全 文 ：理后 K562 细胞中 H2ras 的表达增加。
目前许多应用于临床的抗癌药物 ,如 V P16、顺
铂、阿霉素及紫杉醇等都是通过抑制肿瘤细胞的增
殖 ,引发细胞凋亡的作用来实现抗癌功效的。与之
相比 ,川楝素提取物不仅具有抑制肿瘤细胞增殖 ,引
发凋亡的作用 ,而且其 IC50更低 ,表明川楝素提取物
具有更强的抑制肿瘤细胞增殖及促进细胞凋亡的能
力。研究还发现 ,高浓度川楝素提取物对外周血单个
核细胞的生长无抑制作用 ,表明川楝素提取物对人体
正常细胞安全无毒。因此川楝素提取物可能是一种
潜在的、具有应用前景的、安全无毒的抗癌药物。
参考文献 :
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血水草生物碱致钉螺肝脏蛋白质差异表达分析
彭 　玲1 ,黄琼瑶1 ,刘建军2 ,彭 　飞1 ,孙 　慧1 ,袁仕善1 3 ①
(11 湖南师范大学医学院 ,湖南 长沙 　410006 ; 21 深圳市疾病预防控制中心 ,广东 深圳 　518020)
摘 　要 :目的 　分析血水草生物碱 ( ECA) 致钉螺肝脏蛋白质表达的变化。方法 　10 mg/ L ECA 浸泡钉螺 36 h
后 ,解剖活钉螺并收集肝脏 ,双向电泳分离 ECA 组和清水对照组钉螺肝脏蛋白质 , ImageMaster 2D 5. 0 软件分析
图谱 ,筛选差异蛋白质 ,并用 MALDI2TOF2TOF 质谱进行鉴定。结果 　ECA 组和清水对照组分别检出 (354 ±
110) 、(311 ±12) 个蛋白点 ;质谱鉴定获得假定蛋白、ENSAN GP00000022175 蛋白、醛脱氢酶、未知蛋白、ENSAN2
GP00000027067 蛋白、类似锚蛋白 3 的 1 亚型 4 亚亚型蛋白、相似 A 型肝炎病毒短型细胞受体 1 的蛋白、线粒体异
柠檬酸脱氢酶 2 样蛋白、类似角蛋白的蛋白、角蛋白 10、角蛋白 1 共 11 个蛋白质 ,这些蛋白质均为 ECA 处理后表
达上调的蛋白质。结论 　ECA 可引起钉螺肝脏蛋白质表达发生改变。
关键词 :血水草 ; 生物碱 ; 钉螺 ; 肝脏 ; 蛋白质组学
中图分类号 :R28515 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2010) 0320431205
Proteome analysis on differential expression of l iver proteins from Oncomla nia hupensis
induced by Eomecon chiona nt he alkaloids
PEN G Ling1 , HUAN G Qiong2yao1 , L IU Jian2jun2 , PEN G Fei1 , SUN Hui1 , YUAN Shi2shan1
(11 Medical College of Hunan Normal University , Changsha 410006 , China ; 2. Shenzhen Center
for Disease Control and Prevention , Shenzhen 518020 , China)
Abstract : Objective 　To analyze t he influence of Eomecon chionant he alkaloids ( ECA) on differential
expression of liver p roteins f rom Oncoml ani a hu pensis . Methods 　O. hu pensis was immersed in 10 mg/ L
ECA or clean water for 36 h and livers were isolated f rom live snails. Total liver p roteins were ext racted
and separated by two2dimensional gel elect rop horesis , differentially expressed proteins between ECA group
and clean water group were selected and analyzed by mat rix2assisted laser desorption/ ionization time2of2
flight mass spect romet ry ( MALDI2TOF2MS) and tandem mass spect romet ry sequencing of t ryptic pep2
tides. Results 　There were (354 ±110) and (311 ±12) spot s observed in ECA group and in water group ,
respectively. Eleven differential expressed proteins were identified and all were up2regulated in ECA
group . The eleven identified proteins were hypot hetical p rotein , ENSAN GP00000022175 , class I aldehyde
dehydrogenase , unknown protein , ENSAN GP00000027067 , p rotein similar to ankyrin 3 isoform 1 isoform
·134·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
①收稿日期 :2009207204　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30771872) ; 湖南省科技厅项目 (2006SK1001)
作者简介 :彭　玲 (1983 —) ,女 ,湖南岳阳人 ,病原生物学专业硕士生 ,研究方向为血吸虫病防治。Tel : (0731) 88912429
E2mail : Pengling39 @163. com3 通讯作者　袁仕善　Tel : (0731) 88912458 　E2mail : yuanshishan @yahoo. com. cn
4 , p rotein similar to hepatitis A virus cellular receptor 1 short form , mitochondrial isocit rate dehydrogen2
ase 22like , p rotein similar to keratin , keratin210 , and keratin21 , respectively. Conclusion 　Expression of
liver p roteins f rom O. hu pensis could be changed when immerse in ECA.
