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ISSR分子标记对金荞麦 8个野生居群的遗传多样性分析
张春平1 ,何 平1* ,何俊星1 ,类淑桐1 , 胡世俊2*
( 11 西南大学生命科学学院 三峡库区生态环境教育部重点实验室, 重庆市三峡库区植物生态与资源重点实验室,
重庆 400715; 21 中国科学院昆明植物研究所,云南 昆明 650204)
摘 要:目的 对野生金荞麦进行遗传多样性研究。方法 通过 ISSR技术对 8 个野生金荞麦居群的共 92 个个体
进行遗传多样性分析。结果 用 12 个随机引物共扩增出 103条清晰条带 ,其中 90 条具多态性, 平均多态性位点比
率为 87. 38% , Neics 基因多样性指数 H = 0. 374 7, Shannon 多样性指数 I= 0. 572 8,遗传分化指数 Gst = 0. 171 8。
遗传距离和遗传一致度分别为: 0. 043 1~ 0. 384 9 和 0. 684 3~ 0. 954 5。结论 金荞麦种内具有较高的遗传多样
性,遗传变异主要存在于居群内部, 遗传多样性与地理关系表现出明显的相关性。ISSR可以作为研究遗传多样性
及遗传分化的有效标记。
关键词:金荞麦; 遗传多样性; ISSR; 聚类分析;遗传分化
中图分类号: R2821 7 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2010) 09-1519-04
ISSRAnalysis on genetic diveristy of Fagopyrumcymosum collected from eight wild populations
ZHANG Chun-ping
1
, HE Ping
1
, HE Jun-x ing
1
, LEI Shu- tong
1
, HU Sh-i jun
2
( 11 Key Labor ator y o f Eco-env ironments of Three Gorges Reserv oir Reg ion, Chongqing Key Labor at or y of P lant Ecolog y and
Resources Research for Three Gorges Reservoir Reg ion, M inistry of Educ-ation, School of L ife Sciences, Southwest University,
Chongqing 400715, China; 21 Kunming Institute of Botany, Chinese Academy o f Sciences, Kunming 650204, China)
Abstract: Objective To discuss the genet ic diversity of Fagopy rum cymosum1 Methods T he genetic
diversity of 92 individuals f rom eight populat ions w ere analyzed by ISSR marker1 Results T w elve primers
w ere selected to produce highly reproducible ISSR bands1 Among 103 amplif ied bands, 90 show ed poly-
morphism, the percentag e of polymorphic bands reached 87. 38%1 Neics gene diversity index ( H ) w as
0. 374 7, Shannon info rmat ion index ( I ) w as 0. 572 8, Gst was 0. 171 81 The genet ic distance coef f icient
and the genetic sim ilar ity w ere 0. 043 1 ~ 0. 384 9 and 0. 684 3 ~ 0. 954 5, respect ively1 Conclusion
F1 cymosum has high genetic diversity and the majo rity of g enet ic variation occur in the populations1 By
cluster analysis, the geog raphical dist ribut ion is very obvious1 The ISSR marker can be used for the
analysis of the genet ic diversity and genet ic variation of F1 cymosum1
Key words: Fagopy r um cymosum ( T rev1 ) Meisn1 ; g enetic diversity; ISSR; cluster analy sis;
