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DNA分子标记在铁皮石斛研究中的应用
冯尚国 ,胡 　旭 ,赵红燕 ,王慧中 3 ①
(杭州师范大学 生物化学与分子生物学杭州市重点实验室 ,浙江 杭州 　310018)
摘　要 :铁皮石斛具有滋阴养胃、润肺止咳、抗癌和延年益寿等功效 ,是我国的名贵药材。近年来 ,由于过度采收及
生境破坏严重 ,铁皮石斛资源非常紧缺 ;另外 ,目前市场上商品铁皮石斛掺假现象十分常见 ,严重影响了商品铁皮
石斛的质量。综述了 DNA 分子标记技术在铁皮石斛研究中的应用进展 ,为铁皮石斛的精确鉴定及对其种质资源
合理开发和保护提供了有效的分子技术依据。
关键词 :铁皮石斛 ;分子标记 ;鉴别
中图分类号 :R28211 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2010) 0320499204
Application of D NA molecular marker in study on Dendrobium of f icinale
FEN G Shang2guo , HU Xu , ZHAO Hong2yan , WAN G Hui2zhong
( Key Laboratory of Hangzhou City for Biochemist ry and Molecular Biology , Hangzhou Normal
University , Hangzhou 310018 , China)
Key words : Dend robi um of f ici nale Kimura et Migo ; molecular marker ; aut hentication
　　铁皮石斛 Dend robi um off icinale Kimura et Migo 是兰
科 (Orchidaceae) 石斛属 ( Dend robi um) 植物 ,主要分布于我
国云南、广西、浙江、安徽、福建、四川等省区 [1 ] 。铁皮石斛在
《神农本草经》中被列为上品 ,在《道藏》中和天山雪莲、三两
重人参、花甲之茯苓、百二十年首乌、深山灵芝、冬虫夏草、苁
蓉、海底珍珠等一起被列为“中华九大仙草”,铁皮石斛位于
九大仙草之首 ,具有滋阴养胃、润肺止咳、清热明目之功效 ,
另外 ,还有增强人体免疫力 ,抗肿瘤等作用 [2 ] 。由于铁皮石
斛非常名贵 ,人为过度采收和生境破坏严重 ,加之铁皮石斛
生境独特、繁殖困难 ,铁皮石斛野生资源处于极度濒危状态 ,
被国家列为重点保护的野生珍贵药材品种。鉴于此 ,近年
来 ,对铁皮石斛的人工繁殖 [3 ,4 ] 、药材质量控制 [5 ]等进行了大
·994·中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
①收稿日期 :2009207203　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金 (30670199 ,30770185 ,30870180) ;浙江省科技计划项目 (2008C12081 ,2006C32016) ;杭州市重点实验室项目
(20080432 T06) ;钱江人才计划资助项目
作者简介 :冯尚国 (1980 —) ,男 ,山东菏泽人 ,硕士研究生 ,主要从事植物遗传多样性研究。
Tel :15868471071 　E2mail :shangguo007 @126. com3 通讯作者　王慧中　E2mail :whz62 @163. com
量研究。然而 ,目前市场上商品铁皮石斛掺假现象十分常
见 ,严重影响了商品铁皮石斛的质量。因此 ,寻找有效的鉴
别铁皮石斛的方法是十分重要的。
DNA 分子标记能对不同发育时期的生物个体、任何组
织器官甚至细胞进行检测 ,数量极多 ,遍及整个基因组 ,多态
性高 ,遗传稳定 ,不受环境及基因表达中的限制。本文详细
综述了近年来分子标记在铁皮石斛研究中的应用现状 ,目的
是为铁皮石斛的精确鉴定和对其种质资源的合理开发和利
用提供有效的分子技术依据。
1 　随机扩增 DNA 多态性 ( random amplif ied polymorphic
DNA, RAPD)
RA PD 分子标记是由美国杜邦公司科学家 Williams 与
加利福尼亚生物研究所的 Welsh 所领导的两个小组 1990 年
