全 文 ：超高效液相色谱法测定杜仲中松脂醇二葡萄糖苷
赵骏铭1, 2, 3 ,张紫佳2, 3 *
,孙庆龙4 ,陈  洁2, 3 ,朴虎日1 , 王峥涛2, 3
( 1
延边大学药学院, 吉林 延边  133000; 2
上海中医药大学中药研究所 中药标准化教育部重点实验室,上海  201203;
3
上海中药标准化研究中心, 上海  201203; 4
沃特士科技有限公司, 上海  200233)
摘  要:目的  建立超高效液相色谱法( U PLC) 测定杜仲中主要活性成分松脂醇二葡萄糖苷 ( pino resinol dig lu
coside, PDG)的方法。方法  采用 Acquity C18BEH ( 1
0 mm 100 mm, 1
7
m) UPLCT M色谱柱, 以乙腈水为流动
相,使用 Waters Acquity UPLC system 进行测定。结果  PDG的线性范围为 4
655~ 465
5
g, R2= 0
999 9, 平均
回收率为 99
4% , RSD= 1
7%。结论  本方法准确、简便、高效、重现性好, 可用于杜仲中 PDG的定量测定。同时
UPLC 在分析强保留、高分离度要求、成分复杂、大批量的样品时具有非常明显的优势, 尤其适合对中药复杂体系
的分析。
关键词:超高效液相色谱法( UPLC) ; 杜仲;松脂醇二葡萄糖苷
中图分类号: R286
1    文献标识码: A    文章编号: 02532670( 2010) 11189603
  超高效液相色谱( U PLC)作为一种新兴的色谱
分析手段, 近年来被广泛应用到与质谱联用中。由
于 UPLC 具有高速、高分离度, 低消耗等特点, 目前
也越来越广泛地应用于药物质量评价中 [ 12] ,尤其是
针对中药复杂体系的分析,更具有明显的优势。
杜仲为我国特有珍稀植物,现代药理研究表明,
杜仲具有增强机体非特异性免疫功能,降压、强壮、
抗炎、抗病原微生物等作用。其主要活性成分有绿
原酸、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷
等[ 3]。其中松脂醇二葡萄糖苷 ( pinoresinol diglu
coside, PDG)为杜仲主要降压活性成分 [ 4] , 是评估
杜仲质量的重要指标成分[ 56]。本实验针对杜仲药
材及盐制杜仲中 PDG的量进行测定,在全面地评估
杜仲质量的同时,给出了杜仲盐制前后 PDG的变化
趋势。在研究过程中发现, 按照 2005年版!中国药
典∀中杜仲定量测定项下规定的色谱条件甲醇水
( 25# 75)测定对照品和样品[ 7] ,得到的 PDG色谱峰
是一个单峰,但以乙腈水为流动相, 可将该 PDG 色
谱峰分离出一个占总量 7
54% 的杂质峰(化合物
A)。本研究针对这一发现重新建立了杜仲中 PDG
的测定方法。由于使用 HPLC 无法在适宜的时间
内将化合物 A 与 PDG完全分离, 而延长保留时间
则需要消耗大量溶剂且峰形不佳,故选用 U PLC 作
为分析手段, 收到了理想的效果。UPLC和 HPLC
相比具有高速、高分离度、节约溶剂等优势, 对解决
中药类似的疑难问题提供了可行的方法。
1  仪器与试药
Water s A cquity U PLC 超高效液相色谱仪, 包
括二元泵处理器、样品处理器、柱温箱、PDA 检测器
以及 Empow er ∃色谱工作站; Saptoius BP211D十
万分之一分析天平, M ett ler AE200万分之一分析
天平; M illiQ system 超纯水制备器。乙腈为色谱
纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。
PDG对照品购自中国药品生物制品鉴定所(批
号 111537200502)。杜仲药材及饮片购自各地药
材公司或产地,由上海中医药大学中药研究所吴立
宏博士鉴定为 Eucommia ulmoides Oliv
。杜仲药
材留样保存在上海中医药大学中药研究所标本室。
2  方法与结果
2
