全 文 ：·药理与临床·
半边旗提取物 5F诱导 HepG2 细胞凋亡与 p53 活化
及血管内皮生长因子抑制有关
李 　立1 ,吕应年1 ,刘 　义1 ,吴科锋1 ,陈 　功2 ,梁念慈1 ,3 3
(11 广东医学院 广东天然药物研究与开发重点实验室 ,广东 湛江 　524023 ; 21 香港中文大学韦尔斯亲王医院
外科学系 ,中国 香港 ;31 广东医学院 生物化学与分子生物学研究所 ,广东 湛江 　524023)
摘 　要 :目的 　观察半边旗提取物 Ent211α2hydroxy2152oxo2kaur2162en2192oic2acid (5F) 对人肝癌细胞 Hep G2 增殖
的影响 ,并探讨 p53、血管内皮生长因子 (V EGF) 及 Caspase23 在 5F 诱导的 Hep G2 细胞凋亡中的作用。方法
采用 M TT 分析检测 5F 对 Hep G2 细胞增殖的影响 ,并通过细胞凋亡检测 EL ISA 试剂盒分析经 5F 处理的
Hep G2 细胞胞浆核小体片段 ,以确定 5F 能否诱导细胞凋亡 ,采用 Hoechst/ PI 分析鉴定凋亡细胞核形态。通过免
疫印迹 (Western blotting) 分析测定 p53 及 V EGF 蛋白表达水平 ,并通过 Caspases23 分光光度法检测试剂盒检测
Caspase23 活性。结果 　通过细胞活性分析证实 ,5F 对 Hep G2 的细胞毒作用随着 5F 质量浓度的升高而增强。5F
诱导 Hep G2 产生胞浆核小体片段 ,并且该诱导作用具有剂量依赖性。5F 处理后 ,凋亡变化 ,如染色质浓缩 ,被
Hoechst/ PI 染色所确定。5F 处理后 Hep G2 细胞核内 p53 表达水平显著提高 ,而胞浆 V EGF 表达水平却下降 ,同
时 ,Caspase23 活性通过浓度依赖方式增强。结论 　5F 所诱导的 Hep G2 细胞凋亡与 p53 及 Caspase23 活化、
V EGF 负调控有关。5F 可能具有抗癌尤其是抗肝细胞癌价值。
关键词 :半边旗 ; 5F ; 肝癌 ; 细胞凋亡
中图分类号 :R28515 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 2670 (2010) 02 0241 05
Apoptosis in HepG2 cells induced by Pteris semi pinnata extract 5F
involves p53 activation and VEGF inhibition
L I Li1 , L Β Ying2nian1 , L IU Yi1 , WU Ke2feng1 , CH EN George G2 , L IAN G Nian2ci1 ,3
(11 Guangdong Key Laboratory for Research and Development of Natural Drugs , Guangdong Medical College ,
Zhanjiang 524023 , China ; 2. Department of Surgery , Prince of Wales Hospital , The Chinese University
of Hong Kong , Hong Kong , China ; 3. Institute of Biochemist ry and Molecular Biology ,
Guangdong Medical College , Zhanjiang 524023 , China)
Abstract : Objective 　To observe t he effect of Pteris semi pi nnat a ext ract , ent211α2hydroxy2152oxo2
kaur2162en2192oic2acid (5F) , on human hepatoma Hep G2 cells about t he p roliferation and to investigate t he
role of p53 , V EGF , and Caspase23 in 5F2induced Hep G2 cell apoptosis. Methods 　M T T Assay was used
to determine t he effect of 5F on proliferation of Hep G2 cells , and cytoplasmic mono2 and oligonucleosomes
of Hep G2 cells t reated with 5F was assessed with Cell Deat h Detection EL ISA Kit for determining whet her
5F can induce apoptosis. Apoptotic nuclear morp hology was assessed using Hoechst/ PI assay. The effect
on t he expression levels of p53 and V EGF p rotein in Hep G2 cells was detected by Western blotting analy2
sis , and Caspase23 activity was measured by a Caspase23 Colorimet ric Assay Kit . Results 　The cytotoxicity
of 5F on Hep G2 cells was elevated wit h 5F concent ration increasing. Cytoplasmic mono2 and oligonucleo2
somes were induced by 5F in Hep G2 cells , and the induction was in a concent ration2dependent manner .