Key words : Eomecon chionant he Hance ; alkaloids ; Oncom l ani a hu pensis ; liver ; p roteomics
　　血水草 Eomecon chionant he Hance ,别名水黄
连 ,系罂粟科血水草属多年生草本植物。其植物资
源丰富 ,分布在我国长江流域、华东、华南、西南大部
分省区 ,西北秦岭也有分布 ,是我国独属独种的植
物。《中药志》记载其味苦 ,性寒 ,有小毒 ,具有清热
解毒之功效。民间用于治疗急性结肠炎、眼结膜炎、
疮痛疔毒以及毒蛇咬伤等症[ 1 ] 。生物碱类化合物是
血水草的主要有效成分。研究表明 ,从血水草中提
取的生物碱 ( Eomecon chionant he alkaloid , ECA)
具有杀灭钉螺及螺卵、抑制钉螺上爬的作用 ,能杀灭
日本血吸虫尾蚴、防护小鼠感染[2 ,3 ] 。研究发现
ECA 浸泡钉螺导致钉螺肝细胞严重损伤[ 4 ] 。另有
研究表明 ECA 对钉螺肝脏丙氨酸氨基转移酶
(AL T) 、天冬氨酸氨基转移酶 (AST) 活性的影响
明显 ,对 AL T 尤其显著[5 ] 。为深入探讨 ECA 对钉
螺肝脏的损伤机制 ,本实验用 ECA 浸泡钉螺后 ,收
集活体螺肝脏 ,进行双向电泳和质谱鉴定 ,分析
ECA 处理后钉螺肝脏蛋白质表达的变化 ,为 ECA
的临床应用提供依据。
1 　材料与方法
111 　仪器与试剂 : IP Gp hor Ⅲ等电聚焦仪、SE600
垂直电泳仪、高精度扫描仪、ImageMaster 2D 5. 0
凝胶分析软件系美国 Amersham 公司产品 ;
VCX400 型细胞破碎机为美国 SON ICS 公司产品 ;
Powerwavex 型酶标仪为美国 BIO2TE K 公司产品 ;
GS —15R 型台式冷冻离心机为美国 Beckman 公司
产品 ;4700 型串联飞行时间质谱仪系美国 Applied
Biosystems 产品。丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、
SDS、TEM ED ,尿素、硫脲、CHA PS、Tris、二硫苏糖
醇 (D T T) 、碘乙酰胺 ( IAA) ,87 % 甘油、Agrose、甘
氨酸、IP G buffer (p H 4～7) 、IP G 干胶条 (p H 4～
7 , 13 cm) 、覆盖油、混合型蛋白酶抑制剂、核酸酶、
样品研磨试剂盒 ( Grinding Sample kit ) 、22D 定量
试剂盒 (22D Quant kit ) 购自美国 Amersham 公
司。丙酮购自美国 Sigma 公司。其他试剂系国产
分析纯。
112 　血水草生物碱 ( ECA) 的提取 :血水草采自湖
南省桃江县人形山 ,由湖南中医学院周天达教授鉴
定为 Eomecon chionant ha Hance。取完全干燥的血
水草根茎粉末 ,按照杨华中等[6 ]的方法 ,提取 ECA。
113 　钉螺肝脏蛋白质的制备 :湖北钉螺 Oncomel a2
ni a hu pensis Gredler 采自湖南省洞庭湖君山区水
域 ,由湖南省血吸虫病防治研究所提供 ,置实验室饲
养 1～2 d。选取活成螺 ,配制 10 mg/ L ECA 药
液[3 ] ,25 ℃浸泡钉螺 36 h ,以清水浸泡钉螺为对照
组 ,水养法检测钉螺存活情况。解剖活钉螺 ,分离肝
脏 , - 80 ℃冻存。准确称取 80 mg 肝脏置于样本
研磨试剂盒提供的 EP 管内 ,加入 200μL 裂解液
