全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 10 期 2011 年 10 月

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• 药材与资源 •
热胁迫下丹参转录组 cDNA-AFLP 分析
李 东1, 2，吴先军1, 3 *，陈 新4 *
1. 四川农业大学水稻研究所，四川 温江 611130
2. 四川理工学院生物工程学院，四川 自贡 643000
3. 四川农业大学 西南作物基因资源与遗传改良教育部重点实验室，四川 温江 611130
4. 成都中医药大学，四川 温江 611137
摘 要：目的 探索热胁迫影响丹参生长和次生代谢的分子机制。方法 采用 cDNA-AFLP 技术对丹参热胁迫下叶片基因表
达进行转录组分析。采用 EcoR I 和 Mse I 对叶片 cDNA 进行双酶切，256 对引物组合进行选择性扩增，对差异片段进行测序、
功能分析和定量 RT-PCR。结果 共分离出 196 个差异表达转录衍生片段（transcription derived fragments，TDFs），其中增强
与诱导表达的 TDFs 122 条，抑制表达的 74 条；从 NCBI 中鉴定出 147 个同源 TDFs，另有 49 个 TDFs 为新发现序列。结论
热胁迫影响转录组的信号转导、转录调控、逆境响应蛋白、物质代谢等多个方面，为进一步研究丹参有效成分的代谢调控奠
定了基础。
关键词：丹参；热胁迫；cDNA-AFLP；转录组；RT-PCR
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)10 - 2083 - 09
cDNA-AFLP analysis on transcriptome of Salvia miltiorrhiza under heat stress
LI Dong1, 2, WU Xian-jun1, 3, CHEN Xin4
1. Rice Research Institute of Sichuan Agricultural University, Wenjiang 611130, China
2. College of Bioengineering, Sichuan University of Science & Technology, Zigong 643000, China
3. Key Laboratory of Crop Gene Resources and Improvement, Ministry of Education, Sichuan Agricultural University, Wenjiang
611130, China
4. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Wenjiang 611137, China
Abstract: Objective To research the molecular mechanism of growth and secondary metabolism of Salvia miltiorrhiza during heat
stress. Methods The cDNA-AFLP approach was applied to identifying the transcriptome of differential genes expression in leaves.
cDNA from leaves was digested by EcoR I and Mse I, and 256 primer combinations were used for selective amplification. Different
transcription derived fragments (TDFs) were cloned, sequenced, and analyzed by quantitative RT-PCR. Results TDFs (196) were
identified for their differential expression under heat stress, among which the expression of 122 TDFs was enhanced and induced and
expression of 74 TDFs was suppressed. Compared the sequences of all TDFs with the NCBI databases, 147 TDFs presented
homologous, while 49 TDFs with low identity or no match to known genes in NCBI might represent novel genes in S. miltiorrhiza.
Conclusion The signal transduction, transcriptional regulation, stress response protein, and metabolism, etc. could be influenced by
heat stress, which provides a basis for further study on the regulation of active constituent metabolism of S. miltiorrhiza.
Key words: Salvia miltiorrhiza Bunge; heat stress; cDNA-AFLP; transcriptomes; RT-PCR

丹参为唇形科植物丹参 Salvia miltiorrhiza
Bunge 的干燥根及根茎，是我国常用大宗药材，使
用广泛，主产于山东、河南、陕西、四川等省。丹
参的根中含有水溶性的酚酸类成分与脂溶性的萜醌
类成分，主要为丹酚酸B、丹参酮IIA等，由于品种
与产地不同，遗传多样性较丰富，不同丹参的有