After t reat ment wit h 5F , t he apoptotic change such as chromatin condensation was confirmed by Hoechst/
PI staining. The level of p53 in nucleus was significantly elevated in Hep G2 cells af ter 5F t reat ment , but
t he level of V EGF in cytosol was decreased. Moreover , t he activity of Caspase23 increased in a concent ra2
tion2dependent manner. Conclusion 　5F mediated apoptosis involves p53 and Caspase23 activation , V EGF
down regulation in Hep G2 cells. 5F might have a t herapeutic value against human cancer cell lines and es2
·142·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 2 期 2010 年 2 月
3 收稿日期 :2009205205　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (3987099) ; 香港特别行政区政府创新科技基金资助项目 ( GHP/ 022/ 06)
作者简介 :李　立 (1969 —) ,男 ,江苏盐城人 ,助理研究员 ,博士 ,主要从事肿瘤分子病理及天然药物研究。
Tel : (0759) 2388405 　E2mail : LL524 @yahoo. cn3 通讯作者　梁念慈　Tel : (0759) 2388501 　E2mail : ncliang @gdmc. edu. cn
pecially on hepatocellular carcinoma ( HCC) cells.
Key words : Pteris semi pi nnata L . ; ent211α2hydroxy2152oxo2kaur2162en2192oic2acid (5F) ; hepatocellu2
lar carcinoma ( HCC) ; apoptosis
　　半边旗 Pteris semi pi nnat a L . 又名半边莲、半
边菊 ,属凤尾蕨科植物 ,广泛分布于中国南方各省 ,
作为中草药曾用于肝炎、肠炎及毒蛇咬伤等疾病的
治疗。本课题组经多年研究发现 ,半边旗的一些乙
醇提取物对多种细胞具有细胞毒作用 ,其中 ,二萜类
化合物 ent211α2hydroxy2152oxo2kaur2162en2192oic2
acid (5F) 显示了较强抗肿瘤活性[1 ,2 ] 。为了进一步
探讨 5F 的抗肿瘤活性及其作用机制 ,本研究首次
检测了半边旗提取物 5F 对人肝癌细胞株 Hep G2
增殖活性的影响 ,测定了由 5F 所诱导的肿瘤细胞
内 p53 蛋白、血管内皮生长因子 ( V EGF) 蛋白及
Caspase23 蛋白活性的表达变化 ,并初步探讨了 5F
诱导 Hep G2 发生凋亡的可能机制 ,以期为进一步
研究 5F 治疗肝癌的可行性奠定基础。
1 　材料
111 　药品 :半边旗乙醇提取物二萜类化合物 5F 干
粉由本实验室 (广东天然药物研究与开发重点实验
室) 提供 (质量分数为 92 %) ,经丙二醇溶解 ,蒸馏
水稀释 ,制成丙二醇体积分数为 15 %、5F 质量浓度
为 1 000 mg/ L 的储备液 ,除菌滤过后冷藏保存 ,实
验时再以培养基稀释至所需浓度 (丙二醇最终体积
分数 ≤112 %) 。
112 　肿瘤细胞系 : Hep G2 ,具有野生型 p53 的人肝
细胞癌细胞系 ,由本实验室冷冻保存。
113 　主要试剂 :RPMI 1640 培养基干粉 (Sigma 公
司) ;新生牛血清 ( Hyclone 公司) ;青霉素及链霉
素、胰蛋白酶 (Amresco 公司) ;丙二醇、二甲基亚砜
(DMSO) 、M T T ( Sigma 公司) ; Cell Death Detec2
tion EL ISA 试剂盒 ( Roche 公司) ; Hoechst 33258
