全 文 ：类药材炙珠的代表性应用。这种可靠的、低成本、高
效、环保的炮制胶珠的方法也可在其他中药胶材中
推广应用。
参考文献:
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六味地黄丸的HPLC指纹图谱和模式识别研究
赵洪芝1, 2 ,孟宪生3* ,叶挺祥1, 2 , 刘征辉1, 2 , 程 奕1, 2 ,罗国安3¹
( 11 天津海世达检测技术有限公司,天津 300381; 21 天津市现代中药质量检验中心, 天津 300381;
31 清华大学 化学系, 北京 100084)
摘 要:目的 研究六味地黄丸的质量控制方法。方法 采用高效液相色谱法, 色谱柱为 Agilent Zorbax SB C18
( 250 mm@41 6 mm, 5 Lm) ,乙腈2水梯度洗脱, 柱温: 30 e ,体积流量: 11 0 mL/ min,检测波长为 236 nm,并利用聚类
分析法和主成分分析法分析结果。结果 通过聚类分析将不同厂家和批次的 25 个样品分为 3 类, 不同剂型的六
味地黄制剂 H PLC指纹图谱存在明显的差异。主成分分析分类结果与聚类分析分类结果一致, 经主成分分析, 8
个共有峰可综合为 3 个主成分, 其累积贡献率达 821 844% ,马钱苷的相对峰面积为六味地黄丸指纹图谱中影响比
较大的指标。结论 此方法可较系统地用于六味地黄丸的质量控制。
关键词:六味地黄丸;指纹图谱;模式识别
中图分类号: R2841 2; R2861 02 文献标识码: A 文章编号: 0253- 2670( 2010)01- 0048- 04
HPLC Fingerprint and chemical pattern recognition of Liuwei Dihuang Pills
ZHAO Hong2zhi1, 2 , MENG Xian2sheng3 , YE T ing2xiang1, 2 , LIU Zheng2hui1, 2 ,
CHENG Yi1, 2 , LUO Guo2an3
( 11 Tianjin High2standard Qua lity Testing Laboratary, T ianjin 300381, China; 21 Tianjin Center for Quality Testing
of TCM, T ianjin 300381, China; 31 Department of Chemistry, T singhua University, Beijing 100084, China)
Abstract: Object ive To establish a method for the quality contr ol of Liuwei Dihuang Pills1 Methods
HPLC Method was developed to establish the fingerprint of Liuwei Dihuang Pills1 The separat ion was per2
formed on Agilent Zor bax SB C18( 250 mm@41 6 mm, 5 Lm) column gradient eluted with the mobile phase
consist ing acetonit rile and water at the flow rate of 11 0 mL/ min1 The detect ion wavelength was 236
nm1Hierarchical cluster analysis (H CA) and principal component analysis ( PCA) were applied to invest i2
gat ing the test data1 Results The HCA result showed that 25 samples from various manufacturers and va2
rious batches can be divided into three groups1 The differences between var ious dosage forms could be ob2
vious1 The classification r esult accor ding to PCA was consistent with the HCA1 The PCA showed that
eight common peaks were integrated into three principal components ( PC) and their accumulat ion contribu2
