全 文 ：加受损细胞的 PI。由此可见 T P 对 H 2O2所致
PC12 细胞损伤具有保护作用。但是 T P 抑制
H 2O 2诱导 PC12 细胞损伤的机制尚需进一步研究。
参考文献:
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咖啡酸在大鼠体内两个葡萄糖醛酸结合物的分离与鉴定
魏 玲1, 3 , 周茂金2, 4 , 张铁军3 ,侯文彬3 ,王丽莉3 ,许 浚3
( 1 天津医科大学, 天津 300070; 2 天津药物研究院 药效与药代动力学国家重点实验室,天津 300193;
3 天津药物研究院,天津 300193; 4 山东省泰安市中心医院,山东 泰安 271000)
摘 要: 目的 研究咖啡酸在大鼠体内的代谢,并对咖啡酸在大鼠尿中两个葡萄糖醛酸结合物进行分离及结构鉴
定。方法 大鼠按 100 mg / kg ig 给予咖啡酸后收集尿样,以 LC-MS/ MS 方法分析追踪代谢产物, 采用大孔树脂、
ODS 开放柱、Sephadex LH-20 和制备型高效液相色谱分离代谢产物。结果 给药后尿样中检测到 4 种二相代谢
产物,分别为 2个咖啡酸葡萄糖醛酸结合物和 2 个咖啡酸硫酸结合物。结论 咖啡酸在大鼠体内广泛代谢, 首次
采用分离方法获得 2 个咖啡酸葡萄糖醛酸结合物, 并对其结构进行了鉴定。
关键词: 咖啡酸; 代谢; 咖啡酸-3-O--D-葡萄糖醛酸; 咖啡酸-4-O--D-葡萄糖醛酸
中图分类号: R285 51 文献标识码: A 文章编号: 0253- 2670( 2010) 06- 0949- 04
咖啡酸 ( caf feic acid, 3, 4-二羟基肉桂酸) 属于
酚酸类化合物, 存在于小蓟、金银花、杜仲、牛至、茵
陈、蒲公英等多种药用植物中。研究表明咖啡酸具
有广泛生物学活性, 如抗氧化[ 1, 2]、抗病毒[ 3] 、降血
压[ 4] 、降血糖[ 5] 等。由于其多效低毒的特性, 在医药
领域受到越来越多的关注。国内外关于咖啡酸代谢
方面的研究也日趋增多。已有学者[ 6, 7]给大鼠 ig 咖
啡酸后通过 LC/ MSn方法在尿样中检测到了咖啡酸
葡萄糖醛酸结合物、咖啡酸硫酸结合物、咖啡酸甲基
化代谢产物 (阿魏酸和异阿魏酸) 及其葡萄糖醛酸
和硫酸结合物等。A zuma 等[ 8] 测定酶水解前后大
鼠血浆中咖啡酸的浓度, 结果表明咖啡酸主要以葡
萄糖醛酸和硫酸结合物形式存在,其中葡萄糖醛酸
结合物的浓度最高。但已有的研究[ 6, 7] 只是根据质
谱断裂规律推测了这些代谢产物的结构, 并没有对
这些代谢产物的结构进行确认。为进一步研究咖啡
酸在大鼠体内的代谢, 本研究采用 LC-M S/ M S 分
析追踪主要代谢产物, 用大孔树脂、ODS 等开放柱
色谱及制备型高效液相色谱对其进行分离, 从大鼠
尿中获得两个葡萄糖醛酸结合物,并通过波谱学手
949中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 6 期 2010年 6月
收稿日期: 2009-12-29 作者简介:魏 玲( 1984 ) ,女,天津人,硕士,研究方向为天然药物体内代谢研究。
Tel: 15902262960 E-mail: sincerew eilin g@ 163. com
段对其结构进行鉴定。
1 仪器与材料
Finnig an LCQ advantage max 型液质联用仪
(美国 Thermo Quest公司) , 560 型红外光谱仪 (美
国 Nico let 公司) , KBr 压片; 1601 型紫外分光光度
计 (日本岛津公司) ; AV 400型核磁共振仪 (德国
Bruker 公司) ; IONSPEC 7 0T FTICR 型高分辨质
谱仪 (美国瓦里安公司) , 创新通恒制备型高效液相
色谱仪 (北京创新通恒科技有限公司) , 大孔树脂
HPD-100 (沧州宝恩化工有限公司) , ODS 填料 (天
津博瑞键合色谱技术有限公司) , Sephadex LH-20