( Sigma 公司) ;溴化丙啶 (PI ,Sigma 公司) ;蛋白提取
试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒 (凯基公司) ;p53 单克
隆抗体 (博士德公司) ;VEGF 多克隆抗体 (博奥森公
司) ; GAPDH 单克隆抗体 (凯基公司) ;辣根过氧化物
酶标记抗鼠抗体 (santa 公司) ;辣根过氧化物酶标记
抗兔抗体 (santa 公司) ; ECL 化学发光试剂盒、PVDF
膜、Caspase23 分光光度法检测试剂盒 (凯基公司) 。
114 　主要仪器 : YJ —875 医用净化工作台 (苏州净化
设备公司) ;CO2恒温培养箱 (Precision 公司) ; ELx800
酶标仪 (BIO2TEK 公司) ; EPTCSXL —31240 流式细
胞仪 (Coulter 公司) ;荧光显微镜及成像系统 (Lecia
公司) ;垂直电泳仪 (Bio2rad 公司) 。
2 　方法
211 　细胞培养 :人肝癌细胞株 Hep G2 于含 10 %
新生牛血清、100 U/ mL 青霉素、100 U/ mL 链霉素
的 RMPI 1640 培养液内 ,在 37 ℃、含 5 % CO2的饱
和湿度空气中培养。
212 　M T T 法测定肿瘤细胞存活率 :当 Hep G2 生
长面积达细胞培养瓶底面积 80 % 时 ,以 0125 % 胰
酶剥离细胞 ,细胞计数后以培养液调整细胞浓度 ,接
种细胞于 96 孔培养板 ,并确保每孔含细胞 2 000
个。细胞贴壁后换液 ,各实验组添加 5F 并使其终
质量浓度分别为 5、10、20、40、80 mg/ L ,阴性对照
组则加相同体积培养液 ,各组设 8 个平行孔。培养
24 h 后 ,加 M T T 染液 ( M T T 终质量浓度为 015
mg/ mL) ,并继续培养 4 h ,弃上清 ,每孔加 DMSO
100μL ,震荡 5 min 后以酶标仪测定波长 570 nm
处的吸光度 ( A) 值 ,计算肿瘤细胞存活率 (药物组
A 值/ 对照组 A 值 ×100 %) 。
213 　EL ISA 法检测肿瘤细胞凋亡情况 :同上述测
定肿瘤细胞存活率方法 ,接种 Hep G2 细胞于 96 孔
培养板 ,5F 处理 24 h ,同时设阴性对照。采用 Cell
Detection EL ISA 试剂盒 ,根据试剂所附操作程序 ,
在波长 405 nm 处 ,通过酶标仪测定胞浆内核小体
片段水平 ,从而分析细胞凋亡发生情况。
214 　Hoechst/ PI 染色观察细胞形态变化 :接种细
胞于玻片 ,细胞贴壁以 5F 处理 24 h。弃去培养液 ,
PBS 洗涤 ,10μg/ mL Hoechst 37 ℃孵化 15 min ;
PBS 洗涤 ,20μg/ mL PI 低温孵化 15 min。PBS 洗
涤 ,荧光显微镜观察细胞形态变化。
215 　Western blot ting 检测 :接种细胞于 6 孔细胞
培养板 ,细胞贴壁后以 40 mg/ L 5F 处理 ,于处理 0、
3、6、12、24 h 后的不同时间点收集细胞 ,并按照蛋
白提取试剂盒所附操作程序提取细胞核蛋白
(p53) 、胞浆蛋白 ( V EGF) 及细胞全蛋白 ( GA P2
D H) ,以检测细胞核 p53、胞浆 V EGF 及内参 GA P2
D H 的表达水平。以蛋白定量试剂盒测定所提蛋白
浓度 ,分装后冷冻保存。SDS2PA GE 电泳 ,转膜 ;封
闭 1 h 后加一抗 ,4 ℃孵育过夜 ;洗膜后加二抗 ,室
温孵育 1 h ;洗膜、曝光显影 ,采用 Quantity One 软
件分析目标蛋白表达水平。实验重复 3 次。
·242· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 2 期 2010 年 2 月
216 　分光光度法检测 Caspase23 活性 : 接种
Hep G2 于 6 孔细胞培养板 ,细胞贴壁后再分别以
0、5、10、20、40、80 mg/ L 的 5F 处理 ,于处理后 3、6
h 的时间点 ,采用试剂盒所附操作步骤检测肿瘤细
胞内 Caspase23 活化程度。实验重复 3 次。
217 　统计学处理 :采用 SPSS 1310 软件系统的均
数比较分析及单因素方差分析对实验数据进行统计
学处理。
3 　结果
311 　5F 抑制 Hep G2 细胞增殖活性 :M T T 实验结
