全 文 ：3 讨论
RAPD反应条件严格, 由实验结果可知,引物、
dNT P、模板 DNA、Taq DNA 聚合酶、Mg2+ 等因素
的变化都会对 RA PD图谱产生一定的影响,从而影
响 RAPD分析的准确性。
RAPD标记进行遗传多样性分析的前提条件就
是首先要保证 RAPD 带谱的准确性和稳定性。为
获得重复性和稳定性较高的 RAPD 带谱,在进行某
一物种的 RAPD分析前,筛选最适宜的RAPD条件
是很必要的[ 14]。虽然 RAPD反应涉及到诸多因素,
但通过严格控制反应条件, 尽量保证所有反应在同
一反应体系下完成, 如使用同一厂家相同批号的
Taq DNA 聚合酶,采用相同的扩增程序, 就能获得
重复性好、稳定性高的结果[ 15]。
通过扩增条件优化实验, 建立了药用植物菝葜
RAPDPCR扩增体系最适宜的条件, 即反应体积
30 L,内含 0 20 mo l/ L 引物、200 mo l/ L dNT P、
40 ng 模板 DNA、2 U T aq DNA 聚合酶、2 mol/ L
Mg 2+ ;而且筛选出条带清晰多态性好的 14 条随机
引物,共扩增得到 144 条电泳带, 其中有多态性带
62条, 检测到了 62个多态性位点, 多态率为 43%。
为进一步进行菝葜种质资源的 RA PD分析及其亲
缘关系、遗传多样性研究提供了可靠的实验方法。
参考文献:
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基于淫羊藿苷测定及HPLC指纹图谱分析的淫羊藿药材质量差异评价
张 萍1 ,孔维军1, 2 ,鄢 丹1 , 王晶彬1 , 任永申1, 2 ,赵艳玲1 ,肖小河1 * , 周 旭1
( 1 解放军 302医院全军中药研究所 北京 100039; 2 成都中医药大学药学院, 四川 成都 611137)
摘 要:目的 建立客观评价淫羊藿药材质量差异的方法。方法 采用高效液相色谱法, Kromasil C18柱( 250 mm
4 6 mm, 5m) ,流动相为乙腈水( 23! 77) , 体积流量 1 mL/ min,检测波长 270 nm,进样量10L ,建立不同产地、不
同品种淫羊藿药材不同生长部位(茎与叶)的 H PLC 指纹图谱,并测定其不同生长部位中淫羊藿苷的量。结果 淫
羊藿药材不同生长部位(茎与叶)的 H PLC 指纹图谱和淫羊藿苷的量存在差异, 从其叶和茎的特征指纹图谱中分别
提取出 19 和 10个共有峰,且叶中淫羊藿苷的量是茎中的 4~ 8 倍;叶与叶、茎与茎之间的化学特征存在差异,叶与
茎化学特征差异最显著。结论 建立的淫羊藿苷测定方法和指纹图谱的精密度、稳定性、重现性好, 可表征淫羊藿
药材质量的差异性,为淫羊藿药材的质量研究和建立淫羊藿药材的商品规格提供参考依据。
关键词:淫羊藿; 淫羊藿苷;成分; 指纹图谱;质量评价
中图分类号: R282 7 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 11190104
淫羊藿是多年生的草本植物,包括小檗科植物 箭叶 淫 羊 藿 Ep imed ium sag it tatum ( Sieb et
∀1901∀中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
收稿日期: 20100221 基金项目:军队中医药研发推广重点项目( 200623001) ;国家杰出青年科学基金项目( 30625042 ) ;国家重大新药创制关键技术 ( 2009zx09502
022)作者简介:张 萍( 1978 # ) ,女,山东菏泽人,硕士,中药学专业。T el : ( 010) 66933325 Email: zh p1231@ 126 com
* 通讯作者 肖小河 T el: ( 010) 66933322 Email: pharmacy302@ 126 com
Zucc ) Max im、朝鲜淫羊藿 Ep imedium kor eanum
Nakai等多个品种, 主要用于阳痿遗精、筋骨痿软、
风湿痹痛和更年期高血压等证, 具有广泛的药理作
用和药用价值 [ 12]。黄酮类是淫羊藿的主要有效成
分,包括淫羊藿苷、淫羊藿次苷 ∃、%等[ 34]。&中国
药典∋( 2005年版) [ 5]规定淫羊藿叶片中淫羊藿苷量
的下限作为淫羊藿药材的质控方法,且未区分其茎
叶部位。临床使用及工业生产时,常以淫羊藿药材
的地上部分。作为其药用部位,包括茎、叶两部分。
而其叶片部位与茎部位在指纹图谱、主要组分、药效