同时发展的一种标记技术 ,该标记具有操作简单、通用性高、
费用低、不需知道研究对象基因组序列等优点。
彭锐等 [6 ]采用 RA PD 分子标记对包括贵州铁皮石斛在
内的 15 种石斛进行鉴定 ,研究从 70 个随机引物中筛选出 10
个有效引物进行 DNA 扩增 ,共产生 99 个 DNA 片段 ,平均
每个引物扩增出 9. 9 个 DNA 片段 ,99 个片段中公共片段 15
个 ,显示多态性片段 84 个 ,占 84. 85 % ;聚类分析表明 ,10 个
引物能将 15 种石斛属植物有效的区分开 ,其中 4 种扩增出
特异性带 ,说明 RA PD 技术用于中药石斛鉴定是一种有效
的方法。张铭等 [7 ] 利用 RA PD 标记技术对石斛属的 26 个
种和金石斛属的 1 个种进行了基因组 DNA 多态性分析 ,并
构建聚类树状图 , 根据筛选到的 DNA 片段序列 , 将
Sangon18 引物从 3′端延长至 20 bp ,设计成的特异性引物能
方便快捷地鉴别出铁皮石斛。丁鸽等 [8 ]采用 RA PD 分子标
记技术对铁皮石斛 8 个野生居群的遗传多样性、亲缘关系及
分子鉴别等进行研究 ,利用 S412 引物可以有效地鉴别铁皮
石斛的 8 个野生居群。王慧中等 [9 ]利用 10 个 RA PD 引物对
13 种石斛属植物进行遗传多样性和亲缘关系分析 ,将铁皮
石斛和其他石斛物种区分开。
2 　扩增片段长度多态性( amplif ied fragment length polymor2
phis , AFLP)
A FL P 分子标记技术由 Zabean 和 Vos 等在 1993 年发
明的 ,其将基因组 DNA 用成对的限制性内切酶双酶切后产
生的片段用与酶切位点互补的接头连接起来 ,并通过 5′端与
接头互补的半特异性引物扩增得到大量 DNA 片段 ,从而形
成指纹图谱的分子标记。A FL P 标记既具有 RA PD 标记技
术的方便性 ,又具有限制性内切酶片段长度多态性 ( rest ric2
tion f ragment length polymorphisma , RFL P) 标记技术的可
靠性 [10 ] ,因此 ,被广泛应用于石斛的研究。
王慧中等 [11 ]采用 A FL P 技术对 13 种石斛属植物进行
研究 ,选择性扩增引物组合 E + ACT/ M + CAC、E + AAC/
M + CAC和 E + ACA/ M + CAC 分别对 13 种材料进行扩增 ,
得到丰富的条带 ,成功地将铁皮石斛与其他石斛物种分开 ,
表明 AFL P 标记技术对石斛属植物的遗传多样性和分类鉴
别研究是可行的。白音等 [12 ]利用 A FL P 标记技术对我国 38
种石斛进行研究 ,把铁皮石斛与其他 37 种石斛属植物区别
开。Li 等 [13 ]利用 A FL P 标记技术对 12 个铁皮石斛居群的
71 个植株的遗传多样性及居群遗传结构进行研究 ,发现居
群间分化系数处于 0. 047～0. 578 ,居群间的遗传变异平均
百分比为 26. 97 % ,利用 TFP GA 软件进行 U P GMA 聚类 ,
把 12 个铁皮石斛居群分为 3 大类。
3 　简单重复序列( simple sequence repeat , SSR)
SSR 标记又称微卫星 DNA ,是一类由几个 (多为 1～6
个)碱基组成的基序串联重复而成的 DNA 序列 , SSR 的基
序中最常见的是 (CA) n 和 ( T G) n 双核苷酸重复 [14 ] 。SSR 标
记技术是由 Moore 等 1991 年创立的 ,其基本原理是根据微
卫星重复序列两端的特定短序列设计引物 ,通过 PCR 反应
扩增微卫星片段。SSR 标记具有数量丰富、多态性高、共显
性、重复性好等优点。近年来 ,微卫星标记已经成为比较理
想的分子标记 ,并且在石斛研究中也开始有所应用。
Yue 等 [15 ] 从研究的 42 个商业石斛杂交品种中开发出
了 14 个 SSR 多态性标记 ,并将其用于石斛品种的鉴定 ,结
果显示 ,这些 SSR 标记可以用于分子生态学研究、遗传图谱
构建和遗传辅助育种 ,同时还可以用于石斛新品种的保护。
Gu 等 [16 ]从两个富含微卫星的文库中分离和鉴别出 12 个微
卫星标记 ,以乐业铁皮石斛居群的 22 个个体为研究对象 ,研
究发现这些标记具有多态性 ,并且每个标记出现 3～12 个等
