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葎草酮对人胃癌细胞 SGC7901 N乙酰基转移酶 1活性
及基因表达的抑制作用
高世勇1, 2 ,郎 朗1, 2 ,邹 翔1, 2 ,汲晨锋1, 2 ,季宇彬1, 2 , 马 强1, 2 , 岳 磊1, 2 ,曲中原1, 2 ,尚 明1, 2
( 1 哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心 药物研究所博士后科研流动站,黑龙江 哈尔滨 150076;
2 国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心, 黑龙江 哈尔滨 150076)
摘 要:目的 探讨葎草酮抗肿瘤作用以及其与 N乙酰基转移酶 1 ( NAT1 酶) 之间的关系。方法 采用 H PLC
法,以对氨基苯甲酸 ( PABA ) 为底物,测定 PABA 被 NAT1 乙酰化为乙酰化对氨基苯甲酸 ( Ac PABA) 的量, 间
接反映 NAT1 酶的活性。采用 RTPCR 法,测定葎草酮对 NAT1 mRNA 表达的影响。结果 葎草酮能够显著降
低 SGC7901 完整细胞和细胞质中 AcPABA 的生成量;随着作用时间的增加, A cPABA 的生成量逐渐增加, 但与
其相同时间点的阴性对照组比较, 葎草酮组 AcPABA 的生成量明显减少; 葎草酮能够降低 SGC7901 细胞中
NAT1 mRNA 的表达。结论 葎草酮通过抑制 NAT1 的活性和基因表达两个方面减少芳香胺类化合物代谢为乙
酰化的芳香胺类致癌物的量,从而预防癌症的发生,防止癌症的进一步恶化。
关键词:葎草酮; 人胃癌细胞 SGC7901; N乙酰基转移酶 1 ( NAT1) ; NAT1 mRNA 表达
中图分类号: R285 5 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 05076106
Inhibition of humulon on arylamine Nacetyltransferase1 activity and gene expression
in SGC7901 cells
GAO Shiyong1, 2 , LANG Lang 1, 2 , ZOU Xiang1, 2 , JI Chenfeng1 , 2 , JI Yubin1, 2 ,
M A Qiang
1, 2
, YUE Lei
1, 2
, QU Zhongyuan1, 2 , SHANG M ing1, 2
( 1 Postdoctor al Research Station, Institut e o f Mater ia Medica, Center of Research and Development on Life Sciences
and Env ironment Sciences of H arbin Univ ersity of Commerce, Harbin 150076, China; 2. M OE Eng ineering
Research Center of Natural Anticancer Drug s, H arbin Univer sity o f Commerce, H arbin 150076, China)
Abstract: Objective To study the ant itumor effects o f humulon on ar ylamine Nacety lt ransferase1
( NAT 1) act ivity. Methods Employ ing H PLC, using PA BA as subst rate, in intact SGC7901 cells and
their cytoplasm, making PABA being acety lated to AcPABA by NAT1 as the activity of NAT 1. Rever se
tr anscriptase polymerase chain react ion ( RTPCR) assay w as used to study the expression o f the NAT1
mRNA. Results The results show that humulon could inhibit the product ion of AcPABA in intact SGC
7901 cell and the cy toplasm , the product ion of AcPABA was g radually increased w ith the interact ion t ime
increasing. But comparing w ith corr esponding negat iv e contro l group s, the production of AcPABA was
!761!中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
收稿日期: 20091210 基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30873403) ; 黑龙江省教育厅重点项目 ( 11511102)作者简介:高世勇( 1975 ∀ ) ,男,博士,副研究员,硕士生导师,哈尔滨商业大学药物研究所所长,研究方向为肿瘤药理学。
Email: sygao2002@ 163. com
decreased ev ident ly and the humulone could inhibit the expression of NAT1 mRNA. Conclusion Humulon
could prevent the occurrence and deteriorat ion of cancer. It s mechanisms can be att ributed to its ef fect on
decreasing the product ion of acety lat ion of carcinogenic ar omat ic amines, w hich is acetylated f rom aromatic
am ines, and inhibit ing the NAT1 act ivity and expression of NAT1 mRNA.