作用等方面有无差异性, 以及能否代替淫羊藿药材
而进行相关的实验研究并体现相应的药效作用有待
研究,且叶中淫羊藿苷的量也难以代表药材整体质
量。所以,本研究建立了淫羊藿药材不同生长部位
(茎与叶)的 HPLC指纹图谱, 并测定其中淫羊藿苷
的量,以评价其化学特征及有效成分的差异性,为淫
羊藿药材品质评价和质量控制提供依据。
1 仪器与试药
Agilent 1100高效液相色谱仪(惠普 HP # 1110
四元泵; HP # 1110DAD检测器 H P Chemstat ion化
学工作站) ; 电子天平 (梅特勒托利多仪器有限公
司)。KQ3200超声波清洗器(超声功率 120 W, 工
作频率 40 kHz,昆山市超声仪器有限公司) ;淫羊藿
苷对照品(质量分数> 98% ) , 购于中国药品生物制
品检定所,批号 110737200613。乙腈为色谱纯, 醋
酸、乙醇及其他试剂均为分析醇。
3批淫羊藿药材, 经解放军 302医院全军中药
研究所肖小河研究员鉴定,分别为箭叶淫羊藿 Ep i
medium sagit tatum ( Sieb et Zucc ) M ax im ( 湖
南,批号 20080910)、朝鲜淫羊藿 Ep imed ium kor ea
num Nakai ( 吉林, 批号 20080804; 辽宁, 批 号
20081018, 20080918)。
2 方法与结果
2 1 样品溶液的制备:将 3批药材的茎、叶分开并
分别编号,湖北产编为 H 茎、H 叶, 吉林产编号为 J
茎、J 叶, 东北产编为 D茎、D叶。将各药材干燥至
恒定质量,粉碎并过 3号筛,取相同量的样品粉末各
约 0 2 g, 精密称定, 置 50 mL 具塞锥形瓶中, 加入
稀乙醇 20 mL,密塞, 称定质量, 超声处理 1 h 后放
冷, 再称定质量, 用稀乙醇补足减失的质量, 摇匀,
0 45 m 微孔滤膜滤过,即得样品溶液。
2 2 对照品溶液的制备: 精密称取淫羊藿苷对照
品,加甲醇溶解,制成 0 088 mg/ mL 的溶液即得。
2 3 淫羊藿苷的测定
2 3 1 色谱条件: Kromasil C18柱 ( 250 mm 4 6
mm, 5 m) , 流动相为乙腈水 ( 23 ! 77) , 体积流量
为 1 mL/ min, 检测波长为 270 nm, 柱温为室温, 进
样量为 10 L。理论塔板数按淫羊藿苷计算不低于
1 500。
2 3 2 线性关系考察: 精密吸取对照品溶液 2、4、
6、8、10、20 L,注入液相色谱仪,记录色谱图。以峰
面积为纵坐标( Y) ,淫羊藿苷的质量为横坐标( X ) ,
绘制标准曲线。回归方程为 Y = 2 124 5 X +
10 517, r= 0 999 8。结果表明淫羊藿苷在 0 176~
1 76 g 呈良好的线性关系。
2 3 3 精密度试验:取 H 叶供试品溶液,按上述色
谱条件等量重复进样 5次, 记录淫羊藿苷峰面积;结
果显示淫羊藿苷的 RSD 为 0 34% , 表明该方法精
密度良好。
2 3 4 稳定性试验:取 H 叶供试品溶液,分别于配
制后 0、4、8、12、16、24 h 进样, 记录淫羊藿苷峰面
积;结果显示淫羊藿苷的 RSD为 0 62% ,表明样品
溶液在 24 h内稳定。
2 3 5 重现性试验: 称取 5 份适量 H 叶样品, 按
( 2 1)项下方法平行制备 5 份供试品溶液, 分别进
样,记录淫羊藿苷峰面积, 计算质量分数, 结果显示
淫羊藿苷的 RSD 为 0 78% , 表明重现性试验符合
要求。
2 3 6 回收率试验: 按( 2 1)项下方法平行制备 5
份 H 叶供试品溶液,分别精密加入淫羊藿苷对照品
0 1 mg, 按上述色谱条件分别进样, 记录淫羊藿苷
峰面积;结果显示淫羊藿苷平均回收率为 101 5%,
RSD为 0 47%。
2 3 7 定量测定:精密吸取对照品溶液与供试品溶
液各 10 L, 注入液相色谱仪, 按上述色谱条件进行
分析,重复测定 3次记录色谱图,按外标法以峰面积
计算各样品中淫羊藿苷的量, 结果 H 茎、H 叶、J
茎、J叶、D 茎、D 叶中淫羊藿苷的质量分数分别为
0 045 8%、 0 302 3%、 0 043 5%、 0 311 1%、
0 058 0%、0 283 7%。
可见不同产地、不同品种淫羊藿药材的不同生
长部位(叶与叶、茎与茎)中淫羊藿苷量存在差异,叶
中淫羊藿苷的量高,茎中较低。同一品种及产地的
淫羊藿药材叶与茎中淫羊藿苷的量亦存在较大差
异,叶中淫羊藿苷的量是茎中的 4~ 8倍。表明不同
