全 文 ：吴茱萸 RAPD体系构建及道地性遗传背景研究
曹 亮1 ,李顺祥1, 2 ,魏宝阳3 ,黄 丹1 , 徐 菲1 , 佟志远1
( 1 湖南中医药大学药学院 中药现代化重点实验室, 湖南 长沙 410208; 2 湖南中医药研究院中药研究所,
湖南 长沙 410013; 3 湖南农业大学生物科学技术学院, 湖南 长沙 410128)
摘 要:目的 建立吴茱萸的 RAPD 分子标记技术并对吴茱萸的道地性遗传背景进行探讨。方法 应用试剂盒法
提取吴茱萸基因组 DNA; 筛选 RAPD 引物;对全国 3 个省市 5 个吴茱萸产区采取的 48 份样品进行 RAPD 分子标
记, 应用 NTSYS-PC 软件进行聚类分析。结果 获得了吴茱萸的 RAPD分子标记方法; 通过对 RAPD 扩增结果进
行聚类分析, 发现不同品种吴茱萸差异较大,浏阳地区的吴茱萸和其他石虎品种在相似度系数为 0 68 时聚集为两
个类群;而同一品种的石虎遗传背景差异明显,在相似度系数为 0 78 时,铜仁、浏阳、建德、温州的样品各自聚集在
相同地域的族群。结论 吴茱萸遗传背景差异明显, RAPD 技术是一种可用于吴茱萸道地性遗传背景分析的有效
手段。
关键词: 吴茱萸药材; RAPD; DNA ;道地药材
中图分类号: R284 1 文献标识码: A 文章编号: 0253- 2670( 2010) 06- 0975- 04
Optimizing RAPD reaction system and authentic genuineness related genetic
background of Fructus Evodia
CAO Liang 1 , LI Shun-x iang1, 2 , WEI Bao-yang1 , HU ANG Dan2 , XU Fei1 , T ONG Zh-i yuan1
( 1 Key Labo rato ry of Modernization of Chinese Mater ia Medica, Colleg e of Pharmacy , H unan Univer sity o f T r adit ional
Chinese Medicine, Chang sha 410208, China; 2 H unan Academy of T r aditional Chinese Medicine, Changsha 410013,
China; 3 College o f Bioscience and Technolo gy , H unan Agr icultural Univer sity, Changsha 410128, China)
Abstract: Objective T o establish mo lecular marker method of RAPD and to pr obe into the genet ic
background of Fr uctus E vodia Methods Genom ic DNA of Fr uctus Ev od ia was ex tr acted by the DNA
extraction kit method and then chose the RAPD pr imer; RAPD Analysis on 48 individuals of F ructus E vo-
dia from three pr ovinces have been done The NTSYS-PC sof tw are w as used to do cluster analysis Results
RA PD Analy sis method w as optim ized fo r Fr uctus Evodia. RAPD Cluster analysis revealed that variety in
dif ferent kinds of F ructus Evodia was signif icant E vodia r utaecarp a f rom Liuyang and E rutaecarp a
var of f i cinali s f rom other places gathered in tw o populat ions at the similarity coeff icient o f 0 68 In the
sim ilar ity coeff icient of 0 78, the samples f rom Tongr en, L iuyang , Jiande, and Wenzhou gathered in clus-
ter s, the same as their region ethnic g roups, respect iv ely Conclusion Genet ic background of Fructus