genet ic variat ion
金荞麦 Fagop y rum cymosum ( T r ev1 ) Meisn1
亦称野荞麦、天荞麦、红三七, 系蓼科荞麦属植物, 是
中国荞麦属野生种类中分布最广的一种, 大多生长
在海拔 500~ 3 000 m 的林缘、灌木丛、田边道旁及
阴湿瘠薄的山地。在我国, 从大巴山以南到中国南
部均有分布,在重庆市主要分布于万州、南川、涪陵、
黔江地区[ 1] 。金荞麦根茎入药, 具有清热解毒、排脓
祛瘀的功效,主要用于肺脓疡、麻疹肺炎、扁桃体脓
肿等症[ 2-3] 。另外,金荞麦籽粒还具有很高的营养价
值,其蛋白质量丰富,同时还含有具有保健疗效的多
种矿物质元素和维生素,具有软化血管,降低人体血
脂和胆固醇, 防老抗衰的作用[ 4]。目前,对金荞麦的
研究主要集中在化学成分、药理作用和临床应用等
方面[ 5]。赵佐成等 [ 6]采用等位酶技术对中国苦荞麦
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* 收稿日期: 2009- 12-15 基金项目:国家自然科学基金资助项目( 30070080)作者简介:张春平( 1982 ) ) ,男,博士,山东潍坊人,主要从事植物资源学与植物分子生物学方面的研究。
E-mail: ch unpingzh ang520@ 163. com
* 通讯作者 何 平 T el: ( 023) 68254122 E- mail: heping196373@ 126. com
及其近缘种的遗传多样性进行了研究, 但是对金荞
麦遗传多样性未做系统的研究。
ISSR( inter-simple sequence repeat)由 Zietkiew iez
等[ 7]于 1994年创建, 是建立在 PCR反应基础上的
DNA分子标记。近年来, ISSR-PCR已成功用于植物
遗传多样性分析、基因图谱绘制、分子生态学研
究[ 8-15]、品种鉴定和种质资源的遗传多样性研究等领
域[ 16-18]。该技术无需预知受试基因组序列,具有成本
低、操作简单、灵敏性高且重复性好等优点,被认为是
非常理想的分子标记。本实验首次运用 ISSR-PCR
技术对 8个野生金荞麦居群的 92个个体进行分析,
旨在揭示金荞麦的遗传多样性及其遗传结构,了解其
种内变异,为金荞麦这一重要药用资源的保护和育种
奠定理论基础。
1 材料和方法
1. 1 材料: 实验所用材料采自重庆野生金荞麦的主
要分布区南川石河子、黄草坪、北碚缙云山、黔江冯
家镇、正阳镇和酉阳的后溪镇、钟多镇。各居群随机
选取 10~ 12个样本,收集当年生嫩叶, 低温条件下
带回实验室洗净、晾干, 冻于- 80 e 的超低温冰箱
中备用。居群的产地、样本数、编号及居群生长状况
见表 1。
表 1 用于 ISSR 分析的不同居群的金荞麦
Table 1 ISSR Analysis of F1 cymosum in different populations
编号 产 地 样本数 居群状况 编号 产 地 样本数 居群状况
QJFJ 黔江冯家镇 1 12 野生 NCSH 南川石河子 12 野生
QJFZ 黔江冯家镇 2 12 野生 NCHC 南川黄草坪 10 野生
QJZY 黔江正阳镇 12 野生 YYHX 酉阳后溪镇 12 野生
BBJY 北碚缙云山 12 野生 YYZD 酉阳钟多镇 10 野生
1. 2 基因组 DNA 的提取: 本实验中采用改良后的
CT AB法 [ 19]提取金荞麦的基因组 DNA, 所提 DNA
先用 1. 0%的琼脂糖凝胶进行电泳, 染色后拍照, 选
择带型清晰、无拖尾的作为备用,然后再在核酸蛋白
分析仪上测其原始浓度, 最后统一稀释至 40 ng/
LL, 供 ISSR-PCR实验用。
1. 3 ISSR 引物的筛选: ISSR-PCR 反应所用的引
物由上海生工公司合成。共从 78个随机引物中筛
选出 12 个(表 2)扩增条带清晰、多态性明显、反应
稳定的引物用于 8个居群的 92个个体的扩增, 每个
选定的引物至少重复扩增 2次。
1. 4 PCR扩增及产物检测: ISSR-PCR反应在 25 LL
表 2 12 个引物序列
Table 2 Sequence of 12 primers
引物编号 序 列 实际退火温度/ e 引物编号 序 列 实际退火温度/ e
UBC807 ( AG) 8 T 53. 0 UBC834 ( AG) 8YT 57. 5
UBC815 ( CA) 8C 55. 0 UBC840 ( GA) 8YT 53. 5
UBC818 (CA) 8G 55. 0 UBC847 ( GA) 8RC 57. 5
UBC822 ( TC) 8A 52. 5 UBC848 ( CA) 8RG 57. 5
UBC823 ( T C) 8C 54. 5 UBC855 ( CA) 8YT 57. 5
UBC825 ( AG) 8 T 52. 5 UBC866 ( CT C) 6 62. 0