产地、不同品种淫羊藿药材及其不同生长部位在主
要化学组分的量上存在较大差异。
2 4 淫羊藿药材不同生长部位指纹图谱的建立
∀1902∀ 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
2 4 1 色谱条件: 同( 2 3 1)项下, 流动相为乙腈
( A)1%醋酸水溶液( B) ,且为梯度洗脱。梯度系统
程序为: 0 min, 15%A; 20 min, 22% A; 40 min, 22%
A; 60 min, 32% A; 85 m in, 55%A。
2 4 2 精密度试验:取 H 叶供试品溶液, 等量重复
进样 5次,按上述色谱条件进行梯度洗脱,以淫羊藿
苷的出峰时间和峰面积为参照, 计算其他共有峰的
相对保留时间和相对峰面积。结果显示, 5 批指纹
图谱共有峰的相对保留时间和相对峰面积的 RSD
为 0 5% ~ 1 7% ,表明精密度试验符合要求。
2 4 3 稳定性试验:取 H 叶供试品溶液, 分别于配
制后 0、4、8、12、16、24 h进样,按上述色谱条件进行
梯度洗脱,以淫羊藿苷的出峰时间和峰面积为参照,
计算其他共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结
果显示, 5 批指纹图谱共有峰的相对保留时间和相
对峰面积的 RSD 为 0 7% ~ 2 1% , 表明稳定性试
验符合要求。
2 4 4 重现性试验:称取 5份适量湖北产淫羊藿药
材,按( 2 1)项下方法制备供试品溶液, 分别进样, 按
上述色谱条件进行梯度洗脱, 以淫羊藿苷的出峰时
间和峰面积为参照,计算其他共有峰的相对保留时
间和相对峰面积。结果显示, 5批指纹图谱共有峰
的相对保留时间和相对峰面积的 RSD 为 0 6% ~
2 6% ,表明重现性试验符合要求。
2 4 5 同一产地淫羊藿不同生长部位的指纹图谱:
精密吸取对照品溶液及同一产地淫羊藿药材叶片与
茎部位的供试品溶液各 10 L,注入液相色谱仪, 按
上述色谱条件进行梯度洗脱并记录色谱图,见图 1。
S淫羊藿苷
Sicariin
图 1 淫羊藿药材的叶( A)、茎( B)的 HPLC指纹图谱
Fig 1 HPLCFingerprints of Ep imedii Herba
leaves ( A) and stems ( B)
在此色谱条件下, 淫羊藿药材不同生长部位的
指纹图谱中色谱峰均达到基线分离,从叶的指纹图
谱中共提取出 19个共有峰,而从茎的指纹图谱中共
提取出 10个共有峰, 茎的指纹峰少于叶指纹峰, 且
皆可与叶指纹峰重叠。表明同一产地淫羊藿药材不
同生长部位的化学指纹图谱存在差异性。
2 4 6 不同产地淫羊藿药材叶片部位的指纹图谱:
精密吸取不同产地淫羊藿药材叶片部位的供试品溶
液各 10 L, 注入液相色谱仪, 按上述色谱条件进行
梯度洗脱并记录色谱图,见图 2。
图 2 3批淫羊藿药材叶片部位的指纹图谱
Fig 2 Fingerprints of leaves in three batches
of Epimedii Herba
不同产地、不同品种淫羊藿药材叶片部位指纹
图谱中共有峰基本相同,表明其化学成分相似, 但各
共有峰的相对峰面积存在差异。从图中可以看出, J
叶中 1、2、4、5、6、7、8、10、18 号峰的相对峰面积最
大; H 叶中 3、9、12、13、16号峰的相对峰面积最大;
D叶中 11、15、14、17 号峰的相对峰面积最大; 且 J
叶中淫羊藿苷相对峰面积最大。表明不同产地淫羊
藿药材叶片部位的化学指纹图谱存在差异性。
2 4 7 不同产地淫羊藿药材茎部位的指纹图谱:精
密吸取不同产地淫羊藿药材茎部位的供试品溶液各
10 L,注入液相色谱仪, 按上述色谱条件进行梯度
洗脱并记录色谱图,见图 3。
图 3 3 批淫羊藿药材茎部位的指纹图谱
Fig 3 Fingerprints of stems in three batches
of Epimedii Herba
不同产地、不同品种淫羊藿药材茎部位指纹图
谱中共有峰基本相同, 表明其化学成分相似,但各共
有峰的相对峰面积存在差异。J 茎中 3号峰的相对
峰面积最大; H 茎中 2、4、5、6、18号峰的相对峰面
积最大; D茎中 1、10、15号峰的相对峰面积最大;且
D茎中淫羊藿苷的相对峰面积最高。
3 讨论
由不同产地、品种淫羊藿药材的相同生长部位
∀1903∀中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