(7 mol/ L Urea , 2 mol/ L Thiourea , 4 % CHA PS ,
65 mmol/ L D T T , 40 mmol/ L t ris) 、10μL 蛋白酶
抑制剂、5μL 核酸酶 ,用一次性研磨杵 ,冰浴匀浆
15 min ,再加入 300 μL 裂解液 ,冰上自由裂解 5
min。冰浴超声 15 次 ,超声 5 s ,间隔 5 s ,功率 40
W。4 ℃、20 000 ×g 离心 1 h ,收集上清液 ;重复离
心两次 ,小心避开上层脂肪 ,取上清液 ,加入 3 倍体
积预冷丙酮 , - 20 ℃沉淀 8 h。离心 ,弃上清 ,裂解
液重悬沉淀。分装后 - 80 ℃保存备用。
114 　双向电泳 :22D Quant kit 定量钉螺肝脏总蛋
白。取 90μg 样品 ,加样本水化液 (7 mol/ L Urea ,
2 mol/ L thiourea , 2 % CHA PS) 至终体积 250μL ,
转入 13 cm 持胶槽中 ,覆以 p H 4～7 13 cm IP G 干
胶条后加 400μL 覆盖油 ,进行等点聚焦 ( IEF) 。时
间程序 :30 V、12 h ,500 V、1 h ,1 000 V、1 h , 8 000
V、0. 5 h , 8 000 V、6 h。等电聚焦后取下胶条 ,去
离子水冲洗 ,依次在 1 % D T T 平衡液和 215 % IAA
平衡液中平衡 (6 mol/ L urea , 75 mmol/ L Tris2
HCl , 29. 3 % Glycerol , 2 % SDS , 0. 002 % 溴酚
蓝) ,SDS 电泳缓冲液润洗 ,吸去多余液体。配制
1215 % 第二向聚丙烯酰胺凝胶 ,将平衡后的胶条放
置于已聚合的凝胶胶面上 ,015 % 的琼脂糖封闭 ,进
行第二向凝胶电泳。电泳至溴酚蓝离胶底约 015
cm 时停止电泳。剥下凝胶 ,EMBL 银染。
115 　双向电泳的图像采集与分析 :用高精度扫描仪
采集图像 ,以 ImageMaster 2D 5. 0 软件对数字化图
像进行分析 ,对蛋白质点进行检测 (包括量化、背景
扣除、量的归一化及点的匹配) , Ratio 值大于 210
认为存在差异。
116 　MALDI2TOF2TOF 质谱分析及数据库检索 :
·234· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
切取差异蛋白点 ,去离子水清洗 ,50 mmol 碳酸氢
铵 + 50 % 乙腈脱色 ,纯乙腈干胶 ,加测序级胰酶于
4 ℃冰箱中约 30 min 后 37 ℃酶解过夜 ,011 % 三
氟乙酸 + 50 % 乙腈提取肽段 , N2 吹干 ,点样 ,取 5
g/ L 基质溶液 018 μL (溶于 011 % 三氟乙酸 +
50 % 乙腈) 覆盖样品 ,空气中自然干燥后分别进行
肽指纹图谱 MALDI2TOF2TOF 分析 , 激光源为
355 nm 波长的 Nd : YA G 激光器 ,加速电压为 20
kV ,采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数
据。PMF 质量扫描范围为 700～3 500 ,且强度最大
的 5 个峰进行串级质谱分析 ;谱图用 myoglobin 酶
解肽段进行外标校正。所得结果用 GPS ( Applied
Biosystems , 美国)2MASCO T ( Matrix Science , 英