t ing rate amounted to 821 844%1 The PCA result showed that the r elat ive peak area of loganin was the dis2
cr iminat ing factor of the fingerprint of Liuwei Dihuang Pills1 Conclusion This method can be used for
quality contr ol for Liuwei Dihuang Pills1
Key wor ds: Liuwei Dihuang Pills; fingerprint ; chemical pat tern recognit ion
#48# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 1 期 2010年 1月
¹ 收稿日期: 2009203210
基金项目:天津市科技发展计划项目( 05SYSYGX25000)
作者简介:赵洪芝( 1981 ) ) ,女,硕士,助理研究员,主要从事中药质量控制及化学计量学方面的研究。
Tel: ( 022) 27950255 Fax : ( 022) 27950378 E2mail: zhao hong zhi@1261 com
* 通讯作者 孟宪生 Tel: ( 010) 62772263 Fax: ( 010) 62781688 E2mail: mxsvvv@1261 com
六味地黄丸是中医补益剂中滋阴补肾的代表方
剂,用于肾阴亏损, 头晕耳鸣,腰膝酸软, 骨蒸潮热,
盗汗遗精, 消渴等症。其配方由熟地黄、山茱萸
(制)、牡丹皮、泽泻、山药、茯苓等 6 味药材组成。
5中国药典62005 年版一部六味地黄丸项下规定检
测丹皮酚和马钱苷的量作为质量控制标准。但是六
味地黄丸的成分十分复杂, 生产厂家众多, 为全面评
价其质量,需借助现代分析手段进行研究, 建立新的
评价方法。中药指纹图谱技术是一种表征中药所含
成分与其质量关系的有效手段, 现已成为国内外广
泛接受的中药质量评价模式[ 1~ 4]。本课题组前期采
用薄层扫描法评价了六味地黄丸(胶囊) [ 5]。本实验
建立了六味地黄丸的 HPLC指纹图谱,结合聚类分
析法和主成分分析法等模式识别方法, 为中药的质
量控制提供一种直观、简便、有效的手段。
1 仪器与试药
Water s al liance 2695高效液相色谱仪,其配置
有自动进样器、2996二极管阵列检测器、柱温箱。
乙腈 (色谱纯, 美国 Fisher ) , 超纯水 ( Milli2
pore) ;其他试剂为分析纯。丹皮酚对照品(中国药
品生物制品检定所, 批号为 1107082200505) ;马钱
苷对照品 (中国药品生物制品检定所, 批号为
1116402200803)。六味地黄丸 (胶囊)样品为市售
品,共收集了 15个生产厂家的 25个样本, 见表 1。
表 1 样品来源
Table 1 Sources of samples
编号 生产厂家 批号 剂型 编号
生产
厂家 批号 剂型
1 A 6032931 水蜜丸 14 E 109426 大蜜丸
2 A 7031337 水蜜丸 15 E 109429 大蜜丸
3 B B058220 水蜜丸 16 C 640005 大蜜丸
4 B B058207 水蜜丸 17 C 640006 大蜜丸
5 B B058227 水蜜丸 18 J 070101 浓缩丸
6 C 6420009 水蜜丸 19 K 20060918 浓缩丸
7 C 6420011 水蜜丸 20 K 20070539 浓缩丸
8 D 0506028 水蜜丸 21 K 20070611 浓缩丸
9 E 111409 水蜜丸 22 L 97060379 浓缩丸
10 F 0605707 水蜜丸 23 M 20070426 浓缩丸
11 G 051102 水蜜丸 24 N 060701 浓缩丸
12 H 060503 胶囊 25 O 061274 浓缩丸
13 I 070301 胶囊
2 方法与结果
21 1 色谱条件: Agilent Zorbax SB C1 8色谱柱( 250
mm@41 6 mm, 5 Lm) ;流动相:乙腈2超纯水, 线性
梯度洗脱程序: 0 ~ 8 min, 乙腈由 1% 线性增至
12%; 8~ 21 min,乙腈保持 12%, 21~ 40 min,乙腈
由 12%线性增至 90%; 40 min 后乙腈保持 90%至
50 min;体积流量: 11 0 mL/ min;检测波长: 236 nm;
进样量: 10 LL。
21 2 供试品溶液的制备:取本品水蜜丸切碎, 取约
1 g;大蜜丸取约 11 3 g;浓缩丸取约 01 3 g;胶囊取约
01 5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇 25
mL,密塞,称定质量, 超声提取 60 min, 放冷, 再称