Key words: humulon; SGC7901 cell; Nacety lt ransferase1 ( NA T1) ; NAT 1 mRNA expression
葎草酮为大麻科植物啤酒花 H umulus lup ulus
Linn. 中的一种主要化学成分,在桑科植物葎草的
球果中量也较高。啤酒花是一种重要的传统中药,
也是酿造啤酒的重要原料,其中酸 (acids) 及
酸 ( acids) 是酒花苦味的主要来源,因其独特的药
用价值而成为近年研究的热点。美国专利研制出了
一种能够抑制多种肿瘤 (乳腺癌、淋巴癌、宫颈癌)
生长的产品,此产品中主要的功能成分是啤酒花中
的酸和酸。啤酒花在民间用于治疗胃癌以及结
核潮热、胃肠炎、痢疾、感冒发烧、小便不利、肾盂肾
炎等疾病[ 1] 。葎草酮作为啤酒花酸的主要成分之
一,有研究表明其对化学方法诱导的小鼠皮肤癌有
较好疗效[ 2] ,作用机制与影响环氧化酶 2 ( COX2) 活
性及基因表达有关[ 3]。另有研究发现葎草酮能够抑
制肿瘤新生血管的生成 [4] ,从而达到抗肿瘤的作用。
Tobe 等[ 5] 报道葎草酮能够诱导 HL60 细胞凋亡。
N乙酰化转移酶 ( NAT ) 是 #相药物代谢酶,
研究发现 NAT 是一种细胞凋亡抑制酶 [ 6] , 与肿瘤
的发生和发展密切相关[ 7, 8]。研究表明, 龙葵碱通
过抑制 HepG2 细胞 NAT 的活性发挥细胞毒作
用[ 9]。本实验以啤酒花在民间用于治疗胃癌为依
据,以人胃癌细胞株 SGC7901为研究模型,在观察
葎草酮对 SGC7901 细胞株细胞毒作用的基础上,
以 NAT 酶为研究靶点, 揭示葎草酮预防肿瘤发生
及抑制肿瘤的作用机制。
1 材料
1 1 细胞株: 人胃癌细胞株 SGC7901, 购自美国
ATCC ( American T ype Culture Co llect ion) , 由黑
龙江省肿瘤医院肿瘤研究所保种提供。
1 2 药品与试剂:葎草酮 (质量分数 95% ) 购自北
京豪盛酒花制品厂;阿霉素由山西泰盛制药有限公
司生产; RPM I 1640 细胞培养液、胰酶购自美国
Gibco 公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材
料有限公司;溴化四氮唑蓝 ( M TT )、T ris、对氨基苯
甲酸 ( PABA) 购自 Sigma公司;乙酰化对氨基苯甲
酸 ( AcPABA)、AcCoA、BSA、乙酰肉毒碱、肉毒碱
乙酰转移酶购自美国 FLU KA 公司; DT T 购自国
药集团化学试剂有限公司; PM SF、Leupept in 购自
上海华舜生物工程有限公司; DEPC 购自北京索莱
宝科技有限公司; T r izol购自美国 Inv it ro gen 公司;
NAT 1、act in 引物由上海生工生物技术服务有限
责任公司合成; RTPCR 试剂盒 [ T aKaRa RNA
PCR Kit ( AMV) Ver. 3. 0]购于宝生物工程(大连)
有限公司; 溴化乙锭 ( EB) 购于美国 Amer sco 公
司;琼脂糖购于北京奥博星生物技术有限责任公司。
1 3 仪器: CO ∀ 150 型 CO2培养箱 (美国 NBS 公
司) ; SWCJ ∀ 2F 型超净工作台 (苏州净化设备
厂) ; Olympus IX70 型倒置显微镜 ( Olympus 公
司) ; 680 型酶标仪 (美国 BioRad 公司) ; Waters
2695 型高效液相色谱仪、Symmetry Shield C18 ( 250
mm ∃ 4. 6 mm, 5 m) 逆向色谱柱 (美国 Waters公
司) ; MyClear 型 PCR 仪 ( 美国 BioRad 公司 ) ;
EC120/ CSSU78 型电泳仪 (美国 BioRad 公司) ; 6R