果显示 5F 明显抑制肿瘤细胞增殖 ,并且 5F 的细胞
毒作用随质量浓度的提高而增强 ,结果见表 1。
表 1 　5F 对 HepG2 细胞增殖的抑制作用 ( x ±s , n = 8)
Table 1 　Inhibition of 5F on proliferation in HepG2
cells ( x ±s , n = 8)
组别 剂量/ (mg ·L - 1) A 值 存活率/ %
对照 0 01 370 ±01026 1001 000
5F 5 01 312 ±01029 841 288 3 3
10 01 305 ±01021 821 530 3 3
20 01 282 ±01030 761 140 3 3
40 01 213 ±01013 571 477 3 3
80 01 185 ±01010 501 039 3 3
　　与对照组比较 : 3 3 P < 0101
　　3 3 P < 0101 vs cont rol group
312 　5F 诱导肿瘤细胞凋亡发生 : EL ISA 分析证实
肿瘤细胞经 5F 处理后 ,其胞浆溶解物吸光度值显
著升高 ,并且随 5F 质量浓度的提高而增强 ,提示
5F 诱导细胞凋亡并产生核小体片段 ,结果见图 1。
与对照组比较 : 3 3 P < 01 013 3 P < 01 01 vs cont rol group
图 1 　5F对细胞溶解物胞浆核小体片段的影响 ( x±s , n = 3)
Fig. 1 　Effect of 5F on mono2 and oligonucleosomes in cyto2
plasmic fraction of cell lysates ( x ±s , n = 3)
313 　5F 诱导肿瘤细胞凋亡所产生的形态变化 :与
对照组细胞核呈淡蓝着色相比 ,5F 处理后的肿瘤细
胞发生核浓缩 ,呈亮蓝着色 ,可呈分叶状或碎片状等
形态学变化 ,结果见图 2。
314 　5F 上调胞核 p53 表达、下调胞浆 V EGF 表
达 :随着 5F 处理时间延长 ,肿瘤细胞核 p53 蛋白表
达存在提高趋势 ( P < 01001) ,而胞浆 V EGF 蛋白
则存在下降趋势 ( P < 01001) ,结果见图 3。
315 　5F 激活 Caspase23 蛋白 :无论是 5F 处理 3 h
还是 6 h ,Caspase23 活化度均随着 5F 质量浓度的
提高而存在上升趋势 ( P < 01001) ,结果见图 4。
A2对照组　B～F25、10、20、40、80 mg ·L - 1 5F 组
A2control group 　B —F20 , 5 , 10 , 20 , 40 , and 80 mg ·L - 1 5F group
图 2 　5F 对 HepG2 细胞形态的影响
Fig. 2 　Effect of 5F on morphologic changes of HepG2 cells
与对照组比较 : 3 3 P < 01 013 3 P < 01 01 vs cont rol group
图 3 　5F 对 HepG2 细胞 p53 及 VEGF 蛋白表达水平的影响
Fig. 3 　Effect of 5F on protein expression level
of p53 and VEGF in HepG2 cells
·342·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 2 期 2010 年 2 月
图 4 　5F 对 HepG2 细胞 Caspase23 蛋白活性的影响
( x ±s , n = 3)
Fig. 4 　Effect of 5F on Caspase23 protein activity
in HepG2 cells ( x ±s , n = 3)
4 　讨论
　　M T T 分析显示 5F 可明显抑制 Hep G2 增殖 ,
并且在相同时间内 ,随着 5F 质量浓度提高 ,抑制率
也增加 ,具有剂量依赖关系。本结果与先前 5F 抑
制卵巢癌、甲状腺未分化癌、胃癌及大肠癌等癌细胞
株增殖活性的研究结果类似[2～5 ] ,提示 5F 具有较
强的肿瘤细胞毒活性。
细胞凋亡是维持发育细胞及成熟细胞处于稳态
的关键机制 ,而细胞凋亡的诱导则是肿瘤对化疗药
物作出反应的决定性因素。最近 ,细胞凋亡在抗癌
药物介导的细胞毒作用中所扮演的角色已越来越引