国) 进行数据库检索。搜索参数设置 :数据库为
NCBInr ;数据检索的方式为 combined ( MS + MS/
SM) ;最大允许漏切位点为 1 ;酶为胰蛋白酶。质量
误差范围设置 : PMF 110 ×10 - 4 ,MS2MS 016 ;在数
据库检索时胰酶自降解峰和污染物质的峰均手工
剔除。
2 　结果
211 　ECA 组与对照组 22DE 凝胶图谱的差异分
析 :在相同条件下对 ECA 组与清水对照组的肝脏
总蛋白进行双向电泳 ,得到了一致性较好的电泳图
谱 (图 1) 。图谱通过 ImageMaster 5. 0 软件分析 ,
结果显示 : ECA 处理组和清水对照组分别平均检测
到 (354 ±10) 个和 (311 ±12) 个蛋白质点 ( n = 3) ,
以 ECA 组的一个 2D 图谱为参考胶 ,其余 ECA 组
2D 图谱和清水对照组 2D 图谱匹配点数为 (262 ±
3) 个 ( n = 3) 和 (234 ±5) 个 ( n = 3) ,平均匹配率
分别为 73189 %、75136 %。
图 1 　钉螺肝脏蛋白质 22DE 图谱
Fig. 1 　22DE Image of liver proteins from O. hupensis
212 　差异蛋白质的质谱分析和数据库搜索 :通过
ImageMaster 5. 0 软件分析 ,筛选差异蛋白 ,选取蛋
白表达丰度相差 2 倍的差异蛋白质点 19 个 ,进行串
级质谱鉴定 ,鉴定了其中 11 个蛋白点 (图 2) ,其余
8 个蛋白由于无法得到好的肽指纹图谱或搜索数据
库时无法得到可信度较高的结果而未能成功鉴定。
鉴定蛋白点的信息见表 1。可知 ,鉴定成功的 11 个
蛋白质点在 ECA 组均表达上调。此 11 个差异蛋
白分别是假定蛋白、ENSAN GP00000022175 蛋白、
醛脱氢酶、未知蛋白、ENSAN GP00000027067 蛋
白、类似锚蛋白 3 的 1 亚型 4 亚亚型蛋白、相似 A
型肝炎病毒短型细胞受体 1 的蛋白、线粒体异柠檬
酸脱氢酶 2 样蛋白、类似角蛋白的蛋白、角蛋白 10、
角蛋白 1。
3 　讨论
　　植物杀螺剂是世界卫生组织推荐开发的杀螺
图 2 　差异蛋白质点各图
Fig. 2 　Images for differential expressed proteins
·334·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
表 1 　差异蛋白点信息
Table 1 　Information for differential expressed proteins
蛋白质名称
蛋白
质点
登记号
蛋白质
得分
序列覆盖率/
%
PI
蛋白质相对
分子质量
种属来源
假定蛋白 1 6807998 70 23 5184 69 25113 人
ENSAN GP00000022175 2 58395660 94 26 5136 41 52217 冈比亚疟蚊 PEST 株
醛脱氢酶 3 3818533 70 22 7149 55 170
未知蛋白 4 30172720 68 48 6114 13 51516 非洲爪蛙人
ENSAN GP00000027067 5 57971066 72 39 9174 34 79618 冈比亚疟蚊 PEST 株
类似锚蛋白 3 的 1 亚型 4 亚亚型蛋白 6 73952642 73 11 6105 490 39812 狗
相似 A 型肝炎病毒短型细胞受体 1 的蛋白 7 50759667 73 15 812 47 22617 原鸡
