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复方丹参滴丸对高糖高胰岛素诱导培养的兔骨骼肌细胞糖代谢的影响
陈
频,王艳桥,徐向进* ,史道华
(南京军区福州总医院 ,福建 福州
350025)
摘
要:目的
探讨复方丹参滴丸对高糖高胰岛素诱导培养的兔骨骼肌细胞糖代谢的作用及其机制。方法
组织
贴块法培养兔骨骼肌细胞,予正常培养及高糖高胰岛素诱导培养,分别设对照组、吡格列酮 ( 0
1 mmol/ L ) 组、丹参
素 ( 1
0 g / L ) 组, 三七皂苷 R1 ( 1
0 g/ L) 组及复方丹参滴丸浸膏低、中、高剂量 ( 0
1、0
5、1
0 g/ L) 组。采用己糖
激酶法测定细胞上清液中葡萄糖水平和 RT-PCR 法测定肌细胞中葡萄糖转运蛋白-4 ( G lut-4) mRNA 表达。结果
高糖高胰岛素培养可诱导骨骼肌细胞产生胰岛素抵抗 ( IR) , 表现为培养基上清液中葡萄糖水平增加 ( P< 0
01) ,
骨骼肌细胞 Glut-4 mRNA 表达下降 ( P< 0
01)。与模拟 IR 状态下对照组比较,吡格列酮、丹参素及中、高剂量复
方丹参滴丸组细胞培养上清液中葡萄糖水平下降 (P < 0
05、0
01) , 骨骼肌细胞 Glut-4 mRNA 表达均有增加, 且
中、高剂量复方丹参滴丸与吡格列酮 3 组间差异无统计学意义 ( P > 0
05) , 丹参素的作用弱于吡格列酮 ( P <
0
05, 低剂量复方丹参滴丸与三七皂苷 R1组影响不显著 ( P > 0
05)。结论
复方丹参滴丸可以增强高糖高胰岛
素诱导的骨骼肌细胞 Glut-4 mRNA 表达,促进糖利用, 改善 IR。
关键词:复方丹参滴丸; 骨骼肌细胞; 葡萄糖转运蛋白-4 ( G lut-4) ; 胰岛素抵抗 ( IR) ; 糖代谢
中图分类号: R285
5


文献标识码: A


文章编号: 0253-2670( 2010) 09-1510-04


胰岛素抵抗 ( insulin resistance, IR) 与胰岛素
受体后信号传导缺陷密切相关, 其中葡萄糖转运蛋
白-4 ( Glut-4) 介导的糖转运是此途径的主要限速
步骤[ 1] 。近年来发现中药在 IR 防治中具有重要开
发价值。复方丹参滴丸作为经典活血化瘀复方制
剂,由丹参、三七、冰片组成 [ 2] , 具有清除自由基、抗
氧化、改善血管内皮功能、抑制血管平滑肌细胞增殖
等改善 IR 的潜在作用[ 3-4] 。但复方丹参滴丸对 IR
时糖代谢的作用少见报道。本研究通过离体细胞实
验观察复方丹参滴丸对高糖高胰岛素诱导培养的兔
骨骼肌细胞培养基细胞上清液中葡萄糖水平及肌细
胞 Glut-4 mRNA 表达的影响, 探讨复方丹参滴丸
改善 IR 的机制。
1
材料
1
1
药品与试剂:复方丹参滴丸浸膏及吡格列酮原
料药分别由天津天士力制药集团有限公司和杭州中
美华东制药有限公司惠赠; 丹参素 (批号 110855-
200506) 及三七皂苷 R1 (批号 110745-200415) 购
于中国药品生物制品检定所。葡萄糖检测试剂盒,
宁波美康生物科技有限公司产品; 胰岛素为上海第
一生化药业有限公司产品 (批号 060504)。
1
2
药品配制: 精密称取复方丹参滴丸浸膏 200
mg,溶于 10 mL 亚沸水;精密称取吡格列酮原料药
19
6 mg,溶于 400
L 0
5% 乙醇;精密称取丹参素
20 mg, 溶于 1 mL 亚沸水; 精密称取三七皂苷 R1 20
mg,溶于 1 mL 亚沸水; 各药品溶液均滤过除菌,
4
保存。
1
3
培养基制备: 取一份 RPM I 1640 粉末及 2 g
NaHCO3 ,溶于 1 000 mL 亚沸水中,调 pH 至 7
0,
滤过除菌。另取一份 RPM I 1640 粉末、2 g NaH-
CO3及 3 g 葡萄糖 (终浓度为 25 mmol/ L ) , 溶于
1 000 mL 亚沸水中,调 pH 至 7
0,滤过除菌,即得
高糖 RPM I 1640 培养基。RPM I 1640 培养基中加
入 20% 小牛血清, 双抗, 即得 20% 血清培养基。

