全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 8 期 2011 年 8 月

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大鼠灌服炙甘草汤后甘草次酸药动学研究
罗 雄 1, 3，胡瑞刚 1, 3，陈兰英 1, 3*，黄慧连 1, 2，王木兰 1, 3，龚 琴 1，刘荣华 1, 2*
1. 中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌 330006
2. 现代中药制剂教育部重点实验室，江西 南昌 330004
3. 江西中医学院，江西 南昌 330006
摘 要：目的 建立大鼠 ig 炙甘草汤后体内甘草次酸的 LC-MS/MS 测定方法。方法 采用醋酸乙酯沉淀蛋白处理血浆样品，
选用白藜芦醇为内标，采用 LC-MS/MS 法测定，色谱条件为 ORBAX SB-C18反相色谱柱（Agilent，50 mm×2.1 mm，1.8 μm），
乙腈-水（80∶20，含 0.2%甲酸）为流动相，体积流量 0.2 mL/min，柱温 30 ℃。样品经电喷雾离子（ESI）源负离子化后，
通过 Agilent 6410 三重四级杆串联质谱仪，采用多反应监测（MRM）对甘草次酸进行测定，分别选用 m/z 469.4→425.4 和
227.1→143.0 作为甘草次酸和内标物白藜芦醇的检测离子对。结果 甘草次酸在 33.4～8 560.0 ng/mL 线性关系良好（R2＝0.997 1），
日内（n＝6）、日间（n＝6）精密度、稳定性 RSD 均小于 10%。甘草次酸高、中、低 3 个质量浓度平均提取回收率分别为
75.3%、78.2%、78.5%。在此方法下得到大鼠 ig 炙甘草汤后血浆中甘草次酸的药动学参数分别为 tmax＝（8.00±1.13）h，Cmax＝
（811.02±300.25）ng/mL，AUC0～24＝（11 439.21±3 367.36）ng/mL·h。结论 该方法灵敏、准确、快速、选择性高，可用
于甘草次酸血药浓度监测和药动学研究。
关键词：炙甘草汤；甘草次酸；药动学；LC-MS/MS；白藜芦醇
中图分类号：R285.61 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)08 - 1580 - 05
Pharmacokinetic study on glycyrrhetinic acid in rats ig administrated by
Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata Cum Melle Decoction
LUO Xiong1, 3, HU Rui-gang1, 3, CHEN Lan-ying1, 3, HUANG Hui-lian1, 2, WANG Mu-lan1, 3, GONG Qin1, LIU Rong-hua1, 2
1. The National Pharmaceutical Engineering Center for Solid Preparation in Chinese Materia Medica, Nanchang 330006, China
2. Key Laboratory of Modern Preparation of Chinese Materia Medica, Ministry of Education, Nanchang 330004, China
3. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330006, China
Abstract: Objective To establish an LC-MS/MS method for determination of glycyrrhetinic acid (GA) in plasma after ig
administration of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata Cum Melle (Zhigancao) Decoction in rats in vivo. Methods Treating
plasma with ethyl acetate protein precipitation and taking reseveratrol was used as the internal standard (IS), the residues were analyzed
with LC-MS/MS system (Agilent ORBAX SB-C18 RP column, 50 mm × 2.1 mm, 1.8 μm) with the mobile phase consisted of
acetonitrile-water (80 : 20, 0.2% formic acid), flow-rate of 0.2 mL/min, and column temperature of 30 ℃. Agilent 6410 triple quad
mass spectrometer system with an electrospray ionization (ESI) source and negative ion mode was used as the detector in this study.