E vodia f rom varies of regions is obviously differ ent and RAPD analysis is a good manner to pr obe geo-
authent ic cr ude drug Fr uctus Ev odia
Key words: F ructus Evodia; RAPD; DNA; geo-authent ic crude drugs
吴茱萸为芸香科植物, 始载于神农本草经,列
为中品,性热,味辛、苦;有小毒。具温中散寒、理气
止痛、降逆止呕、助阳止泻的功效。吴茱萸果实中含
挥发油、脂肪酸、生物碱等多种化学成分。临床用于
治疗偏头痛、湿疹、高血压、溃疡性口腔炎、消化不良
等。吴茱萸主产贵州、湖南、浙江等省,主要有 3 个
品种,吴茱萸 Evodia rutaecarp a ( Juss ) Benth、
疏毛吴茱萸 E r utaecar pa ( Juss ) Benth var
bodinier i ( Dode) Huang 和石虎 E rutaecarp a
( Juss ) Benth var of f i cinali s ( Dode) H uang。
975中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 6 期 2010年 6月
收稿日期: 2009-10-12 基金项目:国家 十一五科技支撑计划课题 ( 2006BAI09B02) ; 国家自然科学基金资助项目 ( 30973877) ; 湖南省科学技术厅科技项目
( 2008SK3087)作者简介:曹 亮( 1985 ) ,男,在读硕士研究生,研究方向为天然药物资源、分子生药学。 E-mail: caoliang520945@ 126 com
* 通讯作者 李顺祥 Tel: ( 0731) 88458229 88807173 E-mail: lis hunxg@ yahoo com cn
其中石虎和疏毛吴茱萸合称小花吴萸, 吴茱萸称大
花吴萸。应用 RAPD 技术[ 1] 进行遗传背景的研究
已经非常普遍 [ 2~ 4] , 并可见将该技术应用于道地药
材的初步研究 [ 5, 6]。本实验拟建立和改进吴茱萸的
RA PD反应体系,并对全国低纬度 3 省 5 个地区的
吴茱萸进行遗传背景研究,并探讨了各产区间与产
区内吴茱萸道地性相关的遗传背景差异。
1 材料、仪器与试剂
1 1 材料:吴茱萸于 2008年 6月采集于贵州铜仁、
湖南新晃、湖南浏阳、浙江建德、浙江温州, 用随机采
集方法获取样品, 采集部位为枝端嫩叶,样品经湖南
省中医药研究院中药研究所谢昭明研究员鉴定为石
虎 E r utaecar pa ( Juss ) Benth var of f i cinali s
( Dode) Huang 和吴茱萸 E r utaecar pa ( Juss )
Benth ,分别标号, - 80 超低温冰箱保存,样品采
集情况见表 1。
表 1 材料采集情况
Table 1 Materials acquisition list
植物名 产 地 编 号 海拔范围/ m
石虎 贵州铜仁 TR1~ TR5 662~ 672
石虎 湖南新晃 XH 1~ XH 2 417~ 454
吴茱萸 湖南浏阳 L Y1~ LY10 105~ 115
石虎 湖南浏阳 L Y11~ LY18 105~ 115
石虎 浙江建德 JD1~ JD4 51~ 57
石虎 浙江温州 WZ1~ WZ19 80~ 273
1 2 仪器: PCR仪( T Gradient T hermoblo ck, B-i
ometra) ;超低温冰箱( U 410 U lt ra low temperature
f reezer, Pr em ium ) ; 高速冷冻离心机 ( D 78532
T ut t ling en, het t ich zentrifug en, M ikr o 22R) ; 高温
灭菌锅( HVE 50, H IRAYAMA) ;超纯水系统; PL
5124 Purelab Plus U V/ UF PALL; 凝胶成像系统
( Gel Doc 1000 Sing le, Wavelength M in-i T ransillu-
minator , BIO-RAD, Hercules, CA, U SA)。
1 3 试剂: RAPD随机引物在上海捷瑞生物工程有
限公司合成; Taq DNA Po lymerase, 100 bp ladder,
dNTP,植物 DNA快速提取试剂盒购自天根生化科
技(北京)有限公司: 琼脂糖为 BIOWEST AGAR-
OSE,其他试剂均为国产分析纯。
2 方法
2 1 吴茱萸基因组 DNA 的提取: 利用天根生化科
技有限公司的植物 DNA快速提取试剂盒提取基因