定质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀, 滤过, 取续滤
液,即得。
21 3 对照品溶液的制备:精密称取马钱苷对照品、
丹皮酚对照品适量, 加甲醇分别制成含马钱苷 14
Lg/ mL、丹皮酚 18 Lg/ mL的溶液, 即得。
21 4 方法学考察
21 41 1 精密度试验:取同一供试品溶液在上述条件
下连续测定 6次,计算指纹峰的保留时间和峰面积
的 RSD 值, 相对保留时间 RSD 分别为 01 23%、
01 24%、01 57%、01 64%、01 013%、01 003%、01 25% ,
相对峰面 积 RSD 为 11 05%、01 82%、01 26%、
01 63%、11 63%、11 66%、01 23%,各色谱峰相对保留
时间稳定, 各主要色谱峰相对峰面积基本一致, RSD
小于 21 0%。
21 41 2 稳定性试验:取同一供试品溶液在上述条件
下,分别在 0、3、6、9、12、16 h测定其指纹图谱,各色
谱峰保 留时 间 RSD 分 别为 01 22%、01 58%、
01 66%、01 01%、01 41%、01 041%、01 28% , 各色谱
峰保留时间稳定, 各主要色谱峰, 相对峰面积 RSD
分别为 11 69%、01 92%、01 32%、01 49%、11 53%、
21 82%、11 02%, 均小于 21 0%, 表明样品溶液在
16 h内稳定。
21 41 3 重复性试验:平行取 6份供试品溶液, 进样
测定,计算指纹峰的保留时间和峰面积的 RSD值,
结果相对保留时间 RSD 分别为 01 069%、01 067%、
01 12%、01 108%、11 29%、01 027%、01 065%, 相对峰
面积的 RSD 分别 为 21 82%、11 10%、11 20%、
11 93%、21 31%、11 54%、21 42%,各主要色谱峰相对
峰面积 RSD小于 31 0%。
21 5 样品测定:取不同厂家的 25批样品,分别制备
供试品溶液,进样测定,确定 8个主要色谱峰为共有
峰。马钱苷、丹皮酚对照品色谱图见图 1, 2号样品
的 HPLC指纹图谱见图 2,用5中药色谱的指纹图谱
评价系统6软件( 2004A)进行色谱峰的匹配, 25批样
品的叠加谱图见图 3。
3 模式识别研究
31 1 聚类分析法:以 25个不同厂家和批次的六味
地黄丸(胶囊)为研究对象,进行指纹图谱研究,获得
包括丹皮酚( 7 号峰)在内的 8个色谱峰, 将 7 号峰
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设为参比峰, 规定其相对保留时间和相对峰面积为
1, 其他各峰面积均按相对峰面积折算, 将各色谱峰
相对于内参比色谱峰的峰面积量化,得到 25 @8阶
原始数据矩阵, 运用 SPSS 统计分析软件对其进行
聚类分析(H ierarchical clustering analysis) ,利用欧
氏距离( Euclidean)作为样品的测度, 采用离差平方
和法( Wards Method)进行聚类, 将 25个样品分为
3类, 见图 4。
可以看出, 25个样品总共可以分为 3类,其中,
16、17、7、2、15、10、14、1、6、9、24为第 1类; 4、20、
3、5、25、19、21、23、22为第 2类; 12、13、18、8、11为
第 3类。C 厂家的样品( 4、7、16、17)和 E 厂家 ( 9、
14、15)无论水蜜丸和大蜜丸均为在第一类中,说明
C和 E 厂家的样品质量相近, 而水蜜丸和大蜜丸质
量相差并不大。而所取的 B厂家样品( 2、3、5号)比
较紧凑,证明这几个批号六味地黄丸质量比较稳定。
图 4 六味地黄丸(胶囊)样品的聚类谱系图
Fig1 4 Hierar chical cluster ana lysis figur e
of Liuwei DiHuang Pills (Capsula)
12、13号为胶囊制剂, 在聚类谱图中距离非常相近,
说明胶囊与其他剂型相差较大。浓缩丸除 N 厂家
( 24号)和 J厂家( 18 号)以外, 均在第 2类中, 说明
浓缩丸和水蜜丸之间质量有一定差异。
31 2 主成分分析:主成分分析是将原来众多具有一
定相关性的指标重新组合成一组新的相互无关的综
合指标来代替原来指标的统计方法,也是数学上处
理降维的一种方法[ 6]。主成分分析有许多同义词,
如特征值分解( eigen vector decomposit ion)、奇异值
分解( singular value decomposit ion)、抽象因子分析
( abst ract factor analysis)、主因子分析 ( principal