(美国通用电气公司)。
咖啡酸 (质量分数 98%, 天津金测分析技术有
限公司) ,甲醇 (色谱纯) , 其他试剂为分析纯, 均购
于天津康科德科技有限公司。
SD 大鼠, 雌雄兼用, 体质量 250~ 300 g, 由中
国协和医科大学放射医学研究所提供。
2 方法
2 1 LC-MS/ MS 方法测定二相代谢物:两只大鼠按
100 mg/ kg ig 给予咖啡酸,收集 0~ 4 h 尿样,取适量
尿样加入等量乙腈,涡旋震荡 1 min,以 12 000 r/ min
离心 10 min,吸取上清液, 经 0. 45 m 微孔滤膜滤
过,吸取续滤液 20 L 进行 LC-MS/ MS 分析。
2 2 色谱及质谱条件: Welch 色谱柱 ( 250 mm
4. 6 mm , 5 m) , 流动相: 甲醇-1% 冰醋酸 ( 20
80) ,体积流量: 0. 4 mL/ min,检测波长: 320 nm, 柱
温: 35 。质谱采用 ESI 负离子方式监测, ESI 源
电压为 3. 5 kV,毛细管温度为 250 ,喷雾电流为
80. 0 A, 鞘气 ( N 2 ) 体积流量为 30. 0 arb, 载气
( N 2 ) 体积流量为 6. 0 arb, 毛细管电压为 32. 0 V,
管透镜补偿电压为 55. 0 V。
2 3 动物实验: 20 只 SD 大鼠,雌雄兼用, 体质量
250~ 300 g, 固定于代谢笼中, 按 100 mg/ kg 剂量
ig 给予咖啡酸, 每天 ig 两次,收集 0~ 12 h 尿样,持
续给药两周。将收集的尿样离心除去残渣,冰箱中
冷冻保存,待分离用。
2 4 代谢产物的制备:将尿样约 800 mL 加入 3倍
量甲醇沉淀蛋白等杂质, 上清液于 40 下浓缩至
约 400 mL, 用 10% 盐酸调节 pH 值至 3, 用相当 2
倍体积尿样的 HPD100 大孔树脂柱处理, 依次用
水、40% 乙醇、95% 乙醇洗脱,其中 40% 乙醇洗脱
部分上样 ODS 开放柱色谱, 依次用水、3% 甲醇、
5% 甲醇、10% 甲醇、20% 甲醇、30% 甲醇洗脱,其
中 5% 甲醇洗脱部分经 Sephadex LH-20 柱色谱反
复纯化后得到代谢物 ( 20 mg) , 3% 甲醇洗脱部分
经制备型高效液相色谱纯化后得到代谢物
( 15 mg )。
3 结果
3 1 二相代谢物的 LC-MS/ M S 方法测定:大鼠 ig
给药后 0~ 4 h 尿样总离子流色谱图 (图 1) 中发现
除原形药 ( M 0) 准分子离子 m/ z 179 外, 还发现准
分子离子 m/ z 355 的代谢物 ( M1)、( M 2) 和准
分子离子 m/ z 259的 ( M3)、( M 4)。根据代谢
物、、、的二级扫描质谱图(图 2)推测 、
为咖啡酸的葡萄糖醛酸结合物, 、为咖啡酸的硫
酸结合物[ 6, 7] 。
图 1 大鼠 ig 咖啡酸 ( 100 mg kg- 1) 后 0~ 4 h 尿中
原形药及其代谢物 ~ 的色谱图
Fig. 1 Chromatograms of M0 and its metabolites in rat
urine 0 4 h after ig caff eic acid ( 100 mg kg- 1)
3. 2 代谢产物结构鉴定
代谢物 : 白色无定形粉末: IR KBrmax ( cm- 1 ) :
3 395 ( - OH ) , 1 687 ( C= O)。由一级全扫描质谱
分析 m/ z : 355 [ M - H ] - , 比原形药咖啡酸相对分
子质量多 176,二级全扫描质谱分析中, 可得碎片离
子 m/ z 179,脱去一分子葡萄糖醛酸基,表明其为咖
啡酸葡萄糖醛酸结合物。由 HR-ESI-M S m/ z :
355. 062 1 [ M- H ] - 确定分子式为 C15H 16O 10。从
1H-NMR和13 C-NMR 推得葡萄糖醛酸的存在[端
基 HH 5. 03, 1H , d, J = 6. 8 Hz; C 101. 4 ( C-1) ,