起关注。在本研究中 , EL ISA 结果显示 5F 可诱导
Hep G2 发生凋亡 ,而且在 5F 与细胞凋亡率之间存
在质量浓度依赖关系 ;通过 Hoechst/ PI 染色可清
楚地观察到经 5F 处理后肿瘤细胞呈凋亡细胞所特
有的形态特征 ,尤其值得注意的是 ,在 Hoechst/ PI
染色分析中 ,几乎未发现着红色的坏死细胞。综上
所述 ,推测 5F 通过诱导 Hep G2 发生凋亡以实现其
细胞毒作用。
“基因卫士”p53 ,一个 DNA 结合转录因子 ,是
过去 20 年里被研究得最为频繁的肿瘤抑制因子之
一[6 ,7 ] 。癌基因表达、DNA 损伤以及其他形式的压
力所致的伤害均可使细胞通过磷酸化或其他修饰方
式稳定 p53 蛋白[6 ,8 ] ,而被稳定的 p53 蛋白则在细
胞核内累积并调控众多促凋亡基因表达 (如 bax、
noxa、PUMA、bid 及 CD95 等) 。此外 ,除了在细胞
核内发挥转录因子功能外 ,p53 蛋白还可在细胞核
外直接与抗凋亡 Bcl22 蛋白 (Bcl22 及 Bcl2xL) 结合
并活化促凋亡 Bcl22 蛋白 (Bax 及 Bak) ,从而实现
其调控线粒体外膜通透性的功效[9 ] 。在本研究中 ,
免疫印迹分析结果提示 ,在经 5F 处理的 Hep G2
内 ,p53 蛋白于细胞核内被激活并累积 ,从而发挥了
传导细胞凋亡信号的功能。
1971 年 , Folkman[ 10 ] 提出肿瘤生长依赖于血管
生成 ,以血管为靶向的治疗将成为一种新的肿瘤治
疗策略。肝癌为一种具有高度血管浸润倾向的肿
瘤 ,与血管新生密切相关[11 ,12 ] 。因此 ,肿瘤血管生
成在肝癌发生、发展过程中发挥了重要作用。目前 ,
已有证据表明 :肝癌血管生成活性与肿瘤血管浸润、
转移及预后不良有关。肿瘤血管生成起始于肿瘤细
胞释放血管生成因子 ,是一个复杂、多步骤过程。在
众多血管生成因子中 ,V EGF 为最早分离出来的血
管生成多肽之一 ,是目前已知的最强、最重要的血管
生成因子。在肝细胞癌发生、发展的整个过程中 ,
V EGF 为肿瘤生长所必需[13 ] ,而通过阻断 V EGF
信号通路治疗肝癌的研究也因此被广泛关注。在本
研究中 ,5F 可显著抑制 V EGF 表达 ,提示 5F 具有
潜在的抗肿瘤血管生成活性 ;而在另一方面 ,由于
V EGF 可直接与肝癌细胞膜上相应受体结合并促
进肿瘤细胞自身生长[14 ] ,所以 5F 还存在通过抑制
V EGF 表达从而控制肿瘤细胞生长、促进细胞凋亡
的可能。
Caspase 家族在细胞凋亡调控过程中发挥了重
要作用。Caspase 活化是回应源于细胞表面受体、
线粒体及内质网死亡诱导信号所诱发细胞凋亡的标
志[15 ] ,尤其是 Caspase 活化 ,在细胞凋亡起始阶段
发挥了关键作用[16 ] 。在本研究中 , 5F 所诱导的
Caspase 活化提示 Caspase 参与了 5F 所诱导的肿
瘤细胞凋亡过程并可能充当了凋亡执行者的作用。
综上所述 ,p53、V EGF 及 Caspase 参与了 5F
所诱导的 Hep G2 细胞凋亡 ,提示半边旗提取物 5F
存在治疗肝癌的潜在价值。目前天然植物产物作为
抗癌药物已愈来愈受到重视 ,一些食用植物活性成
分及其分子标靶也已被鉴定 ,而能否利用半边旗提
取物 5F 活化 p53、阻断 V EGF 这一优势 ,成为靶向
治疗肿瘤、尤其是肝癌药物的有力候选者 ,仍有待进
一步研究探讨。
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重组天花粉蛋白体外诱导宫颈癌 HeLa 细胞 p27 基因去甲基化的研究
尤程程1 ,黄利鸣2 3 ,韩 　钰1 ,王艳林2 ,黄益玲2
(11 三峡大学分子生物研究所 ,湖北 宜昌 　443002 ; 21 三峡大学医学院 病理教研室 ,湖北 宜昌 　443002)
摘 　要 :目的 　研究重组天花粉蛋白 (recombinant t richosanthin , r TCS) 对宫颈癌 HeLa 细胞中 p27 基因甲基化
状态和基因表达的影响。方法 　应用不同质量浓度的 r TCS (20、40、80μg/ mL) 处理体外培养的宫颈癌 HeLa 细
胞后 ,MSP 法检测用药前后细胞中 p27 基因的甲基化状态 ,Real2Time PCR 法检测用药前后细胞中 p27 和 DNA
甲基转移酶21 (DNM T1) mRNA 水平的变化 ,Western2blotting 法检测用药前后细胞中 p27 蛋白表达的变化。结