factor analysis)、特征矢量投影( eigen vector projec2
t ion)、K2L project ion等。本实验应用 SPSS 统计分
析软件对此 25个样本进行了主成分分析,即将它们
投影至低维空间来看它们之间的微细差别, 先将
25@8的原始数据矩阵经标准化处理,再对其进行运
算,主成分个数提取原则为主成分对应的特征值大
于 1的前 m个主成分。主成分分析结果如下:第一
主成分的特征值 K1 = 31 535, 方差贡献 率为
501 505% ;第二主成分的特征值:K2= 11 260,方差贡
献率为 181 003;第三主成分的特征值 K3= 11 004, 方
差贡献率为 141 336%。3个主成分的累计方差贡献
率为 821 844% ,故选取前 3个得分矢量来作图, 3
个主成分的得分图见图 5。图中每个点对应 1个样
本。可知,此 25个样本可分为 3 类, 与聚类分析结
果一致,即可验证聚类结果图,聚类结果合理。
初始因子载荷矩阵中, 每一个载荷量表示主成
分与对应变量的相关系数见表 2。将主成分载荷矩
阵中的数据除以主成分相对应的特征值开平方根便
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图 5 主成分得分图
F ig1 5 Pr incipal component ana lysis scor e
表 2 初始因子载荷矩阵
Table 2 Matr ix of initial factors
峰位 主成分
1 2 3
1 01512 01 432 - 01 608
2 01886 - 01 265 01 270
3 01928 - 01 039 7 01 014 4
4 01772 01 439 - 01 125
5 01706 - 01 610 01 134
6 01729 01 233 01 126
8 - 01044 4 01 618 01 715
得到两个主成分中每个指标所对应的系数,经计算
可得主成分的模型为: F 1= 01 272 X 1+ 01 471 X2 +
01 494 X3 + 01 411 X4 + 01 376 X5 + 01 388 X6 -
01 024 X8 ; F 2= 01 385 X1- 01 236 X 2- 01 035 X3 +
01 391 X4- 01 543 X5+ 01 207 X 6+ 01 551 X 8 ; F 3 =
- 01 607X1 + 01 269 X2 + 01 014 X 3 - 01 125 X 4 +
01 134 X5+ 01 126 X6 + 01 714 X8。F 1、F 2、F 3 分别
表示 3个主成分, X1、X2 , , X8 分别表示各个色谱
峰(峰 1、2、, , 8)的相对于标准峰(峰 7)的相对峰
面积。而 3 个主成分中, F 1 是特征值最大的,即是
/信息最多0的指标, 而第一主成分中系数最大的为
X3 ,即为峰 3相对于峰 7的面积, 从对照品色谱图
(图 2)可知, 峰 3 为马钱苷, 峰 7 为丹皮酚,证明马
钱苷的量在六味地黄丸的质量控制中起相对比较重
要的作用。
4 讨论
中成药系复方制剂,其化学成分甚为复杂, 其作
用往往是多种成分协同作用的结果,而不仅仅是其
中某几个有效成分的个别功效。本实验对收集到的
25个六味地黄丸样品进行了 HPLC指纹图谱研究,
并使用聚类分析及主成分分析化学模式识别的方
法,对其数据进行了分析,两种方法分类结果可以互
相印证,表明方法合理,说明将指纹图谱和模式识别
结合进行质量控制是一种行之有效的方法。且使用
主成分分析表明,马钱苷在六味地黄丸质量中起相
对重要的作用, 5中国药典62005 年版一部的马钱
苷、丹皮酚为质量控制指标,有效地控制了六味地黄
丸的药品质量。
在供试品溶液制备条件的选择中比较了回流提
取和超声提取、提取溶剂( 50%甲醇、甲醇、含 1%甲
酸的甲醇、乙醇、甲醇2乙醚)、提取时间( 15、30、45、
60、90min)、样品用量( 01 1、01 2、01 5、11 0、21 0 g)对
六味地黄丸的提取效果。结果表明,在指定的色谱
分析条件下,本实验中采用的供试品溶液制备方法
提取效果最好, 能够最大限度地反映其特征。
在色谱条件优化中, 经过多次尝试最终确定了
乙腈2水的流动相体系, 在优化的色谱条件下, 样品
能够得到较好的分离。为了使尽量多的化合物被检
测, 采用Waters公司2996检测器及 Empower 工作
站的特殊功能 MAX PLOT (最大值图) , 提取各色
谱成分最大吸收的色谱图与不同波长的色谱图进行
比较,当选择 236 nm为检测波长时,色谱成分检出
率最多,满足了最大信息量化的原则, 所以选择 236
nm为检测波长。
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