1510
中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
* 收稿日期: 2010- 01-18





















基金项目:福建省自然科学基金资助项目 ( 2008J0104)作者简介:陈
频( 1969
) ,女,医学硕士,副主任医师,研究方向为糖尿病及其慢性血管并发症机制及防治研究。
* 通讯作者
徐向进
E- mai l: chen pin@ 21cn. com
高糖 RPMI 1640 培养基中加入 20% 小牛血清、双
抗、100 U/ L 胰岛素,即得高糖高胰岛素 20% 血清
培养基 (模拟 IR 培养基)。培养基均于 4
保存。
1
4
PCR 引物: 依据 GenBank 收录的人
- act in、
Glut-4 全长序列,采用 Primer 5. 00 软件设计并委
托上海博亚公司合成。Glut-4 ( 513 bp) 正向引物:
5
-CCAGT ATGT TGCGGTAGGT C-3
, 反向引物:
5
-AGAGGT GT TGACGGAGT GAG-3
;
-act in
( 116 bp) 正向引物: 5
-CT CTT CCAGCCTT CCT-
T CCT-3
, 反向引物: 5
-AGCACTGTGT TGGCG-
T ACAG-3
。
2
方法
2
1
兔骨骼肌细胞原代培养及传代: 新西兰大白
兔,雄性,体质量 1
5 kg ,由中国科学院上海实验动
物中心提供, 动物合格证号: SCXK 沪 2002-0013。
剪取兔股四头肌, 在无菌环境中置入含 Hank
s 液
的培养皿, 并洗净凝血块。采用组织贴块方法原代
培养骨骼肌细胞 ( SMCs ) [ 5]。传代后细胞置于
20% 小牛血清、1
105 U/ L 青霉素和 100 mg / L 链
霉素的 RPM I 1640 培养基, 在 37
、5% CO2、饱
和湿度培养箱中培养。
2
2
实验分组: 分别设细胞对照、吡格列酮 ( 0
1
mmo l/ L )、丹参素 ( 1
0 g / L )、三七皂苷 R1 ( 1. 0 g/
L) 及复方丹参滴丸浸膏低、中、高剂量 ( 0
1、0
5、
1
0 g/ L) 干预组。
2
3
细胞培养及加药处理: 取第 5~ 15 代细胞, 消
化后以每孔 1
104个细胞接种于 96 孔板, 每孔
200
L 细胞液,常规培养 24 h 后,弃上清,加入 200