组 DNA, 并稍加改进。将 GP1(提取缓冲液) 700 L
加入到约 0 05 g 液氮研磨粉中, 水浴 40 min,然后
用酚-三氯甲烷-异戊醇 ( 25 24 1) 20 14 000
r/ min 10 m in 抽提一次, 再用三氯甲烷-异戊醇
( 24 1) 20 14 000 r/ m in 10 min抽提,吸取上清,
用 GP2溶液混合,然后按试剂盒操作,并用 100 L
TE 洗脱,加入 3 U RNase A,置室温 30 m in, - 20
保存样品。
2 2 RAPD引物筛选: 对初始 66条 RA PD引物进
行 PCR 扩增, 反应体系: Sterile deionized w ater
19 5 L; 10 PCR Buf fer (含 20 mmol/ L M g2+ )
2 5 L; 10 mmol/ L dNT P 0 5 L; 10 pmol/ L
Primer 1 0 L; T aq DNA Polymer ase ( 2 5 U /L)
0 5 L; DNA 模板 1 0 L; 总体积 25 L。反应程
序: 94 、3 min; ( 94 、30 s, 36 、50 s, 72 、90
s) ( 40个循环) , 72 延伸 8 m in。16 保温。扩增
产物取 6 L 上样, marker 为 100 ladder, 经 2 5%
琼脂糖凝胶电泳, 在凝胶成像系统上拍照, 观察, 选
择带型分布均匀,条带清晰,多态性较好的引物进行
道地性遗传背景分析。
2 3 道地产区吴茱萸遗传多样性分析
2 3 1 RAPD遗传多样性分析: 用选择的引物对
48份不同产地共两个品种的吴茱萸进行 RAPD 扩
增,电泳检测,得到各引物的多态性图谱。
2 3 2 数据分析: 记录凝胶图谱上 100~ 2 500 bp
DNA 条带的有或无, 条带清晰可辨的记为 1,缺失
或模糊不清的记为 0,将观察的结果以 Excel形式
输入计算机,用 NT SYS-pc 2 0软件进行数据转换,
得到 NT S 数据表, 用 similarity 项下的 qualitat iv e
data按 SM 进行数据计算,所得数据表再在 cluste-
r ing 项下按加权配对法( UPGMA)进行 SAHN 聚
类分析。
3 结果与分析
3 1 RAPD引物筛选:对 66条引物进行筛选,从中选
择了 8条引物用于吴茱萸遗传背景的研究。见表2。
表 2 用于吴茱萸多态分析的引物
Table 2 Primers used for polymorphic
analysis of Fructus Evodia
编号 引物名称 序 列 主带数
29 S85 5CTGAGACGGA3 10
30 S119 5CT GACCAGCC3 8
36 S157 5CT ACTGCCGT3 9
38 S193 5GT CGTT CCT G3 8
40 S324 5AGGCTGT GCT 3 9
41 S325 5TCCCATGCT G3 9
44 S351 5ACTCCT GCGA3 10
56 S380 5GTGT CGCGAG3 5
32 RAPD多态性分析: 通过应用 8条引物进行扩
增,获得了谱带清晰, 多态性良好的图谱,其中 41号
引物的部分扩增效果见图 1。8条引物扩增的条带共
976 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 6 期 2010年 6月
68条,其中多态性的条带 47条,多态性达 68 1%。
通过应用ntsys-pc 2 0版遗传分析软件,进行聚类分
析,得到样品的遗传聚类分析结果见图 2。
图 1 44号引物扩增 TR1~ 5、WZ1~ 19 号样品的效果
Fig 1 Results of samples TR1- 5 and WZ1- 19
amplified by 44th Primer
相似度系数
图 2 吴茱萸 RAPD聚类分析
Fig 2 RAPD Clustering analysis of Fructus Evodia
聚类后发现不同吴茱萸品种间差异能明显区
分,浏阳的吴茱萸 ( LY1-10 号) 在相似度系数为
0 68时与其他石虎样品聚在不同的两类, 品种不
同,遗传背景差异最大。在相似度系数为 0 70时温
州( WZ)石虎与建德( JD)、新晃( XH )、浏阳( LY11-
18号)的石虎、铜仁( T R)的石虎聚集为两个类群,
温州的石虎和其余地区的石虎遗传背景差异较大;
在 0 73的水平上, 建德、新晃和浏阳的石虎聚为一
类与铜仁( T R)石虎可以区分开,即铜仁地区与其余
3个地区石虎差异明显; 在 0 76的水平上, 建德石
虎、新晃浏阳石虎、铜仁石虎、温州石虎、浏阳吴茱萸
聚集为 5个类群, 除新晃外各地的吴茱萸品种能按