Multi-reaction monitoring (MRM) was used to detect GA by using ion combinations of m/z 469.4→425.4 for GA and 227.1→143.0
for IS. Results The calibration curve showed good linear regression (R2 = 0.997 1) within measurement ranges (33.4—8 560.0
ng/mL). Both the intra- and inter-day precision and variation RSD were less than 10%. The average recovery rates at low, medium, and
high concentrations of GA were 75.3%, 78.2%, and 78.5%, respectively. Under these conditions, the pharmacokinetic parameters of GA in
plasma of rats after ig administration of Zhigancao Decoction were tmax (8.00 ± 1.13) h, Cmax (811.02 ± 300.25) ng/mL, and
AUC0-24 (11 439.21 ± 3 367.36) ng/mL·h. Conclusion The method provides a sensitive, accurate, precise, and reliable analytical
procedure for detecting GA in rat plasma and studying its pharmacokinetics.
Key words: Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata Cum Melle (Zhigancao) Decoction; glycyrrhetinic acid (GA); pharmacokinetics;
LC-MS/MS; reseveratrol

收稿日期：2010-10-15
基金项目：国家“十一五”科技支撑计划资助项目（2006BAI08B04-10）
作者简介：罗 雄，男，硕士研究生，研究方向为中药药效及其作用机制研究。
*通讯作者 陈兰英 Tel: (0791)7119611 E-mail: clyxy2513@163.com
刘荣华 Tel: (0791)7119010 E-mail: rhliu@163.com
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炙甘草汤出自《伤寒论》，由炙甘草、生地黄、
人参、阿胶、麦冬、大枣等 9 味药材组成，是治疗
“脉结代、心动悸”的经典名方。现代药理研究表明，
炙甘草汤及其有效成分甘草酸、人参皂苷等能够明
显拮抗各种化学和物理因素诱发的心律失常[1-3]，能
够明显延迟心肌触发活动的发生、降低心肌细胞的
自律性和兴奋性[4-6]。然而，迄今为止，国内外尚未
见炙甘草汤活性成分的体内过程和药动学研究报
道。有研究表明，甘草酸经肠道吸收后，受肠道菌
群的影响，大部分以甘草次酸（glycyrrhetinic acid，
GA）的形式进入血液[7]，甘草次酸的药理作用广泛[8]，
本课题组前期利用 LC-MS/MS 仅检测个别大鼠血
浆中微量的甘草酸，不足以作为药动学研究指标。
鉴于此，根据文献报道[9-10]，本实验采用 LC-MS/MS
法，建立了大鼠血浆中甘草次酸的测定方法，并对
其进行了药动学研究，本方法灵敏度高，专属性强，
为炙甘草汤的深入研究奠定了良好的基础。
1 材料
1.1 仪器
Agilent 1200 液相色谱—Agilent 6410 三重串联
四级杆质谱联用系统（美国，Agilent），Thermo IEC
高速离心机（Micromax RF）、BF—2000 氮气吹干
仪（八方世纪）、XW—80A 漩涡混合器（上海青浦
