制备 :取复
方丹参缓释片样品 ,照释放度测定法 (《中国药典》
2005 年版二部附录 ⅩD) ,采用第一法装置 ,量取蒸
馏水 900 mL , 注入每个溶出杯 ,加热使溶液温度保
持在 37 ℃±015 ℃,调整转速 (100 ±1) r/ min 并保
持稳定 ,取 3 份样品分别投入溶出杯中 ,开动仪器 ,
在规定取样点吸取溶液 1 mL ,立即经 0145μm 微孔
滤膜滤过 ,同时补加同温介质 1 mL 。分别测定各释
放样品液及标准液的生物化学发光值。
21413 　复方丹参缓释片对中性粒细胞的呼吸爆发
效应的抑制率 ( inhibition ratio , I ) 和释放量 ( re2
lease , R)的规定 :既定数量的中性粒细胞 PMN 在受
到外源性刺激剂 PMA 激活后发生呼吸爆发 ,产生
大量的活性氧自由基 ,自由基被发光剂 luminol 捕
获产生化学发光 , PMN2CL 强度与 PMN 的呼吸爆
发产生的活性氧自由基正相关。抑制率 ( I)定义为 :
I = ( k0 - kC) / kC ×100 % ,其中 k0 和 kC 分别为中性
粒细胞未受到药物抑制和受到药物量为 C 的药物
抑制作用时的生物化学发光值。释放量 ( R) 定义
为 : R = IC/ I0 ×100 % ,其中 I0 为复方丹参缓释片等
效完全释放标准液的抑制率 , IC 为中性粒细胞受到不
同时间点缓释片溶出液抑制作用的生物化学发光值。
不同时间点的生物化学发光值、相对抑制率、相
对释放量的变化见图 4、5。在 5 min～12 h 的释放
过程中 ,复方丹参缓释片释放液抑制中性粒细胞呼
吸爆发效应的抑制率由 35 %增加到 95 % ;对应的相
对释放量 5 min 时释放 40 % ,缓慢上升 ,60 min 释
放量达到稳定值 90 % ,逐渐达到峰值 ,说明复方丹
参缓释片体外可缓释 12 h ,基本达到缓释制剂设计
的要求 ,可见基于中性粒细胞呼吸爆发效应的生物
化学发光检测技术可以作为快速评价复方丹参缓释
片体外释放行为的一种评价方法和手段。
图 4 　复方丹参缓释片化学发光值、抑制率2释放时间
关系( n = 5)
Fig14 　Relationship of release time with CL and I
of compound Danshen sustained2release tablet
( n = 5)
图 5 　复方丹参缓释片释放量2释放时间关系( n = 5)
Fig15 　Relationship of release amount with release time
of compound Danshen sustained2release tablet
( n = 5)
3 　讨论
生命活动的有氧代谢可以不断产生各种自由
基 ,超氧阴离子自由基 O2 ÷是其中 3 种有代表性的
自由基 (超氧阴离子自由基 O2 ÷、羟基自由基 ·O H、
酯自由基 RCOO ·) 之一。过剩的超氧阴离子自由
基 O2 ÷对生物细胞有巨大的破坏作用 ,是引起冠心
病和动脉硬化等多种疾病诱因之一。复方丹参属研
制方 ,其组方丹参、三七、冰片等 ,前期研究表明其效
应组分均具有显著的清除氧自由基 (即 ROS) 的能
力[5～7 ] 。而基于中性粒细胞呼吸爆发效应的生物化
学发光检测技术 ,作为氧自由基生物效应的一种检
测手段 ,尤其适用于研究治疗与氧自由基损伤有密
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切关系疾病的中药 ,如文献报道利用生物化学发光
检测技术考察酸枣仁[ 8 ] 、银杏叶[9 ] 、麦冬皂苷[10 ] 、山
楂叶[11 ]抗中性粒细胞的呼吸爆发效应进行药效物
质的筛选和控制研究等 ,目前常用的自由基检测方
法有 :电子自旋共振法、电化学法、毛细管电泳法、荧
光光谱法、光度法、色谱法等[12 ,13 ] 。这些方法存在
仪器昂贵、操作复杂、选择性差或灵敏度低等缺点 ,
而生物化学发光法具有灵敏、快速、操作简单、重现
性好等优点。
本实验采用了基于中性粒细胞呼吸爆发效应的
生物化学发光检测技术进行了中药复方缓释制剂体
外释放行为的评价 ,结果证实复方丹参缓释片体外
可缓释 12 h ,基本达到缓释制剂设计的要求 ,期望
为治疗冠心病类中药复方缓释新剂型的评价探索出
一种新方法 ,改变测定单一成分或某一有效部位不
能综合评价、或者药效实验评价费时费钱且操作烦
琐的局面 ,较好表征复方丹参缓释片的体外释放行
为特征 ,弥补了常规复方缓释制剂体外释放评价方
法的不足 ,可以为中药复方的体外释放评价提供新
的借鉴和手段。
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纤维素酶转化淫羊藿苷制备宝藿苷 I的研究
贾东升1 ,2 ,贾晓斌1 ,2
①
,赵江丽2 ,施 　峰2 ,蒋 　俊1 ,黄 　洋1
(11 江苏省中医药研究院 中药新型给药系统重点实验室 ,国家中医药管理局中药口服制剂释药系统重点研究室 ,
江苏 南京 　210028 ; 21 江苏大学药学院 ,江苏 镇江 　212013)
摘 　要 :目的 　研究宝藿苷 I的制备工艺。方法 　采用纤维素酶水解淫羊藿苷制备宝藿苷 I ,以转化率为指标 ,通
过单因素考察 p H 值、温度、底物的浓度、酶用量、反应时间及金属离子对转化率的影响 L 9 (34 ) ,正交试验优化制备
工艺 ;采用 MS ,1 H2NMR、13 C2NMR 鉴定水解产物。结果 　酶解反应的最适条件为温度 50 ℃、反应介质 p H 512
醋酸2醋酸钠缓冲液 ,底物浓度为 10 mg/ mL ,酶与底物质量比 1 ∶1 ,反应时间 48 h ,钠离子、钙离子、镁离子、锌离
子、对酶解反应无显著影响 ( P > 0105) ,铁离子对酶解反应有抑制作用 ( P < 0101) ;反应产物相对分子质量为 514 ,
核磁图谱证实产物为宝藿苷 I。结论 　纤维素酶水解淫羊藿苷制备宝藿苷 I ,工艺简单可靠 ,反应条件温和 ,适合工
业化生产。
关键词 :淫羊藿苷 ;宝藿苷 I ;纤维素酶 ;生物转化
中图分类号 :R284. 2 ;R286102 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 - 2670 (2010) 06 - 0888 - 05
·888· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 6 期 2010 年 6 月
①收稿日期 :2009209229　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :江苏省医药高技术计划项目 (B G2007614) ;江苏省中医药领军人才项目 (2006)
作者简介 :贾东升 ,男 ,河北石家庄人 ,硕士在读 ,主要研究方向为中药新型给药系统。E2mail : jiadongsheng 1 @1631com3 通讯作者　贾晓斌　Tel/ Fax : (025) 85637809 　E2mail : jxiaobin2005 @hot mail1com