L 0
4% 小牛血清培养基培养 24 h,同步化。弃上
清,加入相应药物干预,重复 6 孔, 补充 20% 小牛
血清培养基至 200
L,继续培养 72 h。正常培养和
模拟 IR 培养分别用正常培养基和高糖高胰岛素
20% 血清培养基培养, 其他条件相同。
2
4
细胞培养上清液中葡萄糖水平测定: 取 96 孔
板中细胞上清液,采用己糖激酶法测定,按试剂盒说
明书操作。
2
5
肌细胞 Glut-4 mRNA 表达测定: 取长满瓶底
的细胞,以 Hank
s 液冲洗 3~ 4 遍, 分别加入相应
药物干预,补充 20% 小牛血清培养基至 4 mL, 继
续培养 72 h。取培养瓶中细胞,以 PBS洗 2~ 3遍,
再加入 5 mL PBS, 用细胞刮仔细将细胞刮离培养
瓶底。采用 T rizol 一步抽提细胞总 RNA, 在
42
、1 h, 92
、2 min 条件下进行逆转录, 所得
cDNA 按 94
预变性 4 min, 94
、30 s, 58
5
、
45 s, 72
、45 s,共 35 个循环扩增, 72
延伸 10
m in。所得 PCR 产物在 1
8% 琼脂糖凝胶上电泳,
拍照,将目的条带与内参条带灰度进行比较并计算
相对表达量。
2
6
统计学分析: 数据用 x
s 表示, 统计学处理
使用 SPSS 11
0统计软件, 组间差异比较采用单因
素方差分析 ( Student-N ewman-Keul法) ,两样本均
数比较采用 Student
s t 检验。
3
结果
3
1
培养的兔骨骼肌细胞鉴定:采用组织贴块法培
养的兔骨骼肌细胞,倒置显微镜下观察,细胞呈长梭
形,峰、谷明暗相间。苏木素 HE 染色后, 胞浆丰
富,胞核位于中央,两端钝圆,肌纤维染成红色, 胞核
为蓝色。用骨骼肌肌动蛋白 A ct in 作为一抗,免疫
组化 (两步法) 染色,细胞胞浆着棕红色, 胞核不着
色,证实为骨骼肌细胞。
3
2
对兔骨骼肌细胞正常及模拟 IR 培养细胞上
清液中葡萄糖水平的影响:正常培养状态下各给药
组细胞培养液中葡萄糖水平与对照组比较差异无统
计学意义。模拟 IR 培养状态下对照组的细胞培养
液中葡萄糖水平明显高于正常培养对照组葡萄糖水
平,吡格列酮、丹参素及中、高剂量复方丹参滴丸干
预组的细胞培养液中葡萄糖水平较对照组明显降
低;中、高剂量复方丹参滴丸及吡格列酮 3个组间比
较差异无统计学意义; 吡格列酮组细胞上清液中葡
萄糖水平明显低于丹参素组。而低剂量复方丹参滴
丸与三七皂苷 R1干预组细胞培养液中葡萄糖水平
与对照组差异无统计学意义,见表 1。
表 1
复方丹参滴丸对正常及 IR 培养骨骼肌细胞
上清液中葡萄糖水平的影响 ( x
s, n= 6)
Table 1
Effect of Compound Danshen Droping Pill
on content of glucose in medium of SMCs
in normal and IR condition (x
s, n= 6)
组别 剂量/ ( g
L- 1 )葡萄糖/ (m ol
L- 1 ) 组别 剂量/ ( g
L- 1)葡萄糖 / ( mol
L- 1 )
正常培养对照 - 12
9
0
3 IR培养对照 - 27
1
0
9* *
吡格列酮 0
04 12
5
0
5 吡格列酮 0
04 22
2
1
2

丹参素 1
0 12
3
0
6 丹参素 1
0 23
9
1
0

三七皂苷 R1 1
0 12
2
0
7 三七皂苷 R1 1
0 26
8
0
6
复方丹参滴丸 0
1 12
4
0
4 复方丹参滴丸 0
1 27
4
1
0
0
5 12
7
0
4 0
5 21
8
1
0

1
0 12
4
0
6 1
0 22
2
2
0



与正常培养状态下对照组比较: * * P < 0
01


与 IR 状态下对照组比较:
P< 0
05


与 IR 状态下吡格列酮组比较:
P< 0
05


* * P < 0
01 v s cont rol group in normal cult ivated con dit ion



P < 0
05 v s cont rol group in IR cult ivated con dition



P < 0
05 v s pioglit az on e group in IR cult ivated con dition

1511
中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
3
3
对正常培养及模拟 IR 培养状态下兔骨骼肌
细胞 Glut-4 mRNA 表达的影响: 正常培养状态下
各给药组细胞 Glut-4 mRNA 表达量与对照组比较
差异无统计学意义。模拟 IR 培养状态下对照组细
胞 Glut-4 mRNA 表达量较正常培养对照组明显降
低,模拟 IR 培养状态下,吡格列酮、丹参素及中、高
剂量复方丹参滴丸干预组细胞 Glut-4 mRNA 表达
量较对照组增加;且中、高剂量复方丹参滴丸及吡格
列酮 3个组间差异无统计学意义;吡格列酮组细胞
Glut-4 mRNA 表达量高于丹参素组。而低剂量复
方丹参滴丸与三七皂苷 R1干预组与对照组比较差
异无统计学意义,结果见图 1。
与正常状态下对照组比较: * * P < 0
01; 与 IR 状态下对照组
比较:

P < 0
01; 与 IR状态下吡格列酮组比较:

P < 0
01
* * P < 0
01 v s cont rol group in norm al cu lt ivated condit ion;


P < 0
01 v s cont rol group in IR cu lt ivated condit ion;


P < 0
01 v s pioglit az on e group in IR cult ivated condi tion
图 1
复方丹参滴丸对正常及 IR 培养状态下骨骼肌细胞
Glu-t 4 mRNA 表达的影响 (x
s, n= 6)
Fig. 1
Effect of Compound Danshen Droping Pill
on expression of Glu-t 4 mRNA of SMCs
in normal or IR cultivated condition
( x
s, n= 6)
4
讨论


骨骼肌是利用葡萄糖和维持血糖平衡的重要组
织,人类通过骨骼肌代谢的葡萄糖在基础状态和高
胰岛素条件下分别占机体的 20% 和 75% ~ 95% ,
可见高胰岛素状态下, 几乎所有骨骼肌中的葡萄糖
均代谢转化为糖原, 被储存以供利用 [ 6]。胰岛素与
骨骼肌细胞表面的胰岛素受体结合,激活酪氨酸激
酶,导致一系列胰岛素受体底物 ( IRS) 磷酸化, 进
而激活磷脂酰肌醇 3 激酶 ( PI3K ) 途径介导糖
代谢。
葡萄糖从细胞外顺浓度梯度进入细胞需要糖转
运蛋白 ( Glut ) 协助转运, 每一种糖转运蛋白在组
织、细胞中的分布及动力学性质都不同。其中
Glut-4介导的葡萄糖转运是 PI3K 途径中骨骼肌糖
代谢的主要限速步骤。Glut-4 是一种含 509 个氨
基酸的糖蛋白,相对分子质量为 45 000~ 55 000,主
要存在于对胰岛素敏感的骨骼肌、心肌和脂肪组织。
静息状态下,绝大部分 Glut-4 蛋白位于胞浆内的细
胞器膜上, 仅 2% 位于细胞外膜上。当胰岛素与细
胞膜受体结合后, 经过一系列细胞内信号转导途径
的级联反应,触发富含 Glut-4 的囊泡向细胞外膜移
动,囊泡膜与细胞外膜融合, Glut-4 转位至细胞外
膜,葡萄糖便顺着 Glut-4 的亲水性中央通道进入细
胞,完成糖摄取与转运; 当循环中胰岛素水平下降
时, Glut-4通过吞饮作用从细胞外膜清除并回到贮
存囊泡中。研究证明, 胰岛素、运动及电刺激能通过
增强 Glut-4 表达或转位, 快速提高细胞膜的葡萄糖
转运率[ 7-8]。而发生胰岛素抵抗时, 如肥胖、2 型糖
尿病或 Glut-4基因突变、敲除, 可以抑制 Glut-4 合
成或转位,使细胞外膜对葡萄糖转运率下降,造成机
体葡萄糖代谢不平衡[ 9] 。
高糖高胰岛素培养基模拟 IR 状态是体外细胞
实验中常用的模型 [ 10-1 1] , 本研究结果显示高糖高胰
岛素培养可以诱导兔骨骼肌细胞产生 IR,表现为残
存在培养基中细胞上清液中葡萄糖水平增加,即细
胞对葡萄糖的摄取利用减少; 还表现为细胞 Glut-4
mRNA 表达下降。
本研究观察到 IR 状态时兔骨骼肌细胞经丹参
素及中、高剂量复方丹参滴丸干预后,培养基中细胞
上清液中葡萄糖水平明显降低, 细胞 Glut-4 mRNA
表达明显增加,提示丹参素及中、高剂量复方丹参滴
丸可以改善骨骼肌细胞对培养基中葡萄糖的摄取利
用。而且中、高剂量复方丹参滴丸与吡格列酮 3组
间作用差异无统计学意义,丹参素作用明显低于吡
格列酮组。而低剂量复方丹参滴丸和三七皂苷 R1
干预组无统计学意义。本研究结果从细胞水平提示
了一定浓度范围内的复方丹参滴丸及其单体丹参素
提高 Glut-4 mRNA 表达水平, 促进骨骼肌细胞糖
摄取。
复方丹参滴丸由丹参、三七和冰片组成,丹参的
有效成分主要为水溶性丹参素。已有的研究表明丹
参素具有抗凝和纤溶活性,抑制血小板合成和释放
前列环素类物质, 抑制血小板聚集、降低全血黏度,