沪西仪器厂）、SZ—93A 自动双重纯水蒸馏器（上
海亚荣生化仪器厂）。
1.2 试药
炙甘草汤原方药材均购于江西中医学院附属医
院中药房，经江西中医学院刘荣华教授鉴定均符合
《中国药典》2005 年版标准，炙甘草汤按照传统工
艺提取后浓缩为生药 1.6 g /mL。甘草次酸（中国药
品生物制品检定所，批号 110823200401），白藜芦
醇（天津尖峰天然产物研究公司，批号 G050804）。
1.3 试剂
乙腈、甲酸（色谱纯，Merck 公司），其他试剂
均为分析纯，高纯度液氮（由南昌大学提供）。
1.4 动物
SD 大鼠，雄性，体质量（260±20）g，由江
西中医学院实验动物中心提供，动物质量合格证号
为 SCXK（沪）2008－0016。
2 LC-MS/MS 分析
2.1 色谱条件和质谱条件
2.1.1 色谱条件 ORBAX SB-C18 色谱柱（Agilent，
50 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱温 30 ℃，流动相为乙
腈-水（80∶20，含 0.2%甲酸），体积流量 0.2 mL/min，
进样量 10 μL。
2.1.2 质谱条件 电喷雾（ESI）离子源，负离子模
式，雾化压力 275.792 kPa，离子源温度 330 ℃，保
护气流量 10 L/min，毛细管电压 3 500 V，裂解电压
为 110 V（甘草次酸）和 130 V（白藜芦醇），扫描模
式为多反应监测（MRM），甘草次酸 m/z 为 469.4/425.4
（M-COOH），白藜芦醇为 227.1/143（M-C6H12）。
2.2 对照品及内标溶液配制
2.2.1 对照品溶液配制 精密称取甘草次酸对照品
2.14 mg置 5 mL量瓶中，用甲醇配制成 0.428 mg/mL
储备液。取适量上述储备液用甲醇稀释成 33.4、
66.9、133.8、267.5、535.0、1 070.0、2 140.0、4 280.0、
8 560.0 ng/mL 的系列溶液，备用。
2.2.2 内标溶液的配制 精密称取白藜芦醇 1.03
mg 置 500 mL 量瓶中，用甲醇配制成 2.06 μg/mL 的
内标溶液，备用。
2.3 血浆样品处理与测定
精密取血浆样品 0.2 mL，加入 2.06 μg/mL 内标
溶液 0.1 mL，醋酸乙酯 3 mL，涡旋振荡 10 min，4 000
r/min 离心 10 min。吸取上清液，于 40 ℃氮气吹干，
残留物加 0.2 mL 乙腈-水（80∶20，含 0.2%甲酸），
涡旋振荡 5 min 溶解，用 0.22 μm 微孔滤膜滤过，
取 10 μL 滤液进样分析。
2.4 方法专属性考察
采用 MRM 方式。分别取空白大鼠血浆及大鼠
给药后血浆样品 0.2 mL，按“2.3”项操作处理，甘
草次酸和内标白藜芦醇的保留时间分别为 7.5、0.96
min。结果表明，专属性强、灵敏度高，分离效果
良好，血浆中内源性物质无干扰，见图 1。
2.5 线性关系考察
取空白血浆 0.2 mL 共 9 份，分别加入甘草次酸
系列对照品溶液（33.4、66.9、133.8、267.5、535.0、
1 070.0、2 140.0、4 280.0、8 560.0 ng/mL）和内标
溶液各 0.1 mL，按“2.3”项操作处理，进样 10 μL，
记录色谱图。以甘草次酸和内标物峰面积比值为纵
坐标（A），甘草次酸质量浓度（C）为横坐标，采
用加权最小二乘法进行回归，权重系数为 1/C2，求
得回归方程为 A＝0.004 C＋0.062，（R2＝0.997 1）。
甘草次酸在 33.4～8 560.0 ng/mL 线性关系良好。
2.6 提取回收率
取空白血浆 0.2 mL，按“2.5”项下方法分别加
入内标溶液 0.1 mL 和质量浓度为 33.4、535.0、8 560.0
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A-空白血浆 B-空白血浆加甘草次酸 C-空白血浆加内标 D-空白血浆加内标和甘草次酸 E-大鼠 ig 炙甘草汤后血浆样品加内标 1-内标 2-甘草次酸