收稿日期：2011-03-23
基金项目：教育部长江学者和创新团队发展计划（IRTO453）
作者简介：李 东（1982—），男，四川德阳人，博士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。E-mail: dashtomlee@163.com
*通讯作者 吴先军 E-mail: wuxjsau@126.com
陈 新 E-mail: chennew@tom.com
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效成分量存在较大差异[1-2]，可见丹参有效成分量
的高低同遗传背景和环境有关[3-4]。
对丹参有效成分积累与环境关系的研究[5]发
现，制约各有效成分量的主要环境因子为热量因
子，其中七月气温对有效成分量有显著影响，年极
高温是影响丹参有效成分量的重要影响因子，生长
季内温度较高有利于丹参素及丹酚酸B的积累，而
不利于丹参酮IIA的积累。研究还发现九月份高温不
利于丹参有效成分的积累，而较湿润的环境有利于
丹参有效成分的积累[6]。由此可见，适宜的温度是
丹参有效成分积累的关键因素之一，高温会对丹参
有效成分的累积产生重要的影响。
在热胁迫过程中，植物会接受一系列的信号，
并做出相应调整，转录组将发生一系列的变化[7]，
对转录组进行研究是了解植物响应热胁迫分子机制
的重要途径[8-9]。
cDNA-AFLP是近年来发展起来的一种研究转
录组变化的重要技术，其假阳性低，重复性好，且
不需要预先获得序列信息，对于大量尚未测序的药
用植物是最佳研究工具[10-11]，本实验利用AFLP，
结合测序技术、生物信息学技术，对热胁迫下丹参
的转录组进行研究，通过对表达谱中相关基因的注
释和分类，深入了解丹参响应热胁迫的特点，为探
索丹参有效成分的生物合成与调控提供依据。
1 材料与仪器
丹参药材采自四川省中江县，经成都中医药大
学药学院陈新教授鉴定为丹参Salvia miltiorrhiza
Bunge。RNA提取试剂盒（Tiangen公司），M-MLV
RTase cDNA Synthesis Kit试剂盒（TaKaRa公司），
EcoR I与Mse I限制性内切酶（NEB公司），琼脂糖
凝胶回收试剂盒（Omaga公司），pMDtm 19-T Vector
（TaKaRa公司）；紫外分光光度仪DU800（Beckman
公司），PCR反应扩增仪（Bio-Rad公司），实时定量
PCR 仪 CFX96 Real-Time PCR Detection System
（Bio-Rad公司），垂直板电泳系统（Bio-Rad公司）。
2 方法
2.1 总 RNA 提取与双链 cDNA 的制备
用幼叶组培快繁，再生植株于 25 ℃、无激素
1/2MS 培养基上培养至 12 cm 时，备用。再生幼苗
38 ℃胁迫 48 h，分别于 0、2、4、6、12、24、48 h
取幼叶。使用 RNA 提取试剂盒提取总 RNA，1.5%
琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性，并使用紫外分
光光度仪检测RNA浓度及纯度。使用M-MLV RTase
cDNA Synthesis Kit 试剂盒将 2 μg 总RNA逆转录为
双链 cDNA，重复 3 次。
2.2 cDNA-AFLP 试验
cDNA-AFLP试验体系及程序参照Bachem等[12]
方法并略加改进。使用EcoR I与Mse I限制性内切酶
对 200 ng双链cDNA进行双酶切后连接接头。使用
E00 （ 5′-GACTGCGTACCAATTC-3′ ） 和 M00
（5′-GATGAGTCCTGACTAA-3′）进行预扩增，预扩
增反应程序为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 30 s，
56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，25 个循环；72 ℃
延伸 10 min，4 ℃保存。将预扩增产物稀释 40 倍，
进行选择性扩增，选择性引物为E00＋NN、M00＋
NN，共计 256 对引物组合，重复 3 次。选择性扩增