72. 9 ( C-2) , 75. 4 ( C-3) , 71. 8 ( C-4) , 76. 4 ( C-
5) , 173. 8 ( C-6) ]。代谢物苷元结构的1H-NMR
和13C-NMR 数据与咖啡酸[ 7] 是一致的 (表 1 )。
HMBC 谱 (图 3) 显示糖醛酸的端基质子 H 5. 03
与 C-3 (145 6) 有远程相关性, 推测咖啡酸与葡萄
糖醛酸的连接位置在 C-3 上。根据 1H-NMR、13 C-
NMR、HSQC、HMBC 谱信号, 并参照文献 [ 9] , 最
终确定代谢物 的结构为咖啡酸-3-O--D-葡萄糖
醛酸。
950 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 6 期 2010年 6月
图 2 代谢物 ~ 的二级全扫描质谱图
Fig. 2 Mass spectra of [M- H] - of metabolites
代谢物 : 白色无定形粉末: IR KBrmax ( cm- 1 ) :
3 407 ( - OH ) , 1 685 ( C= O)。由一级全扫描质谱
分析比原形药咖啡酸相对分子质量多 176, 表明其
为咖啡酸葡萄糖醛酸结合物, 是代谢物 的同分异
构体。由 HR-ESI-M S m/ z : 355. 063 7 [ M - H ] -
确定分子式为 C15 H 16 O 10。从 1H-NMR 和 13 C-
NMR 推得葡萄糖醛酸的存在 [端基 HH 5. 09,
1H , d, J = 7. 2 Hz; C 100. 8 ( C-1) , 72. 8 ( C-2) ,
75. 4 ( C-3) , 71. 9 ( C-4) , 76. 5 ( C-5) , 173. 0 ( C-
6) ]。代谢物苷元结构的1H-NMR 和 13 C-NMR
数据与代谢物 非常相似 (表 1) ,只有苷元部分的
13
C-NMR 数据略有不同。HMBC 谱 (图 3) 显示糖
醛酸的端基质子 H 5. 09与 C-4 ( 145 8) 有远程相
关性,推测咖啡酸与葡萄糖醛酸的连接位置在 C-4
上。根据 1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC 谱信
号,并参照文献[ 9] , 最终确定代谢物 的结构为咖啡
酸-4-O--D-葡萄糖醛酸。
表 1 代谢物和的1H-NMR (400 MHz) 和13C-NMR
(100 MHz) 数据 (D2O为测试溶剂)
Table 1 1H-NMR ( 400 MHz) and 13C-NMR (100 MHz)
Data of metabolites and ( in D2O)
编号
代谢物
C H
代谢物
C H
1 127 3 130 5
2 116 8 7 26( 1 H, br s) 115 4 7 15( 1 H, over lap)
3 144 9 146 5
4 148 4 145 8
5 117 0 6 88( 1 H, d, 8. 4 Hz) 116 7 7 10( 1 H, over lap)
6 125 2 7 15( 2 H, br d) 121 9 7 13( 1 H, over lap)
7 145 6 7 45( 1 H, d, 16 Hz) 143 6 7 43( 1 H, d, 16 Hz)
8 116 0 6 21( 1 H, d, 16 Hz) 119 4 6 35( 1 H, d, 16 Hz)
9 171 8 170 0
1 101 4 5 03( 1 H, d, 6. 8 Hz) 100 8 5 09( 1 H, d, 7. 2 Hz)
2 72 9 3 62( H, overlap) 72 8
3 75 4 3 58( H, overlap) 75 4 3 57~ 3 66 ( 3 H, m)
4 71 8 3 57( H, overlap) 71 9