型台式冷冻离心机 (美国 BeckmanCoulter 公司)。
1 4 AcCoA 循环混合液 ( 3 mL ) 配制: 1 mo l/ L
DT T 6 L, 35 mmol/ L EDT A 17. 535 L, 乙酰肉
毒碱 10. 787 mg , 肉毒碱乙酰转移酶 6 U, 50
mmol/ L Tr isHCl 2. 976 mL。
2 方法
2 1 MT T 法测定葎草酮对人胃癌细胞 SGC7901
的细胞毒作用: 将对数生长期的人胃癌细胞 SGC
7901 用胰酶消化后配制成浓度为 5 ∃ 104个/ mL 的
细胞悬液, 接种于 96 孔板中, 每孔 100 L。5%
CO 2、37 % 孵育 24 h,然后, 实验组加入 100 L 不
同浓度葎草酮, 终浓度分别为 28、56、112、224、448
mo l/ L 阴性对照组加入 100 L RPM I 1640 细胞
培养液,阳性对照组加入 100 L 不同浓度阿霉素,
终浓度分别为 0 001、0 01、0 1、1、10 mol/ L , 每个
剂量设 6 个平行孔,置 37 % 、5% CO 2培养箱中继
续培养 72 h。72 h 后, 弃上清液, 每孔加 0 5 mg/
mL MT T 液 100 L,继续培养 4 h 后弃上清液,每
孔加 DMSO 200 L, 置微量振荡器上振荡至溶解
后,酶标仪测定吸光度值, 检测波长 570 nm。计算
药物对肿瘤细胞的抑制率, 并计算 IC50。
抑制率= (对照组平均吸光度值- 给药组平均吸光度
值) /对照组平均吸光度值∃ 100%
!762! 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
2 2 葎草酮对 SGC7901细胞 NAT 1活性的影响
2 2 1 标准曲线的绘制:用蒸馏水配制 AcPABA
标准品溶液, 质量浓度分别为 0 015、0 03、0 06、
0 12、0 24、0 3 mg/ mL, 依次进样, 进样量 1 L。
色谱 条 件: Symmetr yShied C18 逆 向 色 谱 柱
( 250 mm ∃ 4. 6 mm, 5 m) , 流动相为 50 mmol/ L
醋酸乙腈 ( 86&14) , 2487紫外检测器,检测波长 266
nm,柱温 (25 ∋ 5) % 。峰面积由 Empower 工作站软
件自动积分,用 Excel软件以标准品质量浓度和峰面
积分别为横纵坐标做标准曲线,计算相关系数,得回
归方程: Y= 5 ∃ 106 X- 10 643, r= 0 999 9。
2 2 2 不同质量浓度葎草酮对 SGC7901 完整细
胞 NAT1 活性的影响: 取处于对数生长期生长良好
的 SGC7901 细胞, 胰酶消化后, 用含 10% 胎牛血
清的 RPM I 1640 细胞培养液调整细胞浓度为 5 ∃
105个/ mL, 将细胞悬液加到 24 孔板中,每孔 1 mL。
37 % 、5% CO2条件下培养 24 h 后, 每孔加入底物
PABA,终浓度 45 mol/ L, 给药组加入不同浓度的
葎草酮, 终浓度分别为 28、56、112、224、448 mol/
L, 阴性对照组加入相同体积的 RPM I 1640 细胞培
养液, 37 % 、5% CO 2条件下培养 24 h。24 h 后, 吸
出培养液, 3 500 ∃ g 离心 10 min,上清液加 0 2 mL
10% 的三氯乙酸沉淀蛋白, 静置 6 h, 高速离心机
12 000 ∃ g 离心 5 min,取 20 L 上清液按( 2 21项)
方法 HPLC 自动进样进行检测。由 AcPABA 的量
来间接反映 NAT 1 的活性的变化。NAT 1 的活性用
1 ∃ 106细胞对应的乙酰化底物 ( nmol) 表示。
2 2 3 葎草酮作用不同时间对 SGC7901 完整细