线粒体异柠檬酸脱氢酶 2 样蛋白 8 93115142 70 13 7155 50 37415 莫桑比克口孵非鲫
类似角蛋白的蛋白 9 76617955 84 27 5143 53 95415 牛
角蛋白 10 10 307086 102 27 5111 46 35816 人
角蛋白 1 11 17318569 104 34 8116 66 027 人
剂 ,因其具有来源广泛、取材方便、易生物降解、对环
境污染小等优点[ 7 ] ,是目前国内外研究的热点之一。
我国通过对 500 余种植物资源的研究 ,已发现有数
十种植物对钉螺有较强的毒杀作用[8 ] ,不过到目前
为止尚未研究出一种较好的能推广的植物性灭螺药
物[9 ] 。从我国独有的中药 ———血水草根茎中提取的
生物碱 ( ECA) 主要是一类苯并菲啶型生物碱 ,具
有较好杀灭钉螺效果 ,对鱼毒性较低[ 10 ] ,并且 ECA
提取方法简便、费用低廉[5 ] ,是具有开发前景的植物
杀螺剂。为揭示 ECA 灭螺的作用机制 ,本课题组
进行了一系列研究 ,发现 ECA 引起钉螺肝脏细胞
变性 ,并导致钉螺肝脏超微结构和酶发生改变[ 3 ,4 ] 。
本实验利用双向电泳和质谱技术 ,分析了 ECA
处理后钉螺肝脏蛋白质表达的变化。ImageMaster
5. 0 软件分析结果表明 ,钉螺肝脏蛋白质 2D 图谱
上 19 个蛋白点显现出稳定的变化 (上调或下调大
于 2 倍) 。选取这些差异蛋白质点进行质谱鉴定 ,成
功获得 11 个蛋白质 ,这些蛋白质均在 ECA 处理组
表达上调。在鉴定成功的蛋白质中 ,醛脱氢酶是催
化合成维甲酸的酶 ,Ang[11 ] 发现维甲酸在哺乳动物
中通过配体控制的核受体信号通路调节其生长和发
育 ;张延平[ 12 ]报道醛脱氢酶在催化过程中将还原型
辅酶 NAD H 氧化为 NAD + ,而 NAD H 是糖酵解关
键酶 ,也是最重要的还原酶之一。锚蛋白[13 ] 是一种
细胞内连接蛋白 ,连接整合膜蛋白到细胞骨架蛋白
网络 ,参与机体生长、发育、细胞内蛋白转运、细胞信
号转导及 mRNA 转录等 ,近来有研究发现锚蛋白
可能参与细胞凋亡[14 ] 。线粒体异柠檬酸脱氢酶 2
是细胞抗氧化应激损伤防御系统的关键酶 ,通过提
供 NADP H 控制线粒体氧化还原平衡和抵抗细胞
的氧化应激损伤[15 ,16 ] 。角蛋白是一类具有结缔和
保护功能的纤维状蛋白质 ,对正常生理防护功能方
面有重要意义。推测相似 A 型肝炎病毒短型细胞
受体 1 的蛋白在钉螺肝脏的信号转导中起作用。而
其他几种蛋白功能未知 ,可能是钉螺肝脏特有的蛋
白质或者是低等生物的蛋白质 ,目前尚未进行过研
究。此外 ,在质谱鉴定过程发现 ,由于钉螺蛋白质
库/ 基因库尚未建立 ,有些蛋白质虽然获得很好的肽
指纹图谱 ,搜库却找不到匹配的蛋白质 ,Mónica [17 ]
在进行海螺 ( L i t tori na sax ati l is) 蛋白质组学研究
时也曾提到这个问题。
从上述分析可知 ,经 ECA 浸泡后的钉螺肝脏
差异表达的蛋白质主要涉及细胞通讯、细胞凋亡、信
号转导及抗氧化应激损伤和防御等作用。推测
ECA 浸泡钉螺时 ,钉螺为抵抗氧化损伤 ,上调线粒
体异柠檬酸脱氢酶的表达 ,增强机体清除活性氧簇
的能力 ;上调角蛋白 ,改变细胞的通透性 ;并通过上
调锚蛋白和一些受体蛋白 ,改变细胞信号转导 ,诱导
细胞凋亡 ,发挥联合防御 ECA 作用。钉螺在抵抗
ECA 毒性作用时耗能增加 ,因此糖酵解增强 ,醛脱
氢酶表达上调可能是为糖酵解提供更多的 NAD + 。
