全 文 ：无需花费大量时间进行摸索测试条件。
致谢:上海高校创新团队建设资金资助。
参考文献:
[ 1] 杨义芳 超高效/高分离及快速/超快速液相色谱在中药及其
制剂研究中的应用[ J]中草药, 2008, 39( 8) : 12591263
[ 2] 杨立伟,郑伟奇,蒋忠军,等 超高效液相色谱法测定西洋参中
人参皂苷Rg1、Re、Rb1 的含量[ J]中药材, 2008, 31( 1) : 5557
[ 3] 李 钦,杜红岩,杜兰英,等 HPLC法测定杜仲雄花和杜仲雄
花茶中京尼平苷酸、绿原酸和京尼平苷[ J] 中草药, 2009, 40
( 1) : 7172
[ 4] 郑虎占,董泽宏,余 靖 中药现代化研究与应用[ M ]北京:
学苑出版社, 1998
[ 5] 李芳东,杜洪岩 杜仲[ M ]北京:中国中医药出版社, 2001
[ 6] 戚友维 杜仲化学成分研究进展[ J]中草药, 1989( 4) : 4244
[ 7] 中国药典[ S]一部 2005
菝葜RAPD扩增条件优化
仇 萍1, 2 ,刘春林1 ,盛孝邦1 * ,黄宇明2 ,张光贤2
( 1 湖南农业大学, 湖南 长沙 410128; 2 怀化正好制药有限公司,湖南 怀化 418000)
摘 要:目的 研究菝葜的 RAPDPCR 扩增体系最适宜的条件。方法 采用 CTAB 提取方法,从菝葜的嫩叶中提
取总基因组 DNA,以此为模板, 优化菝葜 RAPD PCR的反应条件。结果 最适宜的 PCR 扩增体系为:反应体积
30 L , 内含 0 20 mol/ L 引物、200 mo l/ L dNTP、40 ng 模板 DNA、2 U Taq DNA 聚合酶、2 mo l/ L Mg2+ 。结
论 通过扩增条件优化实验,建立了重复性好、稳定性高的药用植物菝葜 RAPDPCR 扩增体系最适宜的条件, 筛
选出条带清晰多态性好的 14 条随机引物, 共扩增得到 144 条电泳带, 其中有多态性带 62 条, 检测到了62 个多态性
位点,多态率为 43%。
关键词:菝葜; RAPD; 条件优化
中图分类号: R286 01 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 11189804
菝葜 Smilax china L 为百合科菝葜属植物,
别名金刚藤、金刚刺、铁菱角、马加勒、筋骨柱子、红
灯果等。在我国 400年前就有菝葜药用的记载, 始
载于 名医别录!。民间称药用菝葜为金刚藤, 其根
茎具有祛风利湿、解毒散瘀的功效,多用于治疗风湿
关节痛、跌打损伤、胃肠炎、痢疾、消化不良、糖尿病、
乳糜尿、白带、癌症等, 其叶外用可治疗疔疮、烫
伤[ 12]。目前市场上以菝葜根茎的提取物为主要组
分的药品有金刚藤糖浆、金刚藤颗粒、金刚藤片、金
刚藤胶囊、三金片、金鸡胶囊等, 主要用于治疗附件
炎和附件炎性包块及妇科多种炎症等, 年销售量达
5~ 10亿元人民币, 是临床上治疗妇科炎症的常用
药品;复方菝葜颗粒则用于治疗癌症。因此, 菝葜的
药用价值很高, 极具开发潜力。
RAPD 技术是 DNA 分子标记技术的一项创
新,可直接反映染色体组 DNA 多态性, 不受环境限
制,具有操作简单快捷、成本低、通用性好、灵敏度
高,且无需预知基因组的相关分子生物学信息等优
点,广泛应用于遗传多样性、生物种群划分、遗传图
谱构建、基因定位等方面的研究 [ 310]。在用 RA PD
技术进行植物种的遗传多样性分析时, 首先要建立
稳定的反应体系, 以确保其结果的可靠性、重复
性[ 1 1]。为此, 本实验就菝葜 RAPD 反应中的模板
DNA 浓度、引物浓度、dNT Ps浓度、Mg 2+ 浓度、Taq
酶用量等因素进行实验,初步建立稳定性好、重复性
高的 RAPD反应体系, 为深入分析菝葜遗传多样性
提供了基础资料。
1 材料与方法
1 1 材料: 根据菝葜的分布情况,于 2005年 5月和
8月分别从金刚藤主产区湖南省芷江、会同、靖州、
雪峰山和鸡公界 5个地区采集。其中材料 1采自芷
江明山下、材料 2~ 4采自会同、材料 5~ 7采自靖州
寨芽、材料 8~ 10采自雪峰山大峰、材料 11~ 15采
自鸡公界。
1 2 主要试剂及仪器
1 2 1 试剂: T aq DNA 聚合酶、15 个随机引物
( Sangon 公司)、10 ∀ Buffer、MgCl2、dNT P、DNA
Ladder M arker、琼脂糖(西班牙分装)。