反应程序为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 30 s，
65～56 ℃退火 30 s（每个循环降低 0.7 ℃），72 ℃延
伸 1 min，12 个循环；94 ℃变性 30 s，56 ℃退火 30 s，
72 ℃延伸 1 min，25 个循环；72 ℃延伸 10 min。
2.3 差异片段的检测及提取
制备 6%变性聚丙烯酰胺凝胶，恒定功率 65 W
预电泳 30 min，使用移液枪将点样孔中气泡、多余
尿素清除，取 6 μL选择性扩增产物变性后进行点
样。65 W恒定功率电泳，待指示剂接近凝胶尽头时，
停止电泳。使用银染法进行染色。差异条带使用高
盐法[13]进行回收，以回收后产物条带为模板进行 2
次PCR扩增，扩增体系和程序与选择性扩增相同。
使用 0.8%琼脂糖凝胶分离目的条带，琼脂糖凝胶回
收试剂盒回收目的片段。pMDtm 19-T Vector连接目
的片段，热激转入DH5α菌株中，挑取 10 个阳性克
隆进行PCR检测，3 个阳性菌株测序。
2.4 测序结果分析
使用本实验室自编Bioperl程序对测序结果进行
分析，去除载体序列，使用Blast2GO对测序结果进行
Gene Ontology注释，方法及步骤参照文献方法[14]。
2.5 RT-PCR 定量验证
从测序结果中，随机选择部分转录衍生片段
（TDFs）进行定量RT-PCR验证（表 1）。定量RT-PCR
检测参照CFX96 Real-Time PCR Detection System
（Bio-Rad公司）与SYBR Premix ex Taq II Kit
（TaKaRa公司）说明，并略有改进。定量RT-PCR
体系为 2×SYBR Premix ex Taq II 10 μL；引物 1（10
nmol/mL） 0.8 μL；引物 2（10 nmol/mL） 0.8 μL；
cDNA模板（20 ng/μL） 1 μL；dd H2O 7.4 μL；总
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表 1 TDFs 定量 RT-PCR 验证 (n=3)
Table 1 Primers for quantitative RT-PCR of TDFs (n=3)
编号 引物序列 5′-3′ 片段长度/
bp
退火温度/
℃ 编号 引物序列 5′-3′
片段长度/
bp
退火温度/
℃
TDF17 CTGCTCAGACCACCATCG 147 50 TDF150 AGCCCTTCTACGGTTGTATTTC 153 60
TCTTGGCATCCCTCAAACAC CGGGATTCGCACCTTATTT
TDF20 TGCGAGGCGGTTTCTGTT 176 60 TDF176 AGCCATCCATCGCAAGAGG 107 55
TCCGCAAACTTGCTGAAGAG GGCATCAGCATCGGCTAAGAG
TDF108 GGCAATTTGGTGTTGGTTTC 220 56 TDF191 CGGTCGTGTTCTGATTGTTCG 190 58
TTCAGCCTGCGCTCCTCA CATATCCTCTGGCTGGTAGGG
TDF155 AAAGAGCAGGAGGAGAAGAACG 74 56 TDF115 AACGAGTGGTGCCGTTCC 231 58
CTGAAGCGGCGAAGGAAC GGATAAGCCTTGTTTAGTTACTGTTAG
TDF81 AGCGTCTGAGGGGACATCG 78 55 TDF127 ACTGCTGGTTCATGTTCCAC 146 61
GTCTTCCTTCGCCGCCTT TTATCATTTGTATGCCCTTCG
TDF143 AGTGCCCTACCCTCCGTT 122 50 Actin AGGAACCACCGATCCAGACA 267 59
AATGCTTTTGCTGCCCTAT GGTGCCCTGAGGTCCTGTT
TDF151 TGAACTGGACGCCGAGGAG 162 61 GAPDH CCACCGTCCACTCCATCACT 183 62
GGCAAGTGTCGAGGATGAGGT TGGGAACTCGGAACGACATAC