1  色谱条件: Acquity C18 BEH ( 1
0 mm 100
mm, 1
7
m) UPLCTM色谱柱, 乙腈水( 9 #91)等度
洗脱,检测波长为 227 nm, 柱温为 25 % , 体积流量
0
1 mL/ min。此条件下 PDG 可与化合物 A 达到
基线分离(分离度约为 1
5) ,色谱图见图 1。
2
2  对照品溶液的制备: 精密称取 PDG 对照品适
量,置 10 mL 量瓶中, 加 10% 乙腈适量使溶解, 用
10%乙腈定容至刻度, 即得对照品储备液。
2
3  供试品溶液的制备:参考 2005年版!中国药典∀
杜仲测定项下供试品溶液的制备方法[ 7]。取本品粗
粉 2 g,置索氏提取器中,加三氯甲烷适量,加热回流 6
h,提取液回收三氯甲烷至干,再置索氏提取器中,加
甲醇适量,加热回流 6 h, 提取液回收甲醇至干,残渣
加 10%乙腈适量使溶解,并转移至 10 mL 量瓶中,加
10%乙腈至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
&1896& 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月

收稿日期: 20100429                     基金项目:国家自然科学基金项目(青年基金 30901952) ;教育部高等学校科技创新工程重大项目培育资金( 706025)
* 通讯作者  张紫佳  T el: ( 021) 51322505  Email: zijiazhang66@ hotmail
com
1PDG  2化合物 A
1PDG  2compound A
图 1 PDG和化合物 A( A)、杜仲药材( B)、盐杜仲(C)的 UPLC图
Fig
1  UPLC Chromatograms of PDG and compound A (A) , Eucommiae Cortex ( B) , and salted Eucommiae Cortex ( C)
2
4  线性关系的考察:精密量取上述对照品储备液
适量, 加 10% 乙腈分别制成 PDG 4
655、9
310、
18
62、37
24、46
55、93
10、186
2、465
5
g / mL
的对照品溶液。各进样 0
5
L, 进样 3次, 以质量
浓度( X )为横坐标, 峰面积为纵坐标( Y)绘制标准曲
线, 计算回归方程 Y = 7 094
9 X + 5 625
8, R2 =
0
999 9。结果表明, PDG 在 4
655~ 465
5
g / mL
有较好的线性关系。同时以仪器的信噪比 S/ N 测
定最低检测限( LOD)和最低定量限( LOQ ) ,当 S/ N
为 3时, 0
47
g/ mL 为 PDG 的最低检测限, 当 S/
N 为 10时, 1
40
g/ mL 为 PDG的最低定量限。
2
5  精密度试验: 吸取上述对照品溶液 ( 46
55

g/ mL) ,重复进样 6 次, 结果 PDG 的峰面积值的
RSD为 0
48%,说明精密度良好。
2
6  稳定性试验:精密吸取供试品溶液 0
5
L, 分
别于 0、4、8、12、24、36、72 h 进样, 考察供试品溶液
的稳定性,结果 PDG峰面积值的 RSD为 2
0%, 说
明供试品溶液在 72 h内保持稳定。
2
7  重现性试验: 取同一批杜仲样品 6份, 各 2 g,
精密称定,制成供试品溶液,进行测定, 以标准曲线
计算其质量分数, 结果 RSD为 1
5%, 说明该方法
重现性良好。
2
8  加样回收率试验: 取已测定 PDG的杜仲粗粉
1 g ,精密称定 9份,每 3份加入相同量(分别为已知
量的 50%、100%、150% )的 PDG 对照品,按供试品
溶液制备项下方法操作,进行测定。结果的平均值
分别为 98
6%、98
2%、101
3% , RSD为 1
7%。
2
9  样品测定: 按上述 2
3项下制备供试品溶液,
并按 2
1项下条件进行测定, 按标准曲线进行计算,