1512
中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
改善微循环、抑制自由基产生、阻止脂质过氧化的作
用[ 11]。因而,推测复方丹参滴丸浸膏改善葡萄糖代
谢的作用机制可能是通过启动骨骼肌细胞 Glut-4
转录,上调 Glut-4 mRNA 表达,改善胰岛素受体后
信号转导途径, 进而调节葡萄糖代谢,丹参素可能是
复方的有效成分, 且在三七、冰片的协同效应下, 复
方的作用明显优于单体丹参 ,说明复方还有其他的
物质基础,其确切的物质基础及作用机制有待深入
研究。
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巴戟天多糖对骨质疏松大鼠骨密度及血清微量元素的影响
朱孟勇1 ,赫长胜2 ,王彩娇1*
( 1
浙江省台州市中心医院 骨科, 浙江 台州
318000; 2
青岛市胶州区中心医院, 山东 青岛
266300)
摘
要:目的
探讨巴戟天多糖对切除卵巢后骨质疏松大鼠骨密度及血清微量元素的影响。方法
切除大鼠双侧
卵巢,建立骨质疏松模型, 造模后分别给予巴戟天多糖 ( 100、300 mg/ kg ) 干预, 给药 30 d 后检测大鼠骨密度及骨
矿物质、血清 IL-6 和 T NF-
水平、血清微量元素水平。结果
巴戟天多糖组大鼠骨质密度及骨矿物质水平高于模
型组,血清 IL-6、TNF-
表达水平低于模型组, 骨矿物质及血清微量元素水平高于模型组, 并且高剂量作用显著。
结论
巴戟天多糖能够提高切除卵巢后骨质疏松大鼠骨密度, 其可能通过调节血清微量元素水平及 IL-6、TNF-

表达水平发挥作用。
关键词:巴戟天多糖; 骨质疏松; 切除卵巢; 骨密度; 微量元素
中图分类号: R286
1


文献标识码: A


文章编号: 0253-2670( 2010) 09-1513-03


骨质疏松是以骨质量下降为主要表现的退行性
骨病,临床发病率高,相对骨折发病率在 50 岁以上
男性与女性分别高达 1/ 3 与 1/ 5, 是影响老年人生
活质量的主要疾病之一。骨质疏松发病机制复杂,
与生活方式、激素分泌代谢和基因遗传等多因素相
关,中医药治疗骨质疏松取得了肯定的临床效果, 目
前含有治疗骨质疏松的有效成分的中药正逐渐成为
临床研究的热点。巴戟天是两种茜草科植物杂交品
种,具有补肾阳、健筋骨的作用,现代研究证实,巴戟
天含有多种有效成分, 如
-蒽醌、甲基-异茜草素、2,
4-二乙基胆固醇、维生素 C、多糖[ 1] 等, 具有抗氧化、
利尿及保护肾脏的作用[ 2] ,具有明显的抗炎止痛作
用,可以治疗关节炎症[ 3] 。在传统医药上,用来健骨
保肾,消肿止痛,治疗骨质疏松及股骨头坏死等骨科
疾病[ 4]。此外, 巴戟天尚有补中益气, 温精升阳作
用,能够治疗胃肠疾病和男科疾病[ 5-6]。动物实验表
明[ 7 ] ,巴戟天具有促进骨质合成, 减少骨溶解的作
用。研究显示,巴戟天用于治疗骨质疏松安全有效,

1513
中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
* 收稿日期: 2009- 12-15





















基金项目:浙江省台州市 A 级课题项目 ( 090114051)作者简介:朱孟勇( 1974
) ,男,浙江台州人,研究生。E-mail: zhum engyong163@ 163. com
* 通讯作者
王彩娇
T el: 13586091878