果 　HeLa 细胞中 p27 基因为低表达 ,基因启动子区 Cp G岛呈部分甲基化状态。40μg/ mL r TCS 处理导致 p27 基
因启动子区 Cp G 岛去甲基化 ;在 20、40、80μg/ mL 的 r TCS 作用 48 h 后 ,p27 基因 mRNA 相对表达水平分别升高
2122、4100、6103 倍 ,p27 蛋白水平表达也逐渐增加 ;宫颈癌 HeLa 细胞中 DNM T1 mRNA 高表达 ,40μg/ mL r TCS
处理 48 h 可至 DNM T1 mRNA 表达水平降低 78 %。结论 　r TCS 通过抑制 DNM T1 ,逆转 p27 基因启动子区
Cp G 岛的甲基化状态 ,使宫颈癌 HeLa 细胞中 p27 基因表达活化。r TCS 能逆转宫颈癌 HeLa 细胞 p27 基因甲基
化状态 ,调控 p27 基因和 DNM T1 的表达。
关键词 :重组天花粉蛋白 ; p27 基因 ; 宫颈癌 ; DNA 甲基化
中图分类号 :R286191 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 2670 (2010) 02 0245 05
I n vit ro introduction of recombinant trichosanthin on demethylation of p27 in HeLa cells
YOU Cheng2cheng1 , HUAN G Li2ming2 , HAN Yu1 , WAN G Yan2lin1 , HUAN G Yi2ling2
(11 Institute of Molecular Biology , Three Gorges University , Yichang 443002 , China ; 2. Department of Pathology ,
Medical College of Three Gorges University , Yichang 443002 , China)
Abstract : Objective 　To investigate the effect s of recombinant t richosant hin ( r TCS) on met hylation
stat us and expression level of p27 gene in HeLa cells. Methods 　HeLa cells was t reated by different con2
cent ration (20μg/ mL , 40μg/ mL , and 80μg/ mL ) of r TCS for 48 h and then met hylation2specific poly2
merase chain reaction (MSP) was used to detect t he p romoter met hylation stat us of t he p27 gene , real2time
PCR was used to detect levels of p27 and DNM T1 mRNA , and Western blot ting assay was used to detect
expression level of p27 protein before and af ter t reatment wit h r TCS. Results 　Low expression level and
promoter met hylation stat us of t he p27 gene were detected in HeLa cells. Treat ment with 40μg/ mL r TCS
·542·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 2 期 2010 年 2 月
3 收稿日期 :2009206212　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30873282) ; 湖北省自然科学基金资助项目 (2009CDA060)
作者简介 :尤程程 (1984 —) ,女 ,湖北十堰人 ,助教 ,硕士。Tel : (0717) 6397179 　E2mail :yocncn @163. com3 通讯作者　黄利鸣