1 2 2 仪器: 凝胶成像系统 ( Gel DOC 1000, BIO
RAD) ,台式高速冷冻离心机 ( T GL # 16M ) , Smart
∃1898∃ 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
收稿日期: 20100524 作者简介:仇 萍( 1965 # ) ,女,湖南省怀化市人,高级工程师,在读博士,湖南正清制药集团股份有限公司总工程师,长期从事药品的研发、工艺技术及生产管理工作,先后获得新药证书 6个,发明专利 11个,先后获得省科技进步奖,省优秀发明人称号,研究方向为遗传育种。T el : 13973161359 Fax: ( 0731) 88807044 Email: qiu zq@ vip 163 com
* 通讯作者 盛孝邦
Spec TM plus Spectr ophotoMeter ( BIORAD, 美
国) , M DF # U 4086S 型三洋超低温冰箱, 电泳仪
( PT C # 100型)及各种规格电泳槽。
1 3 总 DNA 提取及浓度测定: 提取方法为 CT AB
法。取 1 g 左右的幼嫩叶片, 吸干水分放入预冷的
研钵(研钵置于冰上) , 加入 PVP 及石英砂, 再加入
液氮反复研磨至冻粉状。迅速转入 5 mL 离心管
中,加入 4 mL CT AB( 65 % 预热)及 100 L 2巯基
乙醇,混匀后于 65 % 水浴 1 h(期间轻摇数次)。吸
上清液,加入等体积的抽提液氯仿异戊醇( 24& 1) ,
10 000 ∀ g 离心 10 m in,再吸上清液加入抽提液反复
离心,直至上清液较为透亮。在上清液中加入1/ 10体
积的乙酸钠, 2倍体积的 4 % 无水乙醇, 立即有白色
絮状物出现。用吸头将絮状物吸到 1 mL 离心管
中,加入 4 % 无水乙醇离心漂洗 2次, 倒掉乙醇, 置
于室温下风干至半透明。加入 100 L T E 溶解
DNA。取 1 L DNA 样品稀释 25 倍, 在 Smart
Spec TM plus Spect ropho toMeter 上测定浓度、260
nm及 280 nm处的吸光度值和 A 260 / A280的值。
1 4 RAPD反应体系的初步优化
1 4 1 RAPD主要成分用量的优化: 参照汪小全
等[ 1 2]的方法, RA PD 反应体系的 5 种主要成分引
物、dNTP 的用量、DNA 模板、T aq DNA 聚合酶、
Mg
2+ 设置 6 个浓度梯度(表 1)。以引物 S12 ( 5∋
CCTT GA CGCA3∋)和菝葜基因组 DNA 为模板进
行 RAPD反应体系的单因素优化实验。当进行某
一因素水平实验时, 其他因素均固定在第 3个浓度
梯度,所有反应体系均为 30 L。
1 4 2 引物的筛选:根据已知的具有有效扩增产物
的随机引物,选出了 15条随机引物对菝葜进行扩增
(表 2) ,筛选出扩增效果好、多态性高的引物用于分
子标记分析。
表 1 RAPD反应体系中 5 种成分用量
Table 1 Different amounts of five components
used in RAPD reaction system
因 素 水 平
1 2 3 4 5 6
引物/ (mol∃ L- 1) 0 05 0 10 0 20 0 30 0 40 0 50
dNT P/ ( mm ol∃ L- 1 ) 0 10 0 13 0 16 0 20 0 23 0 26
模板 DNA/ ng 10 20 30 40 50 60
T aq酶/ U 0 50 1 00 1 50 2 00 2 50 3 00
Mg2+ / ( mmol∃ L- 1) 1 00 1 50 2 00 2 50 3 00 3 50
表 2 引物及序列
Table 2 Primers and sequences
引物 序 列 引物 序 列 引物 序 列
S3 5∋CATCCCCCTG3∋ S25 5∋AGGGGTCT T G3∋ S48 5∋GTGT GCCCCA3∋
S5 5∋TGCGCCCT TC3∋ S28 5∋GT GACGT AGG3∋ S52 5∋CACCGT ATCC3∋
S7 5∋GGT GACGCAG3∋ S34 5∋T CT GT GCTGG3∋ S59 5∋CT GGGGACT T3∋
S12 5∋CCTT GACGCA3∋ S36 5∋AGCCAGCGAA3∋ S67 5∋GTCCCGACGA3∋