体积 20 μL。
PCR反应程序采用两步法：95 ℃预变性 30 s；
95 ℃变性 5 s，退火温度（Tm）退火/延伸 30 s，40
个循环；融解曲线条件为 65～95 ℃，每 5 s 提升
0.5 ℃。以Actin[15]、GAPDH[16]作为内参基因，进行
综合分析[17]。重复 3 次。
3 结果与分析
3.1 总 RNA 的提取
提取胁迫幼叶的RNA，点样孔无亮斑，说明
RNA无蛋白质污染，条带清晰（图 1），18 S、28 S
条带比例正常。紫外分光光度计检测 260、280 nm
吸光度（A）值，A260/A280在 1.8～2.1，各样品质量
浓度在 100～300 ng/μL，符合试验要求。

图 1 RNA 电泳结果
Fig. 1 RNA electrophoresis result
3.2 cDNA-AFLP 分析
采用 256 对引物组合对丹参热胁迫转录组进行
分析，平均每对引物组合扩增出 20～40 条 TDFs，
长度在 50～700 bp。其中组成型表达占绝大部分，
只有少数 TDFs 出现变化，分别表现为诱导增强型
表达与抑制表达（图 2）。获得差异目的片段 196

A-抑制表达 B、D-组成型表达 C、E-诱导型表达
0 h 2 h 4 h 6 h 12 h 24 h 48 h
A-supp ted
Fig. 2 TD patterns
条， 2 条
果进行注释，共有 147
个 T
ogy分
析，
ressed B and D-expressed constitutively C and E -up-regula
图 2 不同表达模式 TDFs
Fs with different expression
其中上调 122 条，下调 74 条。上调的 12
TDFs 中，74 条 TDFs 在热胁迫过程中出现，48 条
TDFs 仅在特定时间段出现，说明热胁迫诱导了其
表达。下调的 74 条 TDFs 在胁迫后某些时间段难
以检测，说明高温抑制其表达。
3.3 差异片段及功能分析
使用 Blast2GO 软件对结
DFs 在 NCBI 中已有序列同源，涉及代谢、信
号转导、转录调控、逆境响应蛋白等功能，有 49
个 TDFs 未找到高相似度同源序列，预测为未知功
能新基因，该类基因可能为丹参特有的参与热胁迫
反应的相关基因。部分 TDFs 的 Blast2GO 注释属于
不同的酶家族，这说明该类 TDFs 可能与两种以上
的酶基因都具有高度相似性，由于该部分 TDFs 较
短，难以辨别其功能，需进一步研究确定。
对注释结果使用Blast2GO进行Gene Ontol
分别找到 86 个与细胞组分相关的 TDFs，103 个

A
B
C
D
E
28 S
18 S
0 h 2 h 4 h 48 h M

2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
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在细胞
内和
能数据主要集中在结合和催化活性两
个部
学作用数据主要集中在代谢作用、细胞的
作用
Fs n
Fig. 3 Blast2GO bar chart of all TDFs
与分子功能相关的TDFs和98个与生物学作用相关的
TDFs，共 155 个类别。数据见图 3 和表 2。
细胞组分数据分为多个层次，主要集中
细胞内的有膜细胞器两个部分，其中找到了 15
个蛋白复合体，蛋白复合体在细胞中起着十分重要
的作用。
分子功
分，其中转录因子活性与基因的表达有着密切
的关系。说明了在热胁迫情况下，转录组有明显的
变化。
生物
和响应刺激 3 个部分，涉及细胞的代谢、合
成、细胞进程与胁迫下响应。在热胁迫情况下，在
初生代谢过程与次生代谢过程均检测到了变化，初
生代谢涉及核酸代谢、氨基酸代谢、蛋白质代谢等
多个进程，次生代谢过程检测到了 3 个基因分别为
TDF52（天冬氨酸转氨酶）、TDF54 和 TDF181（异
胡豆苷合酶家族蛋白）。

分别对 TDFs 中涉及细胞组分、分子功能和生
物学作用进行了 Level 3 水平的功能注释分析。细
胞组分 Level 3 水平功能注释分析主要集中在胞内
部分和有膜细胞器两部分，其中胞内部分为 46%，
有膜细胞器为 35%。分子功能 Level 3 水平功能注
释分析中，与核苷酸结合为 21%，与蛋白质结合为
26%，与核酸结合为 14%，这 3 部分均属于结合的
子概念；转移酶活性为 13%，水解酶活性为 14%，
这两部分均属于催化活性的子概念。生物学作用
Level 3 水平功能注释分析中大分子代谢过程为
12%，生物合成作用为 10%，响应非生物刺激为 6%，
响应胁迫为 8%，生物学作用调节为 6%，含氮化合
物代谢过程为 6%，初生代谢过程为 17%。
对 TDFs 中与有效成分代谢可能相关的序列进
行综合分析，分别在生物学作用、分子功能和细胞
组分中找到了 75、30 和 15 个与有效成分代谢可能
相关的 TDFs。在生物学作用和分子功能中发现部
分 TDFs 参与了多种功能，见表 3 和 4。