A-blank plasma B-blank plasma spiked with GA C-blank plasma spiked with IS D-blank plasma spiked with IS and GA E-rat plasma after ig
administration of Zhigancao Decoction and spiked with IS 1-IS 2-GA
图 1 甘草次酸血浆样品的 LC-MS/MS 色谱图
Fig. 1 LC-MS/MS chromatograms of GA in rat plasma
ng/mL的甘草次酸对照品溶液0.1 mL配制成低、中、
高 3 个质量浓度的血浆样品各 5 个样本；另取空白
血浆 0.2 mL，不加对照品溶液和内标溶液，按“2.5”
项下方法操作，向获得的醋酸乙酯上清液中加入相
应浓度的对照品溶液 0.1 mL 和内标 0.1 mL，涡旋
混合，40 ℃氮气吹干，残留物加 0.2 mL 乙腈-水
（80∶20，含 0.2%甲酸），涡旋振荡 5 min 溶解，0.22
μm 微孔滤膜滤过。以上 2 种方法处理的样品取 10
μL 进样分析，获得相应色谱峰面积（3 次测定的平
均值）。以同一质量浓度两种处理方法的峰面积比值
计算提取回收率，甘草次酸在低、中、高 3 个质量
浓度的提取回收率分别为 75.3%（RSD＝7.5%）、
78.2%（RSD＝4.6%）、78.5%（RSD＝3.2%），内
标白藜芦醇的提取回收率为 86.1%（RSD＝
2.1%）。
2.7 精密度考察
取空白血浆 0.2 mL，分别加入内标溶液和质量
浓度为 33.4、133.8、535.0、2 140.0、8 560.0 ng/mL
的甘草次酸对照品溶液 0.1 mL，每一质量浓度进行
6 个样本分析，按“2.5”项下方法进行样品处理，
连续测定 3 d，求得方法精密度的 RSD，5 种质量浓
度对照品溶液的日内精密度的 RSD 分别为 6.7%、
5.4%、3.3%、2.5%、3.1%，日间精密度的 RSD 分
别为 7.9%、4.5%、5.3%、2.2%、2.7%，均符合生
物样品分析方法指导原则的有关规定。
2.8 样品稳定性
取空白血浆 0.2 mL，加入低、中、高 3 个质量
浓度（33.4、535.0、8 560.0 ng/mL）的甘草次酸对
照品溶液 0.1 mL，涡旋混匀后，每个浓度的样品分
别取 3 个样本在室温下放置 4 h、−20 ℃冰箱放置 1
个月和反复冻融 3 次后，加入内标溶液 0.1 mL，按
“2.3”项操作处理，进样 10 μL，记录色谱图，考察
样品的放置稳定性和冻融稳定性。另取空白血浆 0.2
mL，加入质量浓度分别为 33.4、535、8 560 ng/mL
的甘草次酸对照品溶液 0.1 mL 配制低、中、高 3
个质量浓度的样品各 3 个样本，于室温保存 24 h 后
加入内标溶液 0.1 mL，按“2.5”项下方法分别测定。
3 个质量浓度样品在室温下放置 4 h 所得 RSD 分别
为 6.5%、2.3%、4.2%，反复冻融 3 次所得 RSD 分
别为 8.6%、5.2%、3.6%，−20 ℃放置 1 个月所得
RSD 分别为 3.3%、1.7%、2.6%，经过处理后 24 h
所得 RSD 分别为 8.7%、5.6%、7.3%。结果表明甘
草次酸血浆样品在室温条件下至少能稳定 4 h，在冰
冻条件下至少能稳定 30 d；反复冻融 3 次并不影响
血药浓度，经过处理后的血浆样品在室温条件下至
少能稳定 24 h。



A B C
D E
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9
t / min
1
2 1
2
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3 药动学研究
3.1 受试药物溶液的制备
炙甘草汤水煎液的制备：按炙甘草汤传统的煎
煮工艺制备成水煎液，取药材（炙甘草 12 g，生姜
9 g，桂枝 9 g，人参 6 g，生地黄 50 g，阿胶 6 g，
麦冬 10 g，麻仁 10 g，大枣 10 枚）加入适量的蒸
馏水浸泡 0.5 h，然后用武火加热，待沸腾后再用