S17 5∋AGGGAACGAG3∋ S41 5∋ACCGCGAAGG3∋ S75 5∋GACGGAT CAG3∋
1 4 3 PCR 扩增程序及参数: PCR扩增体系为 30
L, 其中 dNT P、模板 DNA、引物、聚合酶和 MgCl2
按优化筛选结果取量。在 PT C # 100 型 PCR 仪上
进行扩增,于 94 % 预变性 3 min, 94 % 变性 50 s, 35
% 退火50 s, 72 % 延伸1 min, 共39个循环, 72 % 延
伸 10 min。扩增产物在 1 9%琼脂糖凝胶上电泳
(含 0 5 mg/ L 的溴化乙锭) , 进胶电压 120 V, 电泳
电压 85 V, 电泳 4 ~ 5 h 后, 取出凝胶板, 在 Gel
DOC1000凝胶分析系统上进行信息采集、处理、分
析、保存和结果输出。
2 结果与分析
2 1 RAPD反应体系主要成分的优化
2 1 1 引物浓度的筛选结果:引物浓度变化对菝葜
RAPD反应结果存在影响(图 1A)。从图中可以看
出,总的趋势是随引物浓度增加,扩增带的数量与亮
度也增加。当引物浓度水平小于 0 05 mol/ L ( 1
泳道)时, 扩增带数量少、亮度弱, 扩增效果不理想。
当引物水平由 0 1 mol/ L 逐渐升高时, 扩增效果
明显改善,扩增带的数量和亮度明显增加。引物浓
度达到或大于 0 2 mol/ L 时, 带的数量和亮度趋
于稳定一致。在此范围内,引物水平的不同对扩展
结果的影响不明显。从扩增效果和节省开支两方面
考虑,引物浓度以 0 2 mol/ L 为宜。
2 1 2 dNTP 水平的筛选结果: 图 1B 为不同
dNTP 浓度对菝葜 RAPD反应结果的影响。dNTP
( dAT P、dGT P、dCTP、dT TP)是 DNA 合成的底物,
当 dNTP 的浓度为 100 mo l/ L ( 1泳道)时, 扩增强
度不够,谱带少而且暗,说明被扩增的片段和扩增量
均较少,随着 dNT P 浓度的逐渐增加, 扩增强度和
背景均逐渐加强, 到 dNTP 为 200 mol/ L ( 4泳道)
时达到峰值。其后,随 dNT P 浓度水平的继续升高
( 4~ 6泳道) ,扩增带数、带型和带的明暗程度变化
不大,出现所谓的平台效应。根据这一实验结果,选
择 200 mol/ L 的浓度水平作为正式扩增条件。
∃1899∃中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
2 1 3 T aq DNA 聚合酶水平的筛选结果: 图 1C
为不同水平的 T aq DNA 聚合酶对 RA PDPCR 反
应结果的影响。从图中可以看出, Taq DNA 聚合酶
对 RAPDPCR反应结果的影响比较明显。当每个
反应的 Taq DNA聚合酶的用量低于 1 5 U 时( 4~
6泳道) ,扩增效果较差,主要表现为带弱; 当 T aq 酶
为 2、2 5 U 时( 2、3泳道) ,扩增效果较好; T aq 酶达
到 3 U 时 ( 1 泳道) , 带型则出现模糊现象。因此,
Taq DNA 聚合酶的用量以 2 U 为宜。
2 1 4 模板 DNA 水平的筛选结果: 图 1D为不同
水平的模板 DNA 对 RAPDPCR扩增结果的影响。
从图中可以看出, 模板 DNA 对扩增反应的结果影
响相对较大, 当模板 DNA 为 5~ 10 ng 时( 1、2 泳
道) ,扩增产物少且带型模糊; 而从 30~ 60 ng( 3~ 6
泳道)均能获得较理想的扩增效果。因此,选择模板
DNA 的最适水平为 40 ng。
2 1 5 Mg2+ 浓度的筛选结果:图 1E 为不同水平
的 Mg2+ 对 RAPDPCR扩增结果的影响。Mg2+ 主
要通过影响 T aq DNA 聚合酶的活性从而间接影响
RA PDPCR扩增, 因为 T aq DNA 聚合酶是镁依赖
性酶。在反应过程中, Taq DNA 聚合酶需要游离的
Mg2+ 。从本实验可以看出: Mg 2+ 用量低于 1 5
mo l/ L ( 1、2泳道)时, PCR的效果不好, 扩增片段
和扩增强度都不够; M g2+ 以 2~ 3 mol/ L ( 3~ 5泳
道)为宜。
综合上述因素对 RA PD反应体系的影响,最后
M分子量 Mark er; 1~ 6分别为不同水平
MM ark er; 1- 6dif ferent level
图 1 RAPD扩增结果
Fig 1 RAPD Amplification results