纵坐标为各级 Gene Ontology 归类，横坐标为该归类的 TDFs 数目
0 20 40 60 80 100 120
生物学作用（含有 98 个 TDFs）
分子功能（含有 103 个 TDFs）
细胞组分（含有 86 个 TDFs）
0 20 40 60 80 100 120

150

140

130

120

110
109

100

90

80
77
76


70


60


50


40


30


20


10


1
Ordinate for Gene Ontology classification, abscissa for TD umbers
图 3 TDFs 的 Blast2GO 注释
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编号 描述 编号 描述 编号 描述
表 2 TDFs 的 Blast2GO 注释
Table 2 Blast2GO of all TDFs
描述 编号
1 生物学作用 38 外部刺激响应 能 117 质体 77 分子功
2 代谢进程 氮化合物代谢 胞部39 含 作用 78 结合 118 细 分
3 初生代谢作用 部分 40 定位 79 催化活性 119 细胞内
4 刺激响应 41 信号进程 80 蛋白质结合 120 细胞内
5 胁迫响应 42 大分子物质修饰 81 核苷酸结合 121 质膜
6 生物合成进程 of precursor 43 generation 82 水解酶活性 122 细胞器
7 蛋白质代谢过程 energy metabolites and 83 DNA 结合 123 线粒体
8 细胞进程 44 碳水化合物代谢进程 84 核酸结合 124 核
9 非生物刺激响应 45 细 体 胞内生物合成作用 85 转移酶活性 125 蛋白复合
10 大分子物质代谢进程 用 活性 46 大分子物质生物合成作 86 信号传感器 126 膜
11 生物学作用调节 47 cellular component organization 87 蛋白激酶活性 127 大分子复合体
12 细胞代谢进程 48 organelle organization 88 运输活性 128 液泡
13 多细胞有机体发育 49 细胞周期 89 肽酶活性 129 类囊体
14 分解代谢进程 50 次生代谢作用 90 分子传感器活性 130 细胞液
15 碱基、核苷、核苷酸和 分 51 蛋白质运输 91 激酶活性 131 细胞核部
核酸代谢进程 醇基受体52 信号 92 磷酸转移酶活性， 132 nuclear lumen
16 细胞大分子物质代谢进程 性 53 翻译 93 转录调节活 133 核浆
17 运 亡 泡输 54 细胞死 94 RNA 结合 134 细胞质内有膜囊
18 信号转导 55 内源刺激物响应 95 酶调节活性 135 内质网
19 核酸代谢进程 性 56 离子运输 96 转录因子活 136 细胞内无膜细胞器
20 细胞内氨基酸及其衍 成 57 解剖学结构形态建 97 受体活性 137 细胞核
生物代谢进程 ule activity 58 细胞通讯 98 structural molec 138 过氧化物酶体
21 生物学调节 59 蛋白质定位建立 99 钙离子结合 lar lumen139 Intracellu
22 发 1 育进程 60 生长 00 核酸酶活性 140 胞内细胞器部分
23 DNA 代谢进程 1 转移含磷集团61 解剖学结构发育 01 转移酶活性， 141 有膜囊泡
24 多细胞有机体进程 合 62 死亡 102 碳水化合物结 142 细胞质内囊泡
25 转录 63 蛋白质定位 103 电子载体活性 143 无膜细胞器
26 细胞内含氮化合物代 acting 64 细胞生长 104 hydrolase activity, 144 细胞骨架
谢进程 65 regulation of gene expression, on ester bonds 145 细胞外区域
27 增殖 epigenetic 105 金属离子结合 146 微体
28 信 06 阳 en 号传递 66 细胞分化 1 离子结合 147 organelle lum
29 定位建立 7 生物刺激响应 部分 6 107 抗氧化剂活性 148 细胞器
30 调节细胞进程 68 大分子定位 108 氧结合 149 囊泡
31 脂类代谢进程 69 细胞发育进程 109 离子结合 150 核糖体
32 蛋白质修饰作用 膜细胞器 体 70 调节基因表达 110 细胞内有 151 高尔基
33 基因表达 71 细胞大小调节 111 细胞质部分 152 细胞壁
34 细胞内大分子物质合 lular component size enclosed72 regulation of cel 112 细胞成分 153 membrane-
成作用 73 大分子物质代谢进程调节 113 细胞 lumen
35 小分子物质代谢进程 74 代谢进程调节 114 细胞质 154 核糖核蛋白复合体
36 胚 细胞器 55 ex ructure 胎发育 75 解剖学结构大小调节 115 细胞内 1 ternal st
37 细胞内蛋白质代谢进程 logical quality 器 76 regulation of bio 116 有膜细胞 encapsulating