样品的量按干质量计算, 结果见表 1。
3  讨论
3
1  化合物 A 经 LCMS 分析, 为 PDG 的同分异
构体,色谱行为与 PDG极为相似,分别以甲醇水和
乙腈水系统进行测试,结果表明 PDG 与化合物 A
在甲醇水系统中分离度不理想, 而在乙腈水系统
表 1 杜仲药材和盐杜仲中 PDG的量
Table 1  PDG Content in Eucommiae Cortex
and salted Eucommiae Cortex
杜仲药材 水分/ % PDG/ % 盐杜仲  水分/ % PDG/ %
上海康桥 9
43 0
12 四川   10
38 0
08
安徽亳州1 9
57 0
04 上海雷允上 7
32 0
06
山东济南 9
84 0
24 上海雷允上 8
69 0
19
云南菊花村 9
31 0
09 贵州济人堂 8
31 0
15
西宁 9
97 0
14 浙江杭州  7
57 0
11
安徽毫州2 10
31 0
06 上海康桥  8
77 0
20
四川五块石 9
96 0
07 山东济南  6
86 0
04
均值 9
77 0
11 西宁   10
78 0
21
成都   10
21 0
15
均值   8
76 0
13
中可实现基线分离。为了兼顾分离度和保留时间,
故选择乙腈水( 9#91) ,可在 14 min内使其分离度
达到 1
5。
3
2  在对照品溶液和供试品溶液的制备过程中,应
尽量使用流动相进行溶解和定容, 避免高浓度有机
相在分析过程中产生溶剂效应, 影响王PDG与化合
物 A 的色谱峰形及分离度。
3
3  经 U PLC分析, PDG 对照品中含有 7
54%的
化合物 A,故以上实验数据均为按 PDG对照品称样
量或浓度的 92
46%作为对照品的实际称样量或浓
度计算得来。
3
4  样品测定结果表明, 盐杜仲中 PDG 的量略高
于杜仲药材,可见盐制作为中国传统炮制方法, 可以
提高杜仲中某些有效成分的量。此外, 由于杜仲中
含有大量的杜仲胶,使其原药材具有很高的韧性,不
便打粉或与其他辅药混匀, 经炮制以后,胶丝失去弹
性而易断裂,从而解决了原药材的不便之处。
3
5  将本法与 HPLC 进行比较的结果证明, 在得
到相同分离度( 1
5)的前提下, U PLC 需要 14 min,
消耗溶剂 1
4 mL; HPLC需要约 60 min, 消耗溶剂
剂约 60 mL。可见 UPLC 具有快速简捷和经济高
效等优势。
3
6  由于 UPLC和 HPLC 具有相同的运行原理,
故常规 HPLC 方法可以简单地转化为 U PLC方法,
&1897&中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
无需花费大量时间进行摸索测试条件。
致谢:上海高校创新团队建设资金资助。
参考文献:
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制剂研究中的应用[ J]
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人参皂苷Rg1、Re、Rb1 的含量[ J]
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[ 4]  郑虎占,董泽宏,余  靖
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北京:
学苑出版社, 1998

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北京:中国中医药出版社, 2001

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[ 7]  中国药典[ S]
一部
2005

菝葜RAPD扩增条件优化
仇  萍1, 2 ,刘春林1 ,盛孝邦1 *
,黄宇明2 ,张光贤2
( 1
湖南农业大学, 湖南 长沙  410128; 2
怀化正好制药有限公司,湖南 怀化  418000)