5 76 4 3 88( 1 H, d, 8. 8 Hz) 76 5 3 86( 1 H, d, 9. 2 Hz)
6 173 8 173 0
图 3 代谢物和的结构及其关键 HMBC ( H C) 相关
Fig. 3 Structure and key HMBC ( H C) correlations of metabolites and
951中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 6 期 2010年 6月
4 讨论
4 1 用 LC/ M Sn方法分析鉴定咖啡酸在大鼠体内
代谢产物,并推测其代谢规律已有文献报道[ 6, 7, 10] ,
但根据 LC/ M Sn质谱数据只能推测代谢产物的结
构,一般要通过与化学合成或生物转化等方法得到
的纯物质进行色谱及质谱特征对照确定其结构, 或
者通过化学分离手段获得代谢产物, 并通过光谱学
方法确证其结构。本研究从尿样中分离并通过
NMR 法确证了两个葡萄糖醛酸结合物的结构, 与
文献推测的结果是一致的[ 6, 7] 。
4 2 实验过程中发现代谢物 ~ 室温放置容易
变化,须放至冰箱中冷冻保存,否则降解为原形药咖
啡酸。
4 3 进行大孔树脂处理时,尿样调节 pH 3 不会对
尿样中代谢产物产生影响。
4 4 代谢物 和 为国内首次分离得到的化合物,
国外作者[ 11]以咖啡酸甲酯为底物合成了这两个代
谢物。
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1214
土槿乙酸联合 9-顺式维甲酸促进白血病细胞凋亡的机制研究
郭 赟1 ,徐瑞成2 ,何 滔3
( 1 武警医学院附属医院 内分泌血液科,天津 300162; 2 武警医学院 科研部,天津 300162;
3 武警医学院附属医院 病理科,天津 300162)
摘 要: 目的 观察过氧化物酶体激活物活化受体 ( PPAR)的配体土槿乙酸 ( PLAB) 联合维甲类 X 受体
( RXR)的配体 9-顺式维甲酸 ( 9- cis RA) 促进白血病细胞凋亡的作用, 探讨其作用机制。方法 应用透射电子显
微镜、琼脂糖凝胶电泳分析 HL-60 细胞凋亡, RT-PCR 检测 H L-60 细胞 Cyclin D1 和 CDK4 mRNA 表达。结果
H L-60 细胞经配体联合作用后,电镜下可见明显细胞凋亡的形态学变化, 琼脂糖凝胶电泳出现 DNA Ladder , Cyc-
lin D1 及 CDK4 mRNA 的表达均降低,且联合用药组下降程度明显较单独作用组大 (P < 0 05)。结论 PLAB 联
合 9- cis RA 抑制 H L-60 细胞生长,其机制与凋亡诱导效应相关。
关键词: 土槿乙酸; 9-顺式维甲酸; 白血病; 细胞凋亡; Cyclin D1; CDK4
中图分类号: R286 91 文献标识码: A 文章编号: 0253- 2670( 2010) 06- 0952- 04
土槿乙酸 ( pseudo lar ic acid B, PLAB) 是从土
槿皮中分离出的主要成分之一, 是过氧化物酶体激
活物活化受体 ( pero xisome pro liferato rs act ivated
receptor gamma, PPAR) 激动剂, 可介导肿瘤细
胞生长抑制和凋亡[ 1~ 3] 。9-顺式维甲酸 ( 9- ci s RA)
是改变多烯侧链结构合成的第 3代维甲酸, 是维甲
952 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 6 期 2010年 6月
收稿日期: 2009-10-14 基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30901985)作者简介:郭 赟( 1982 ) ,女,硕士,医师,主要从事恶性血液病的防治研究。E-mail: 1982guoyun@ 163. com
* 通讯作者 徐瑞成 E-m ail: xu_rc@ sohu. com