地区不同聚集在一起(在 0 92 时, 新晃与浏阳的石
虎可区分开) ,可见各地区吴茱萸遗传背景差异较明
显,而 RAPD技术能对此进行区分。同产区同品种
内部差异不一致, 浏阳、建德地区差异很小,如浏阳
石虎在 0 94的水平,吴茱萸在 0 97的水平;但铜仁
和温州样品遗传背景地区内差异比较大, 都约为
0 79,温州样品遗传背景最为复杂。由聚类图可知,
在 0 84水平上,可分为 8个不同的小类,差异显著。
铜仁 5号( TR 5 )与温州 2 号( WZ2)在 0 78 的水平
时聚为一类, 与温州其他样品差异较大, 推测 T R5
和WZ2为石虎变种。
4 讨论
吴茱萸药材其原植物来源主要有 3个品种, 但变
种及易混品较多, 单从植物形态较难鉴别, 而通过其
遗传背景差异的分析,可以明显区分不同品种甚至变
种。可见 RAPD技术可以用于不同品种来源的吴茱
萸药材的鉴别。不同品种的吴茱萸其遗传背景差异
较大,这可能导致药材质量的差别, 实践生产中也证
实小花吴萸即石虎的果实药效比大花吴萸即吴茱萸
的果实好。可见通过应用 RAPD分子标记技术选择
品种,有助于道地药材品种控制和规范化种植。
从聚类分析结果可知吴茱萸同一品种(石虎)地
区间的差异大而地区内的差异为次,即不同地区吴
茱萸在遗传本质上存在较为明显的差异, 且贵州铜
仁道地产区遗传背景与其他地区存在明显差异, 可
见不同生境对吴茱萸的遗传特性影响较大。浙江温
州的样品生长于临海山地多风的环境, 海拔起伏较
大,个体遗传背景差异较大,推测小环境对石虎植株
的遗传特性的影响不能忽视。RAPD技术可有效对
各产区的遗传背景进行区分, 并能区分道地产区与
非道地产区的样品,对于药材道地性的鉴别研究有
一定参考价值。
铜仁作为公认的吴茱萸道地产区, 栽培历史悠
久,遗传多样性很丰富,这一方面能提供丰富的基因
型,有利于种群的遗传稳定性,可能产生更多高产高
效的变异植株; 另一方面, 遗传背景差异太大, 对于
种质资源的控制可能更加复杂。铜仁产吴茱萸药材
药效甚良,被广泛接受为道地药材,而遗传背景差异
较大,个体变异丰富;温州地区的样品遗传背景差异
也较大,变种较多; 湖南浏阳种植基地的吴茱萸, 虽
两品种之间的遗传背景差异较大, 但种内的差异小,
品种稳定,因此可从这 3个地区遗传差异和药用价
值出发,结合药材有效成分、遗传特性和生境等指
标,对铜仁、浏阳、温州地区进行对比研究,获得吴茱
萸道地性的全面系统的评价和检测方法, 为吴茱萸
的规范化种植及合理区划提供科学依据。
致谢:实验于 2008年在湖南农业大学作物基因
工程省重点实验室进行, 陈信波教授和周小云副研
究员给予指导。
参考文献:
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佛手和属间药用植物的主成分聚类分析及 HPLC指纹图谱研究
崔红花1, 2 ,郭 娇2 ,高幼衡1 ,沈志滨2 ,陈 超2
( 1 广州中医药大学 中药化学教研室,广东 广州 510405; 2 广东药学院中药学院, 广东 广州 510006)
摘 要: 目的 研究佛手及属间药用植物化橘红、广陈皮的亲缘关系, 同时建立了 H PLC 指纹图谱。方法 运用
H PLC 法对佛手同属的 3 种药用植物进行测定,对其进行主成分分析及聚类分析, 实现了预分类, 制定了原料药材
的选择方法。结果 测定了样本的 H PLC 的色谱峰, 从获得的17 个不同产地的佛手药材的 H PLC 指纹图谱比较,
结果从检测出 17个分离度良好的共有指纹峰可以看出它们之间的相似性良好, 说明佛手这一植物所含的化学成
分分布及比例较稳定; 使用 SPSS 分析软件, 采用欧氏距离进行聚类分析, 样品的聚类结果理想, 19个样本可聚为 8
类, 即样本 1、7~ 10和 15 处于一类,样本 2和 3处于一类, 样本 4、14、16 和 17 处于一类, 样本 5、6和 11 处于一类,
样本 12和样本 13 分别单独处于一类, 而同属药用植物化橘红(样本 18)和广陈皮(样本 19)分别单独处于一类 ,可
较明显地与佛手样品区分。结论 将佛手及其属间 3种药用植物的中药指纹图谱及主成分聚类分析相结合, 丰富
了中药鉴定的理论内容。
关键词: 佛手;主成分聚类分析; 指纹图谱
中图分类号: R284 1 文献标识码: A 文章编号: 0253- 2670( 2010) 06- 0978- 07
Principal component cluster analysis for Citrus medica var sarcodactylia fruits
and fingerprint identification of medicinal plants in Citrus L
CUI Hong-hua1, 2 , GUO Jiao 2 , GAO You-heng2 , SHEN Zh-i bin2 , CHEN Chao2