位基因 ,观察和预期的杂合度分别介于 0. 150～0. 624 及
0. 162～0. 605 ,首次从铁皮石斛中发现微卫星标记特征 ,可
以用来进行种质资源保护、遗传多样性、种群结构及个体鉴
定等研究。
4 　简单重复序列间区( inter2simple sequence repeats , ISSR)
ISSR(简单重复序列中间区域) 标记技术是由加拿大蒙
特利尔大学的 Zietkiewicz 等于 1994 年提出的。其原理是用
加锚定的微卫星寡核苷酸作引物 ,即在 SSR 的 5′端或 3′端
加上 2～4 个随机选择的核苷酸 ,引起特定位点退火 ,从而导
致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间的 DNA 片
段进行 PCR 扩增。ISSR 标记技术结合了 RA PD 和 SSR 标
记技术的优点 ,既具有很好的稳定性和多态性 [17 ,18 ] ,又有操
作简单、快速、高效等 [19 ] 特点 ,目前已经广泛用于植物的多
个领域研究中。
ISSR 标记技术在石斛研究中也有广泛应用。沈颖
等 [20 ]最先采用 ISSR2PCR 方法对石属 9 种植物进行鉴别 ,发
现引物 UBC2807 和 UBC2864 具有较高的多态性条带比率 ,
可以独立将云南铁皮石斛和其他 8 种供试种区分开来 ,表明
ISSR 标记技术作为一种简便、可靠的分子标记鉴定技术 ,可
以用于石斛属种间鉴别。沈洁等 [21 ] 针对铁皮石斛 ISSR 的
反应特点 ,建立了稳定可靠的 ISSR 分子指纹标记反应体系 ,
为进一步研究铁皮石斛的居群差异奠定基础。Shen 等 [22 ]利
用 ISSR 标记技术对铁皮石斛的 8 个居群进行研究 ,10 个
ISSR 引物扩增出 127 个 DNA 片段 ,其中 115 个 DNA 片段
是多态性 ,多态性比为 90. 5 % ,同时发现 16 个具有特异性
的标记 ,研究表明供试铁皮石斛的 8 个野生居群可以用 ISSR
·005· 中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
标记技术精确的区分开。
5 　相关序列扩增多态性 ( sequence2related amplif ied poly2
morphism, SRAP)
SRA P 标记技术由美国加州大学 Li 与 Quiros 于 2001
年开发出来的 ,是一种基于 PCR 的新型分子标记技术 ,又名
为基于序列扩增多态性 ( sequence2based amplified polymor2
phism , SBAP) [23 ] 。SRA P 通过设计一对特异的引物对开放
阅读框 (ORFs) 进行扩增。上游引物中的 CCGG 序列可与
ORFs 区域中的外显子特异性结合 ,下游引物中的 AA TT 序
列特异结合于富含 A T 区的内含子和启动子。这样上下游
引物结合可以同时对外显子、内含子和启动子区域进行特异
性扩增 ,并且因为个体不同及物种的内含子、启动子和间隔
序列不同而产生多态性。SRAP 标记是一种新型的分子标
记 ,具有操作简单、多态性高、稳定、共显性遗传及花费少等
优点 ,目前已经被应用于植物遗传多样性分析 [24 ] 、遗传连锁
图谱构建 [25 ] 、重要性状基因标记 [26 ]及比较基因组学 [27 ]等研
究领域。
樊洪泓等 [28 ]首次将 SRA P 标记技术应用于石斛遗传多
样性研究中 ,对包括铁皮石斛 3 个居群的 9 种供试石斛进行
研究 ,发现霍山石斛在分类地位上更接近于铜皮石斛 (相似
系数为 0. 689 4) ,与铁皮石斛的亲缘关系相对较远 (相似系
数为 0. 561 3) ,浙江、云南和霍山 3 个居群的铁皮石斛中 ,浙
江居群与云南居群的亲缘关系更近 ,相似系数为 0. 789 2。
研究表明 ,SRA P 技术可以应用于药用石斛的遗传多样性及
亲缘关系的研究。Ding 等 [29 ]利用 SRA P 标记对铁皮石斛的
9 个野生种的 84 个植株进行研究 ,发现在物种水平上遗传
多样性较高 ( PPB = 88. 07 % , H E = 0. 288 0) ,居群水平上差
异性较低 ( PPB = 51. 68 % , H E = 0. 187 8) 。同时发现 ,居群
间分化系数分布于 0. 132 7～0. 415 1 ,种群平均遗传多样性
为 27. 05 %。用 TFP GA 软件做得聚类图把 9 种铁皮石斛