确定反应体系为: 引物浓度为 0 20 mol/ L , dNT P
为200 mo l/ L , T aq DNA 聚合酶为 2 U ,模板 DNA
为 40 ng , M g2+ 为 2 mo l/ L。
2 2 引物筛选的结果:图 2为引物筛选的电泳结果
图。从图中可以看出, S36 引物无任何扩增产物和
扩增带,其他的 14个引物或多或少都有扩增产物和
扩增带。这 14个随机引物是 S3、S5、S7、S12、S17、
S25、S28、S34、S41、S48、S52、S59、S67和 S75。其序
列和编号见表 2。选择 14个引物对供试材料进行
正式扩增是为了使实验结果更为客观准确, 因为引
物的数目对种类鉴定和亲缘关系分析的结果有一定
的影响[ 13]。目前普遍认为,采用 RA PD分析植物的
亲缘关系时,引物的数目最好多于 12条;所以,筛选
14个引物对供试材料进行正式扩增。
2 3 菝葜材料 RAPD扩增结果: 将筛选出的 14条
随机引物( 10 bp)对供试的 15个材料进行正式扩增
(每个扩增反应均重复一次) , 扩增产物电泳后得到
了菝葜材料基因组 DNA 的指纹图谱 (图 3 显示部
分电泳结果)。这 14条引物共扩增得到 144条电泳
带,其中有多态性带 62条,检测到了 62个多态性位
点,多态性条带比率为 43%。
图 2 引物筛选结果
Fig 2 Screen results of primers
M分子量 Mark er; 2~ 15菝葜材料
MMark er; 2- 15marterials of S china
图 3 S3 引物对菝葜的 RAPD扩增结果
Fig 3 RAPD Amplification results
of S3 primer on S. china
∃1900∃ 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
3 讨论
RAPD反应条件严格, 由实验结果可知,引物、
dNT P、模板 DNA、Taq DNA 聚合酶、Mg2+ 等因素
的变化都会对 RA PD图谱产生一定的影响,从而影
响 RAPD分析的准确性。
RAPD标记进行遗传多样性分析的前提条件就
是首先要保证 RAPD 带谱的准确性和稳定性。为
获得重复性和稳定性较高的 RAPD 带谱,在进行某
一物种的 RAPD分析前,筛选最适宜的RAPD条件
是很必要的[ 14]。虽然 RAPD反应涉及到诸多因素,
但通过严格控制反应条件, 尽量保证所有反应在同
一反应体系下完成, 如使用同一厂家相同批号的
Taq DNA 聚合酶,采用相同的扩增程序, 就能获得
重复性好、稳定性高的结果[ 15]。
通过扩增条件优化实验, 建立了药用植物菝葜
RAPDPCR扩增体系最适宜的条件, 即反应体积
30 L,内含 0 20 mo l/ L 引物、200 mo l/ L dNT P、
40 ng 模板 DNA、2 U T aq DNA 聚合酶、2 mol/ L
Mg 2+ ;而且筛选出条带清晰多态性好的 14 条随机
引物,共扩增得到 144 条电泳带, 其中有多态性带
62条, 检测到了 62个多态性位点, 多态率为 43%。
为进一步进行菝葜种质资源的 RA PD分析及其亲
缘关系、遗传多样性研究提供了可靠的实验方法。
参考文献:
[ 1] 中国中医药研究院中药所,全国中草药名鉴[ M ]北京:人民
卫生出版社, 1996
[ 2] 曾晓霞,陈锡林 菝葜传统应用和现代研究概况[ J]中草药,
2008, 39( 6) : 952953
[ 3] 王慧中,卢江杰,施农农, 等 利用 RAPD分析 13 种石斛属
植物的遗传多样性和亲缘关系[ J ]中草药, 2006, 37( 4) : 588
592
[ 4] 曹雅男,李庆章,孙 岳,等 正品龙胆遗传多样性的 RAPD
及 ISSR 分析[ J]中草药, 2005, 36( 1) : 100103
[ 5] 丁 平,刘 瑾,仰铁锤,等 巴戟天遗传多样性的 RAPD 研
究[ J]中草药, 2008, 39( 12) : 18691872
[ 6] 白 音,包英华,王文全,等 不同居群美花石斛种质资源的
RAPD 分析[ J]中草药, 2007, 38( 5) : 748751
[ 7] Brau ner S, Craw ford D J, Stuessy T F Rib osomal DNA and
RAPD variation in the rare plant fam ily Lactoridaceae [ J ]