文火煎煮 1 h，重复 3 次，合并 3 次水煎液，加入
阿胶烊化，滤过，浓缩至生药 2 g/mL，于 4 ℃冰
箱保存备用。
3.2 大鼠血浆样品的采集
5 只 SD 大鼠 ig 炙甘草汤水煎液（给药量为生
药 30 g/kg）。给药后 5、15、30、45 min 和 1、1.5、
2、3、4、6、8、12、24 h 眼眶后静脉取血 0.5 mL，
置肝素化的离心管中，3 000 r/min，离心 15 min 分
离血浆，取血浆于样品管中，−80 ℃冰箱保存待测。
3.3 药动学参数
大鼠 ig 给予炙甘草汤水煎液后，血浆样品按
“2.3”项下操作，以当日的标准曲线计算各时间点
样品中甘草次酸的质量浓度，平均血药浓度-时间曲
线见图 2，主要药动学参数（采用药动学软件 DAS
2.0 计算）见表 1。

图 2 大鼠 ig 炙甘草汤后血浆中甘草次酸药-时曲线
Fig. 2 Mean GA concentration-time curve after ig
administration of Zhigancao Decoction
4 讨论
4.1 质谱条件的优化
本实验比较了甘草次酸在电喷雾离子源（ESI）
和大气压化学离子源（APCI）中的响应，结果表明，
ESI 源检测信号响应强度优于 APCI 源。对甘草次
酸在正离子和负离子检测方式下的响应进行比较，
结果显示，负离子检测较正离子信号强度大。采用
ESI 源负离子检测对甘草次酸和内标白藜芦醇进行一
级全扫描，甘草次酸和内标物的分子离子峰[M－H]－
m/z 分别为 469.4 和 227.1，选择其为母离子进行二
表 1 大鼠 ig 炙甘草汤后甘草次酸的药动学参数
( 5=± n , sx )
Table 1 Pharmacokinetic parameters of GA in rats
after ig administration of Zhigancao
Decoction ( 5=± n , sx )
参 数 单 位 甘草次酸
tmax h 8.00±1.13
Cmax ng·mL−1 811.02±300.25
AUC0～24 ng·mL−1·h 11 439.21±3 367.36
t1/2 h 4.96±2.07
级全扫描，甘草次酸的主要碎片离子为 m/z 425.4
和 409.2，前者响应值较高；内标物的主要碎片离子
m/z 为 185 和 143，后者响应值较高，故选二者的主
要离子对m/z 469.4→425.4和 227.1→143.0为MRM
分析的定量离子对。采用 MRM 较选择离子监测方
式（SRM）具有更高的专属性和灵敏度。
4.2 内标物的选择
在内标物的选择过程中，考察了与甘草次酸结
构类似的熊果酸，以及氧化白藜芦醇和白藜芦醇。
结果表明，白藜芦醇与待测物受内源性物质干扰及
仪器波动等因素的影响相近，色谱分离时间短，出
峰时间仅需 0.96 min，且甘草次酸及白藜芦醇在
MRM 监测中信号无相互干扰，最终选择白藜芦醇
为内标。
4.3 检测指标的选取
甘草酸、人参皂苷、麦冬皂苷都是炙甘草汤中
的有效成分，但麦冬皂苷、人参皂苷 Rb1 和人参皂
苷 Rg1 在炙甘草汤中的量太低，ig 给药后血浆中均
无法检测到。而甘草酸为亲水性大分子，在小肠中
不易吸收，仅少量通过主动转运方式进入血液，因
而在血浆中也不易检测到；大部分甘草酸在小肠停
留时，受肠内菌群的作用水解成为甘草次酸，甘草
次酸脂溶性强，易通过肠壁进入血液发挥作用[11]，
故本实验选用甘草次酸为指标成分。
5 结论
本研究采用 LC-MS/MS 法，以白藜芦醇为内
标，以 ESI 为离子源，通过 MRM 方式，首次对大
鼠 ig 炙甘草汤后血浆中甘草次酸进行了测定，建立
了炙甘草汤中甘草次酸的血药浓度检测方法，同时
考察了其药动学过程，为炙甘草汤临床用药提供了
实验依据。
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1 200
1 000
800
600
400
200
0
t / h
血
药
浓
度
/
(n
g·
m
L−
1 )
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