目前 ,国内外对螺的蛋白质组学报道较少 ,
Bouchut [18 ] 于 2008 年对光滑扁卷螺 ( B iom p hal a2
ri a gl abrata) 的血细胞进行蛋白质组学分析 ,同年
Liana[ 19 ] 对喜浅水双脐螺 ( B iom p hal ari a tena2
gop hi l a) 心包组织和心肌组织蛋白质组进行研究
等 ,而钉螺蛋白组学研究目前国内外未见相关的文
献报道。本研究首次对钉螺肝脏蛋白组进行探讨 ,
通过对 ECA 处理后钉螺肝脏差异蛋白质组学分
析 ,结果表明 ECA 通过对细胞造成氧化损伤、导致
肝细胞糖酵解紊乱、改变细胞信号转导并可能诱导
肝细胞凋亡 ,对钉螺肝脏造成毒害。成功鉴定 ECA
浸泡钉螺后差异表达的蛋白质 ,在揭示钉螺对杀螺
剂起作用的基因是必须的 ,本实验为揭示 ECA 对
·434· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
钉螺肝脏的作用机制提供了重要线索 ,也为来源于
血水草的生物碱作为植物杀螺剂提供科学依据。
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①
(11 广东医学院 广东天然药物研究与开发重点实验室 ,广东 湛江 　524023 ; 21 韦尔斯亲王医院 香港中文
大学外科系 ,香港 新界 沙田 ;31 广东医学院生物化学与分子生物学研究所 ,广东 湛江 　524023)
摘　要 :目的 　从 N F2κB 信号通路着手探讨半边旗活性物质 5F 诱导非小细胞肺癌 NCI2H460 细胞凋亡发生的机
制。方法 　M TT 法检测 5F 对 NCI2H460 细胞的生长抑制作用 ;用半定量 RT2PCR 方法检测 NCI2H460 细胞
IκKβ、IκB、p65 及 p50 mRNA 表达水平的变化。结果 　5F 抑制 NCI2H460 细胞的生长 ,其效果与 5F 的质量浓度
和作用时间相关 ,24、48、72 h 的 IC50分别为 :21. 40、4152、1102μg/ mL ;100μg/ mL 5F 作用 NCI2H460 细胞 6 h 后
能引起 IκKβ和 IκB mRNA 表达水平显著降低 ( P < 0105) ;p65 和 p50 mRNA 水平在作用 3 h 就发生明显减少
( P < 0105) 。结论 　5F 诱导 NCI2H460 细胞凋亡的机制可能是通过抑制核因子2κB (N F2κB) 信号通路来实现的。
关键词 :半边旗 ; 5F ; NCI2H460 细胞 ; 核因子2κB (NF2κB)
中图分类号 :R286191 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2010) 0320435205
·534·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
①收稿日期 :2009206219　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (39870900) ; 粤港合作课题 ( GHP/ 022/ 06) ; 湛江市科技计划项目资助 (2008C01006)
作者简介 :刘　义 (1978 —) ,男 ,贵州人 ,硕士 ,助理研究员 ,主要从事抗肿瘤及抗骨质疏松药物的研究。
Tel : (0759) 2388405 　E2mail : plliu78 @sina. com