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3 效成分代谢 合分析
p e ted metablism in b ologic
编号 RS BP MMP RBP SP SMP 编号 RS BP MMP RBP SP SMP
表 生物学作用中与有 可能相关的 TDFs 综
Table 3 TDFs com reh nsive analysis on possibly rela active constituent i al process
TDF1 + + + + TDF103 + +
TDF2 + TDF106 + +
TDF3 + + TDF108 + + +
TDF4 + TDF112 + +
TDF6 + + TDF116 +
TDF8 + + + TDF120 + + +
TDF10 + TDF124 +
TDF14 + + + + TDF126 + +
TDF17 + + TDF132 + + + +
TDF18 + + TDF134 +
TDF19 + + + TDF137 + +
TDF20 + + + + TDF138 + +
TDF21 + TDF139 + +
TDF28 + TDF141 + + + + +
TDF31 + TDF143 +
TDF38 + + TDF144 + + +
TDF42 + TDF145 + +
TDF44 + TDF146 +
TDF45 + + TDF149 + +
TDF50 + + TDF150 +
TDF51 + + TDF154 +
TDF52 + + TDF155 +
TDF54 + + TDF157 +
TDF55 + + TDF166 + +
TDF58 + TDF170 + + + +
TDF62 + TDF175 +
TDF64 + + + + TDF176 + +
TDF69 + + + TDF180 +
TDF72 + TDF181 + +
TDF74 + + + TDF182 + +
TDF75 + TDF183 + +
TDF83 + TDF184 +
TDF90 + TDF185 +
TDF94 + + + + TDF186 +
TDF95 + + TDF193 + +
TDF98 + TDF195 + + + + +
TDF99 + TDF196 + +
TDF100 +
“+”-具有相关性 RS-响应刺激 BP-生物合成作用 MMP-大分子代谢作用 RBP-生物学作用调节 SP-信号进程 SMP-次生代谢过程
“+”-with correlation RS-response to stimulus BP-biosynthetic process MMP-macromolecule metabolic process RBP-regulation of biological
process SP-signaling process SMP-secondary metabolic process
3.4 定量 RT-PCR 验证结果
以 Actin 和 GAPDH 作为内参进行综合分析，
选取 12 个 TDFs 进行定量 RT-PCR 分析，得到热胁
迫不同时间其目的基因的表达量，结果见图 4。在
cDNA-AFLP 结果中，TDF17、TDF151、TDF115 表
现为上调；TDF20、TDF108、TDF81、TDF191、
TDF127 表现为上调后下降；TDF155、TDF143、
TDF150、TDF176 表现为下调。定量 RT-PCR 与
cDNA-AFLP 结果基本相同，说明 cDNA-AFLP 结果
真实可靠，适用于该研究。根据 Blast2GO 注释结果，
TDF17、TDF20、TDF108、TDF155 为热激蛋白。
TDF143 在整个热胁迫过程中前期变化不大，从 6 h
开始出现明显地下降，说明热胁迫抑制了该基因表
达。TDF151 前期基本不表达，从 4 h 开始出现大
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Ta n
编 A A E TA A
表 4 分子功能中与有效成分代谢可能相关的 TDFs 综合分析
ble 4 TDFs comprehensive analysis on possibly related to active constituent metabolism in molecular functio
号 T STA TR RA 编号 STA TR ERA
TD + + F1 TDF122
TD + + F8 TDF126
TDF14 + + + TDF132 +
TDF19 + +TDF139
TDF52 + + TDF141
TDF58 + + TDF144
TDF64 + + + TDF148
TDF72 + + TDF161
TDF74 + + TDF166
TDF79 + + TDF170 +
TDF94 + + + TDF176 +
TDF95 + + TDF186
TDF107 + +TDF193
T + + DF112 TDF195 +
TDF120 + + TDF196
T 活性 TA-信号 导活性 TRA-转录调控因子活性 E -酶调控因子活性
T se a ity S signal tr sducer ac vity TR -transcri n re vity A-enzym gulato tivity