的 PCR反应体系中进行, 内含 1 @ PCR Buffer , 1. 5
mmo l/ L M g
2+
, 200 Lmol/ L dNT P, 0. 3 Lmol/ L 引
物, 40 ng 模板, 1. 0 U T aq DNA 聚合酶。扩增程序
为 94 e 预变性 5 min,然后进行 35个循环: 94 e 变
性 30 s,复性 60 s, 72 e 延伸90 s,循环结束后 72 e
延伸 7 min, 4 e 保存。扩增产物在含 go ldview
( 1% )的1. 5%的琼脂糖凝胶中电泳分离 1. 5 h, 电压
5 V/ cm。用 DL 2000的 DNA marker ( 100~ 2 000
bp)作为标记, 电泳结束后在 Bio-Rad Gel Doc2000
凝胶成像系统下观察并拍照记录。
1. 5 统计分析与数据处理: 每个引物均经过重复扩
增、电泳两次, 选取稳定清晰的条带进行统计分析。
电泳图谱的每条带( DNA 片段)均为一个分子标记,
代表一个引物的结合位点。根据分子标记的迁移率
及有无来统计所有的二元数据, 有带(显性)记为 1,
无带(隐性)记为 0,强带和弱带的赋值均为 1。采用
POPGEN32软件, 计算各居群的多态位点百分率
( PPL)、Neics基因多样性指数( H )、Shannoncs多态
性信息指数( I )、基因分化系数( Gst)、居群总基因多
样性( H t )、居群内基因多样性( H s) , N eics遗传一致
度和遗传距离( D ) ,并根据 Neics遗传距离进行 UP-
GMA聚类分析,构建系统树状图。
2 结果与分析
2. 1 金荞麦的遗传多样性: 通过 12 个引物对金荞
麦 8个居群的 92个个体进行了 ISSR分析,共检测
到位点 103 个, 相对分子质量均在 100~ 2 000 bp
(图 1) , 其中多态性位点 90 个, 占 87. 38%。Neics
基因多样性指数 H = 0. 374 7, Shannoncs多态性信
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息指数 I= 0. 572 8。金荞麦不同群体的多态位点百
分率在 59. 22%~ 73. 79%, 其中最高的是酉阳后溪
镇居群, 为 73. 79% ; 最低的是黔江正阳镇居群, 为
59. 22%。H 范围为 0. 348 7 ~ 0. 397 4, I 范围为
0. 629 2~ 0. 493 2(表 3)。H 和 I 的大小与各居群
多态位点百分率的高低趋势基本一致, 各项系数均
是酉阳后溪镇居群最高, 黔江正阳镇居群最低。
图 1 引物 UBC847 对部分个体的扩增结果
Fig. 1 ISSR Amplified products generated by UBC847
of diff erent F1 cymosum samples
表 3 金荞麦的遗传多样性
Table 3 Genetic diversity of F1 cymosum
居群 个体数 多态位点数 多态位点百分率/% H I
QJF J 12 64 62. 14 0. 352 1 0. 549 4
QJF Z 12 63 61. 17 0. 350 4 0. 523 3
QJZY 12 61 59. 22 0. 348 7 0. 493 2
BBJY 12 70 67. 96 0. 374 9 0. 604 6
NCSH 12 67 65. 05 0. 369 3 0. 580 9
NCHC 10 66 64. 08 0. 367 4 0. 577 3
YYHX 12 76 73. 79 0. 397 4 0. 643 1
YYZD 10 72 69. 90 0. 384 5 0. 629 2
总计 92 103 87. 38 0. 374 7 0. 572 8
2. 2 金荞麦不同居群的遗传分化分析:金荞麦各居
群的 H t为 0. 374 9, H s 为 0. 310 5, 根据 H t 和H s
来计算Gst 为 0. 171 8(表 4)。这表明有 17. 18%的
变异是存在于居群间的, 而 82. 82%的变异是存在于
居群内的。居群的遗传分化表明, 金荞麦居群间的
分化程度较小, 但是金荞麦居群内部却具有高度的
遗传分化。
表 4 金荞麦 8 个居群总的遗传分化
Table 4 Genetic variation among eight
populations of F1 cymosum
引物 H t H s Gst
平均 0. 374 9 0. 310 5 0. 171 8
标准差 0. 014 9 0. 012 1
2. 3 金荞麦居群间的遗传距离和聚类分析: 金荞麦
7个居群的 Neics遗传一致度为 0. 684 3~ 0. 954 5,
D为 0. 043 1~ 0. 384 9(表 5)。其中黔江正阳居群
( QJZY)与南川黄草坪居群( NCSH )之间的遗传距
离最大,为 0. 384 9, 这也表明两者之间的遗传差异