( 1 Depar tment o f Phyt ochemist ry, Guangzhou University of T raditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China;
2 Colleg e of Chinese Mater ia Medica, Guangdong Pharmaceut ical Univ ersity , Guangzhou 510006, China)
Abstract: Objective To compare the aff iliat ion of Citr us g randis var tomentosa f ruit s and C r eti cu-
lata, and establish HPLC fingerprint Methods C medica var sarcod acty lia f ruits and three medicinal
plants in Cit rus L. w er e measured by HPLC method, w hich can be used to car ry out principal component
analy sis and cluster analysis of the pr e-classificat ion o f medicinal raw materials, and develope an init ial
method of selection Results T he HPLC chr omatogr aphic peaks of C. med ica var. sar codacty l ia and its
adulterants w ere determined so as to obtain HPLC finger print comparison on C. medica var. sar codacty l is
f ruit s and its adulterants from 17 differ ent habitats The similarity betw een them show ed a good descrip-
t ion of chemical dist ribut ion in this plant and stable proport ion By using the SPSS analysis so ftw are and
Euclidean distance cluster analysis, sample clustering results w ere satisfacto ry Nineteen samples can be
clustered into eight categories, namely 1, 7- 10, and 15 samples in a class, the samples 2 and 3 in a class,
samples 4, 14, 16, and 17 in a class, samples 5, 6, and 11 are in a class, the samples 12 and 13 alone in a
class, adulterants C gr andis var. tomentosa ( sample 18) and C. r eti culata ( sample 19) lef t alone in a
class, respect ively. So it can be mo re obvious dist inct ion betw een samples o f C medica var. sarcod aty lia
f ruit s Conclusion T he Chinese materia medica ( CMM) f ingerprint of C med ica var. sar codaty lia fr uit s
978 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 6 期 2010年 6月
收稿日期: 2009-10-22 基金项目:国家 十五重大科技专项 创新药物和中药现代化资助项目( 2001BA701A38) ;广东省科技厅重点项目( 2004B33001010)作者简介:崔红花( 1976 ) ,女,讲师,博士,研究方向为中药及中药制剂的分析研究与资源开发。
Tel: 13710768642 E- mail : honghuacui@ 163 com
* 通讯作者 高幼衡 Tel: ( 020) 39358083 E-m ail: gaoyouheng@ yah oo com cn