4 定量 RT CR A-AFLP 结果
Fig. 4 cDNA-AFLP results of quantitative RT-PCR
量的表达，说明其表达受到了热胁迫的诱导，于
1 到达顶峰， TDF150 为未知功能蛋
白，其表达在热胁迫过程中出现明显的抛物线形
态 胁迫后的 2 h 达 顶点 随着时间开始
降低。TDF176 乙烯受体，受热胁迫影响表达降
低
基 丹
进一步研究的价值。
3.5
表 cDN 定出热
le 5 eat sho protein sequence by cDNA-AFLP
编号 蛋白基因
A-转移酶 S 转 RA
A-transfera ctiv TA- an ti A ptio gulator acti ER e re r ac
图 -P 验证 cDN
2～24 h 后下降。
，在热 1 到 后
为
。TDF81、TDF191、TDF115、TDF127 均为未知
因，其变化均呈显著性差异，该类基因可能是
参特有热胁迫响应的基因，具有
热胁迫下热激蛋白（HSP）的表达
观察到热胁迫会诱导 HSP 表达量急剧升高，通
过对比，找到了多个 HSP 家族相关蛋白，见表 5。
3.6 热胁迫下激酶相关基因表达
使用Blast2GO对 cDNA-AFLP结果进行基因本
体分析与聚类分析，分别对细胞组分、分子功能和
5 A-AFLP 鉴 激蛋白基因
Tab H ck

TDF17 热激蛋白 70
TDF18 热激蛋白 70
TDF75 热激
热激
TDF20 热激蛋白 90
TDF103
TDF106 热激
TDF108 热激蛋白 90
TDF154 胞质类 i 小热激蛋白 1a
TDF155 热激蛋白 18
TDF157 胞质类 i 小热激蛋白 1a
TDF180 胞质类 i 小热激蛋白 1a
TDF184 胞质类 i 小热激蛋白 1a
0 h
2 h
4 h
6 h
12 h
24 h
48 h
7
4
3
2
1


6
5




0

目
的
基
因
表
达
量

TDF11 TDF12 DF150 DF151 T F17 DF20 DF81 T 08 TDF 3 TDF15 TDF15 7 T T D TDF191 T T DF1 14 5 76
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 10 期 2011 年 10 月