A mer J Bot , 1992. 79: 1 436
[ 8] Buren R V, Anders en W R, H arper K T , et al Evaluation
the relat ionship of autumn but tercu p ( Ram unculus acri
form isvar aest ivalis) to s ome close congen ers using rand om
am plif ied polym orphic DNA [ J] A mer J B ot , 1994. , 81:
514519
[ 9] 魏 伟,王洪新,胡志昂,等 毛乌素沙地柠条群体分子生态
学初步研究: DAPD证据[ J]生态学报, 1999, 19( 1) : 1622
[ 10] 林 菲,李进斌,李成云,等 利用 RAPD分子标记定位 2 个
水舶舶瘟病菌非致病性基因[ J ]中国农业科学, 2002, 35( 9 ) :
10791084
[ 11] 孙丽娜,严一字,吴基日 桔梗 RAPD 反应体系的优化[ J ]
广西植物, 2007, 27( 5) : 410413
[ 12] 汪小全,邹喻苹,张大明 应用遗传多样性和系统学研究中的
问题[ J]植物学报, 1996, 38( 12) : 954962
[ 13] Packer C, Gilbert D A, Pusey A E, et al A molecular genet
ic analysi s of k inship of cooperat ion in Africa Lion s [ J ]
N atur e, 1991, 351: 562565
[ 14] 李钧敏,金则新,柯世省,等 濒危植物七子花 RAPD条件的
优化[ J]植物学通报, 19( 4) : 452456
[ 15] 邹喻苹,葛 颂,王晓东 系统与进化植物学中的分子标记
[ M ]北京:科学出版社, 2001
基于淫羊藿苷测定及HPLC指纹图谱分析的淫羊藿药材质量差异评价
张 萍1 ,孔维军1, 2 ,鄢 丹1 , 王晶彬1 , 任永申1, 2 ,赵艳玲1 ,肖小河1 * , 周 旭1
( 1 解放军 302医院全军中药研究所 北京 100039; 2 成都中医药大学药学院, 四川 成都 611137)
摘 要:目的 建立客观评价淫羊藿药材质量差异的方法。方法 采用高效液相色谱法, Kromasil C18柱( 250 mm ∀
4 6 mm, 5m) ,流动相为乙腈水( 23& 77) , 体积流量 1 mL/ min,检测波长 270 nm,进样量10L ,建立不同产地、不
同品种淫羊藿药材不同生长部位(茎与叶)的 H PLC 指纹图谱,并测定其不同生长部位中淫羊藿苷的量。结果 淫
羊藿药材不同生长部位(茎与叶)的 H PLC 指纹图谱和淫羊藿苷的量存在差异, 从其叶和茎的特征指纹图谱中分别
提取出 19 和 10个共有峰,且叶中淫羊藿苷的量是茎中的 4~ 8 倍;叶与叶、茎与茎之间的化学特征存在差异,叶与
茎化学特征差异最显著。结论 建立的淫羊藿苷测定方法和指纹图谱的精密度、稳定性、重现性好, 可表征淫羊藿
药材质量的差异性,为淫羊藿药材的质量研究和建立淫羊藿药材的商品规格提供参考依据。
关键词:淫羊藿; 淫羊藿苷;成分; 指纹图谱;质量评价
中图分类号: R282 7 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 11190104
淫羊藿是多年生的草本植物,包括小檗科植物 箭叶 淫 羊 藿 Ep imed ium sag it tatum ( Sieb et
∃1901∃中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
收稿日期: 20100221 基金项目:军队中医药研发推广重点项目( 200623001) ;国家杰出青年科学基金项目( 30625042 ) ;国家重大新药创制关键技术 ( 2009zx09502
022)作者简介:张 萍( 1978 # ) ,女,山东菏泽人,硕士,中药学专业。T el : ( 010) 66933325 Email: zh p1231@ 126 com
* 通讯作者 肖小河 T el: ( 010) 66933322 Email: pharmacy302@ 126 com