摘 要:目的  研究菝葜的 RAPDPCR 扩增体系最适宜的条件。方法  采用 CTAB 提取方法,从菝葜的嫩叶中提
取总基因组 DNA,以此为模板, 优化菝葜 RAPD PCR的反应条件。结果  最适宜的 PCR 扩增体系为:反应体积
30
L , 内含 0
20
mol/ L 引物、200
mo l/ L dNTP、40 ng 模板 DNA、2 U Taq DNA 聚合酶、2
mo l/ L Mg2+ 。结
论  通过扩增条件优化实验,建立了重复性好、稳定性高的药用植物菝葜 RAPDPCR 扩增体系最适宜的条件, 筛
选出条带清晰多态性好的 14 条随机引物, 共扩增得到 144 条电泳带, 其中有多态性带 62 条, 检测到了62 个多态性
位点,多态率为 43%。
关键词:菝葜; RAPD; 条件优化
中图分类号: R286
01   文献标识码: A    文章编号: 02532670( 2010) 11189804
  菝葜 Smilax china L
为百合科菝葜属植物,
别名金刚藤、金刚刺、铁菱角、马加勒、筋骨柱子、红
灯果等。在我国 400年前就有菝葜药用的记载, 始
载于!名医别录∀。民间称药用菝葜为金刚藤, 其根
茎具有祛风利湿、解毒散瘀的功效,多用于治疗风湿
关节痛、跌打损伤、胃肠炎、痢疾、消化不良、糖尿病、
乳糜尿、白带、癌症等, 其叶外用可治疗疔疮、烫
伤[ 12]。目前市场上以菝葜根茎的提取物为主要组
分的药品有金刚藤糖浆、金刚藤颗粒、金刚藤片、金
刚藤胶囊、三金片、金鸡胶囊等, 主要用于治疗附件
炎和附件炎性包块及妇科多种炎症等, 年销售量达
5~ 10亿元人民币, 是临床上治疗妇科炎症的常用
药品;复方菝葜颗粒则用于治疗癌症。因此, 菝葜的
药用价值很高, 极具开发潜力。
RAPD 技术是 DNA 分子标记技术的一项创
新,可直接反映染色体组 DNA 多态性, 不受环境限
制,具有操作简单快捷、成本低、通用性好、灵敏度
高,且无需预知基因组的相关分子生物学信息等优
点,广泛应用于遗传多样性、生物种群划分、遗传图
谱构建、基因定位等方面的研究 [ 310]。在用 RA PD
技术进行植物种的遗传多样性分析时, 首先要建立
稳定的反应体系, 以确保其结果的可靠性、重复
性[ 1 1]。为此, 本实验就菝葜 RAPD 反应中的模板
DNA 浓度、引物浓度、dNT Ps浓度、Mg 2+ 浓度、Taq
酶用量等因素进行实验,初步建立稳定性好、重复性
高的 RAPD反应体系, 为深入分析菝葜遗传多样性
提供了基础资料。
1  材料与方法
1
1  材料: 根据菝葜的分布情况,于 2005年 5月和
8月分别从金刚藤主产区湖南省芷江、会同、靖州、
雪峰山和鸡公界 5个地区采集。其中材料 1采自芷
江明山下、材料 2~ 4采自会同、材料 5~ 7采自靖州
寨芽、材料 8~ 10采自雪峰山大峰、材料 11~ 15采
自鸡公界。
1
2  主要试剂及仪器
1
2
1  试剂: T aq DNA 聚合酶、15 个随机引物
( Sangon 公司)、10 Buffer、MgCl2、dNT P、DNA
Ladder M arker、琼脂糖(西班牙分装)。
1
2
2  仪器: 凝胶成像系统 ( Gel DOC 1000, BIO
RAD) ,台式高速冷冻离心机 ( T GL ∋ 16M ) , Smart
&1898& 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月

收稿日期: 20100524                     作者简介:仇  萍( 1965 ∋ ) ,女,湖南省怀化市人,高级工程师,在读博士,湖南正清制药集团股份有限公司总工程师,长期从事药品的研发、工艺技术及生产管理工作,先后获得新药证书 6个,发明专利 11个,先后获得省科技进步奖,省优秀发明人称号,研究方向为遗传育种。T el : 13973161359  Fax: ( 0731) 88807044  Email: qiu zq@ vip
163
com
* 通讯作者  盛孝邦