• 2090 •
生物学作用进行了 Level
并与
8 个与激 关的基 列， 6。
表 6 cD -AFLP 鉴定出激酶相关基因序列
6 Kina elated gen equence b DNA-AFLP
酶编号 激酶
3 水平的功能注释分析，
其他物种及胁迫进行了比对。在功能分析中找
到了 酶相 因序 见表
NA
Table se r e s y c
编号
TDF14 EC:2. 类受体蛋白激酶蛋白 7.11.0
TDF64 EC:2.7 1.0 蛋白
EC:2. 有丝分裂原蛋白激酶
EC:2.7 0.2 原癌基因酪氨酸蛋白激酶
EC:2. 视紫红质激酶
EC:2. .25 有丝分裂原蛋白激酶
EC:2.7 1.1 serine-threonine rotein plant-type
EC:2. 有丝分裂原蛋白激酶
EC:2.7 3.3 孢子形成传感器激酶
T
.1
TDF94 7.11.25
TDF132 .1
7.11.14
7.11
TDF161 .1 p
TDF170 7.11.25
TDF176 .1
DF195 EC:2.7.11.0 nonphototropic hypocotyl 1
4
4.1 cDNA-AFLP 应用于转录组变化研究
cDNA-AFLP是开展转录组研究的一个重要方
法。Wee等[18]在研究Helicoverpa armigera中使用
256 对引物组合共扩增到 12 500 个TDF，平均每对
引物组合 48.83 个TDF；在玉米中，Hartings[19]使用
BstY I和Mse I的酶切组合，覆盖率大致在 95%。由
于各物种间的差异，使用不同的酶切组合对于试验
结果有一定的影响。在丹参的基因组测序工作尚未
完成的情况下，对于热胁迫状态下的转录组的变化
情况，使用cDNA-AFLP能够有效开展丹参转录组的
研究。本实验选择最为常用的Ec
组合，获得了较为理想的结果。
形态改变
[20]。
]。小HSP介于 17
000～
，从而改变表面疏水性，
中，
大量表 后，部 因受到 为明
研究表 植物的次 代谢与信号传导有着密
系，很多次生代谢产物与胁迫相关，而植物
成分多为次生代谢产物，由于胁迫的作用改
谢流的方向与平衡 从而造成有效成分的增
减少[24]。
胁迫下激酶相关基因表达
中EC2 .11 为与MAPK相关系列酶谱，植物
压力、 伤、盐害 低温、干旱等不同的逆
下，均能诱导和激活MAPK链，将信号不断
传递下 [25]。EC2.7.11.25 为 基因，
APK信号途径的上游，为早期感受并传递放
信号的基因。Hu g等[26]在水稻MAPK的研
热胁迫能迅速导致OsMAPK2 基因表达量
发现转入MPK1 基
因的植株能大大提高耐热能力，但热胁迫下MAPK
信号途径是否与其他胁迫相同，以及热胁迫下
MAKP信号途径所处地位，需进一步研究。
在本研究中，找到了多个与热胁迫相关的 TDFs，
各 TDFs 之间的相互关系有待进一步研究。其中 49
个丹参特有热胁迫相关 TDFs，在以后的研究中，可
以通过 RACE 法获得基因的全长并鉴定功能。
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632-635.
4.2 热胁迫下 HSP 的表达
热激蛋白HSP与热激因子HSF在植物的信号转
导中起着非常重要的作用，调节着热胁迫下的大量
基因表达。在本研究中观察到热胁迫会诱导HSP表
达量急剧升高，通过对比，找到了多个HSP家族相
关蛋白。其中，HSP90 主要作用是指导蛋白质的折
叠，在信号转导网络、增加抗逆能力上也有一定作
用，其表达可以大大增加原核与真核生物的抗逆反
应，降低HSP90 的水平能导致发育畸形与
HSP70 在热及其他胁迫情况下，能够大量表达，
并在细胞核富集[21]。过量表达HSP70 能够增加耐热
能力和对其他环境胁迫的耐受性[20
30 000，被认为有独特的生理学作用[22]，热诱
导产生的蛋白质与小HSP结合形成低聚物，这种低
聚物能够进行结构内修饰
增加其与底物的结合力[23]。在整个热胁迫试验
在HSP 达 分基 了极 显的调
控，有 明 生
切的联
的有效
变了代 ，
加或是
4.3 热
其 .7
在机械 创 、
境条件
放大并 去 MAP3K
位于M
大胁迫 an
究中发现
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