性最大,相似度也是最低的, 为 0. 684 3。黔江冯家
镇的两个居群( QJFJ 和 QJFZ)之间的遗传距离最
近,为 0. 043 1, 同样相似度是最高的,为 0. 954 5。
金荞麦U PGMA 聚类图(图2)显示: 8个野生居
群中黔江冯家镇的两个居群( QJFJ和 QJFZ)首先聚
在一起,这也正说明了两个居群之间的遗传距离最
近,然后又与黔江的正阳镇居群( QJZY)聚在一起,
上述 3个居群间的聚类反映了地理分布上的一致性。
表 5 野生金荞麦 8 个居群遗传一致度(对角线以上)和遗传距离 D(对角线以下)
Table 5 Genetic similarity coefficient (above diagonal) and genetic distance D ( below diagonal) of F1 cymosum
居群 QJFJ QJFZ QJZY BBJY NCSH NCHC YYHX YYZD
QJFJ * * * * 0. 954 5 0. 937 2 0. 754 4 0. 693 1 0. 713 7 0. 852 8 0. 843 7
QJFZ 0. 043 1 * * * * 0. 938 3 0. 756 3 0. 699 4 0. 724 8 0. 863 4 0. 853 7
QJZY 0. 093 7 0. 085 5 * * * * 0. 732 8 0. 684 3 0. 693 6 0. 862 3 0. 872 8
BBJY 0. 274 4 0. 283 1 0. 300 8 * * * * 0. 743 6 0. 755 4 0. 763 3 0. 778 4
NCSH 0. 364 3 0. 352 7 0. 384 9 0. 268 3 * * * * 0. 904 1 0. 784 4 0. 793 9
NCHC 0. 321 4 0. 315 5 0. 358 8 0. 298 1 0. 114 4 * * * * 0. 803 1 0. 824 4
YYHX 0. 238 6 0. 214 7 0. 201 9 0. 253 7 0. 263 2 0. 163 2 * * * * 0. 940 3
YYZD 0. 239 2 0. 835 7 0. 185 9 0. 248 3 0. 272 8 0. 253 3 0. 064 8 * * * *
酉阳的后溪镇( YYHX)和钟多镇( YYZD)两个居群
也聚在一起,然后又与北碚缙云山( BBJY)居群进行
聚类,最后进行聚类的是南川的石河子( NCSH )和
黄草坪( NCHC)两个居群。总的来看, 地理分布相
近的居群都聚在了一起, 聚类结果显示出与地理分
布明显的一致性。
3 讨论
金荞麦物种水平的多态位点百分率 PPB 为
87. 38%, 高于其他草本克隆植物, 如延龄草 [ 20]
( PPB= 34. 07%, H = 0. 033 7) ,这表明金荞麦具有
较高的遗传多样性, 而且遗传多样性不仅存在于居
群间,也存在于居群内。根据 N eics 遗传分化指数
估算的 8个居群间的遗传分化系数为 0. 171 8, 说明
居群间的分子变异只占总的基因多样性的17. 18%,
居群内占 82. 82%。这表明居群内的遗传多样性较
高,居群间的遗传多样性相对较低。遗传分化的分
析结果显示:大量的变异主要存在于金荞麦居群内,
只有少量的变异存在于居群之间。金荞麦居群严格
地按照空间距离之间的联系聚在了一起, 这可能与
共生境有关。地理距离近的居群生境相似,地理距
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图 2 金荞麦 8 个居群的 UPGMA聚类图
Fig. 2 UPGMA Dendrogram of eight pupulations
of F1 cymosums
离远的居群生境差异相对较大。在环境选择压力的
作用下,不同居群之间的分子变异可能与地理位置
联系比较大。张春平等[ 21] 对渝东地区野生金荞麦
的数量分类及排序研究也证实了这个问题。
通过研究表明金荞麦具有相对较高的遗传多样
性,因此造成金荞麦资源减少的主要原因可能不是
其遗传方面的因素,更主要的原因可能是大量而无
节制地采挖和野生金荞麦生境的人为破坏。为切实
保护好金荞麦药用资源, 实现资源的可持续利用, 建
议在人为活动较强的地区,加大宣传力度,有效控制
金荞麦的采挖; 实行就地或迁地活体保存;利用现有
的或新建专用的药用植物种质资源库, 进行种质的
低温保存;保护好野生金荞麦的生长环境,金荞麦喜
光照,因此建议在林外补充实生苗的数量,以扩大野
生居群。在种质资源分布集中的地域, 建立金荞麦
自然保护区(农业部已经在黔江建立了我国目前第
一个/野生金荞麦原生境保护区0) , 禁止破坏性利
用,防止各种人为干扰,充分发挥金荞麦群落的生态
和经济效益。并且可以尝试人为创造居群间的基因
交流和重组的条件, 更好地维持其遗传多样性水平。
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