(叶与叶、茎与茎)及同一产地、同一品种淫羊藿药材
的不同生长部位(茎与叶)的淫羊藿苷量及指纹图谱
的比较分析可知: 淫羊藿药材的不同生长部位(茎
与叶)中淫羊藿苷的量存在较大差异,叶片中淫羊藿
苷的量较高,茎中偏低,因此应综合淫羊藿药材叶与
茎部位中淫羊藿苷的量及叶与茎的比例来评价不同
产地、不同品种的淫羊藿药材的质量。 ∗ 不同淫羊
藿药材的茎与叶的比例存在较大差异, 建议建立基
于茎与叶不同比例要求及药材品种来源的新的淫羊
藿药材商品规格划分标准。 + 由指纹图谱比较可
知,叶片中淫羊藿苷的量较高,其余色谱峰代表的化
学成分的量不一定高,当评价不同产地、不同品种淫
羊藿药材化学品质时, 应同时比较叶与茎的化学质
量差异,综合各有效指标,进行整体评价。
基于本研究结果,建议应该建立基于综合茎与
叶比例、茎与叶中淫羊藿苷的量等因素的淫羊藿药
材商品规格划分标准, 以建立基于叶与茎中淫羊藿
苷测定及指纹图谱的( 一测多评)的不同产地、不同
品种的淫羊藿药材的化学区分模式及质控方法, 以
期为淫羊藿药材的大质量观研究奠定基础 [ 6]。
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白芍和赤芍 HPLC指纹图谱比较研究
高 明1 ,赵 镭2 ,赵光树1 *
( 1 浙江大学医学院附属第一医院, 浙江 杭州 310003; 2 浙江大学医学院附属儿童医院,浙江 杭州 310003)
摘 要:目的 通过建立白芍和赤芍药材的 HPLC指纹图谱,进一步完善芍药野生品与栽培品药材的质量评价方
法。方法 采用 H PLC 测定了 11 批白芍和和 11 批赤芍样品,并建立标准对照指纹图谱, 按国家药典委员会提供
的中药色谱指纹图谱相似度评价系统对样品的相似度进行评价。色谱条件:固定相为 Kromasil 1005C18 ( 250 mm
4 6 mm, 5 m) ; 流动相为乙腈0 3%H 3PO 4 梯度洗脱;检测波长为 220 nm,参比波长为 290 nm; 柱温 35 , ; 体
积流量 0 8 mL / min。结果 建立的 HPLC 指纹图谱能区别白芍和赤芍。结论 本法简单、快捷, 为科学评价和控
制芍药野生品与栽培品药材的质量提供了依据, 为同来源于芍药的赤芍和白芍的临床应用提供依据。
关键词:赤芍; 白芍;指纹图谱; RPH PLC
中图分类号: R282 7 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 11190403
白芍为毛茛科植物芍药 Paeonia lacti f lor a
Pall 的干燥根; 赤芍为毛茛科植物芍药 P lacti
f lor a Pall 或川赤芍 P vei tchi i Lynch 的干燥
根[ 1]。一般认为,芍药野生品的根直接干燥就是赤
芍,而栽培品的根去皮水煮后即为白芍。白芍总
苷[ 2]、赤芍总苷 [ 34] 均含有芍药苷( paeoniflo rin)、芍
药内酯苷 ( albif lorin)、羟基芍药苷( ox ypaeonif lor
in)、苯甲酰芍药苷( benzoylpaeoniflo rin)等单萜类
化合物。本实验以白芍总苷胶囊(商品名: 帕夫林,
TGPC)为外参照, 建立白芍、赤芍的标准对照指纹
图谱以考察白、赤芍药材之间的成分差异,为完善赤
芍、白芍质量控制提供科学依据。
1 仪器与试药
1 1 仪器: Agilent1200 高效液相色谱系统:
G1322A脱气机, G1311A 四元泵, G1329A 自动进
样仪, G1316A 柱温箱, G1315D DAD 检测器, 安捷
伦 Chemstat ion色谱工作站; KQ300DB型数控超声
波清洗器(江苏昆山超声仪器公司) ; H2050R 高速
冷冻离心机 (长沙湘仪离心机有限公司) ; M ET
TLER AE163分析天平( Met t ler Toledo 仪器有限
公司)。中药色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药
典委员会)。
∀1904∀ 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
收稿日期: 20100226 作者简介:高 明,男,硕士,研究方向为中药成分分析。Tel: ( 0571) 87236540 Email: 48871550@ QQ com
* 通讯作者 赵光树 T el: ( 0571) 87236539 Email: fi shlczl@ yahoo com cn