84 个植株聚为两类 ,与 N TSYS 分析得到结果一致。
6 　核糖体 DNA( rDNA)内转录间隔区序列( ITS)标记
ITS 在 rDNA 中位于 18S～26S 基因 ,由 5. 8 基因分两
段 ITS1 和 ITS2 ,5. 8S、18S、26S 进化速度慢 ,通常用于研究
科级及科级以上等级的系统发育问题 ,而 ITS 区进化速度较
快 ,可以用于研究属间、种间及居群间的系统关系。现已在
冬虫夏草 [30 ] 、绞股蓝 [31 ] 、甘草 [32 ] 、灵芝 [33 ] 、何首乌 [34 ] 、丹
参 [35 ]等中药植物鉴别研究中有所应用。
Lau 等 [36 ]报道 16 个不同的石斛种间 ITS2 序列平均差
异 12. 4 % ,而与非兰科植物以及拟石斛之间平均有 29. 8 %
和 18. 8 %的序列不同 ,并认为 ITS2 序列可以用于鉴别药用
石斛的真假。丁小余等 [37 ]运用 PCR 直接测序法对广西、云
南、贵州铁皮石斛主要居群的 rDNA ITS 区进行碱基序列测
定 ,发现铁皮石斛居群内部 rDNA ITS 区的差异与植物生活
型的差异呈一定的相关性 , H 型居群的铁皮石斛是 F 型的
变种 ,首次报道了铁皮石斛 ITS 区域的碱基序列。另外 ,丁
小余等 [38 ]对枫斗类石斛的 rDNA ITS 区序列进行测序及分
析 ,并且建立了 21 种枫斗类石斛的 rDNA ITS 区全序列数
据。Ding 等 [39 ]利用叶绿体基因片段 (mat K和 rbcL) 、rDNA
ITS和线粒体基因 (nad1 int ron 2)对铁皮石斛的 8 个居群进
行研究 ,发现居群间 mat K、rbcL 和 nad1 int ron 2 之间没有
差异性 , 而在 rDNA ITS 区存在 9 个单核苷酸多态性
(SN Ps) 。利用这些 SN Ps 设计两对等位基因特异性引物 ,结
合等位基因特异 PCR ( AS2PCR) 方法可以将不同来源的铁
皮石斛区分开 ,并将来自 GSG和 FSC 两个优质种群的样品
从 50 种枫斗商品中区分出来 ,为铁皮石斛的道地性研究和
铁皮枫斗的质量监控打下了基础。
7 　其他标记技术
与 rDNA ITS一样 ,叶绿体基因片段和线粒体基因片段
在药用植物研究中也有广泛的应用。滕艳芬等[40 ] 比较包括
铁皮石斛在内的几种《中国药典》收载石斛和常见市场混淆品
种的 mat K基因序列 ,发现非石斛属的几种混淆品与正品石
斛间的 mat K基因序列差异远大于正品石斛间的差异 ,研究
表明 mat K基因序列可以分析石斛及其混淆品的遗传关系 ,
将正品与混淆品区分开来。Zhang 等[41 ]扩增并测定 9 种石斛
属植物线粒体中 NADH 脱氢酶亚基基因 (nad1)内含子 2 (in2
tron 2)全长序列 ,结果显示线粒体 nad 1 intron 2 序列可以作
为一种新的标记技术用于石斛属植物的鉴定。这些研究都为
铁皮石斛种质资源的鉴别和保护研究提供了新的技术。
另外 ,抑制消减杂交 ( suppression subtractive hybridiza2
tion , SSH) 技术、单核苷酸多态性 ( single nucleotide poly2
morphism , SN P)技术及适配器连介导的等位基因特异性扩
增技术 ( adapter ligation2mediated allele2specific amplifica2
tion , AL M2ASA ) 在 铁 皮 石 斛 鉴 别 研 究 中 也 有 重 要
应用 [42～45 ] 。
8 　前景展望
分子标记技术在铁皮石斛上的应用 ,有助于铁皮石斛种
质资源的鉴别保护和开发利用。现代分子标记虽有缺陷 ,但
是与传统标记 (形态标记、细胞标记及生化标记)相比有许多
优点 ,分子标记是直接在 DNA 分子上检测生物间的差异 ,
是在 DNA 水平上遗传变异的直接反映。随着分子生物理
论和技术的快速发展 ,会不断开发出速度更快、费用更低、可
靠性更高的分子标记技术 ,DNA 分子标记在铁皮石斛研究
中应用会更加广泛 ,更加深入。
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·附 2 ·　　　　　　中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月