胞中 NAT 1 活性的影响: 取处于对数生长期的
SGC7901 细胞,胰酶消化后, 用含 10% 胎牛血清
的 RPM I 1640 细胞培养液调整细胞至 5 ∃ 105个/
mL,将细胞悬液加到 24 孔板中,每孔 1 mL, 放入
37 % 、5% CO2条件下培养箱中培养 24 h 后, 每孔
加入底物 PABA,终浓度为 45 mo l/ L ,给药组加入
葎草酮,终浓度为 28 mol/ L。阴性对照组加入等
体积 RPM I 1640 细胞培养液, 37 % 、5% CO 2条件
下分别培养 24、48、72 h 后,将细胞及培养基移取离
心,接下来的实验步骤同( 2 2 2项)。
2 2 4 葎草酮对 SGC7901 细胞细胞质中 NAT 1
活性的影响: 取处于对数生长期的 SGC7901 细胞
1 ∃ 107个, 胰酶消化后, PBS 洗两遍,沉淀的细胞悬
浮在 2 mL 的裂解液[ 20 mmo l/ L Tr isHCl ( 4 %
时 pH 7. 5) , 1 mmol/ L DT T, 1 mmol/ L EDT A,
50 mol/ L PM SF, 10 mol/ L leupept in]中。悬液
4 % 下超声波破碎 20 min, 然后先以 9 000 ∃ g 离
心 1 min,上清液 10 000 ∃ g 离心 60 min,取上清液
置于冰浴中,备用, 用于测定蛋白的量和 NAT 1 活
性,蛋白量测定采用 Bradfor d方法, 以 BSA 作为蛋
白标准。
活性测定实验中, 通过测定被乙酰辅酶 A 依赖
的 NAT1乙酰化的 PABA 的量,即 AcPABA 生成
的量,来间接反映细胞质中 NAT 1 的活性。实验分
7组, 分别为阴性对照组、空白对照组、葎草酮组
(终浓度为 28、56、112、224、448 mol/ L )。反应混
合液总体积 550 L, 包括 250 L 的细胞质液、100
L 乙酰辅酶 A 循环混合液、终浓度为 45 mo l/ L
PABA、不同浓度的葎草酮。37 % 温育 5 min, 最后
加入 200 L 1 mg/ mL 的 AcCoA 开始反应。阴性
对照加入相同体积的 RPM I 1640 细胞培养液。空
白对照组不加 A cCoA,而加入等量的双蒸水。将混
合液于 37 % 温育 6 h,取出后加入 200 L 20% 三
氯乙酸终止反应。混合液经 0 22 m 滤膜过滤后,
HPLC 测定 AcPABA 的量, 色谱条件同 ( 2 2 1
项),观察葎草酮对细胞质液中 NAT 1活性的影响。
2 3 RTPCR 测定葎草酮对 NAT1 mRNA 表达
的影响
2 3 1 细胞培养及给药: 取生长状态稳定, 呈对数
生长期的 SGC7901 细胞, 0 25% 胰酶消化细胞,
用含 10% 胎牛血清的 RPM I 1640细胞培养液调整
细胞浓度为 5 ∃ 105个/ mL, 将细胞悬液加入 100
mL 培养瓶中,细胞分瓶后加入 5% CO2、37 % 二
氧化碳培养箱培养 24 h。实验分葎草酮组和阴性
对照组,葎草酮组分别加入不同浓度的葎草酮, 终浓
度分别为 28、56、112、224、448 mol/ L ,阴性对照组加
入等体积 RPMI 1640 细胞培养液。细胞加药后,放
入 5% CO2、37 % 二氧化碳培养箱继续培养 48 h。
2 3 2 RNA 的提取: 用 DEPC 水洗细胞 1次后,
每瓶加 1 mL Trozol, 充分震荡混匀, 15~ 30 % 静
置 30 min。30 m in 后吹下细胞放入 1 5 mL Ep
pendo rf 管中,静置 5 min,加入 0 2 mL 氯仿,充分
震荡 15 s 混匀, 15 ~ 30 % 静置 10 min, 4 % 、
12 000 ∃ g 离心 15 min, 抽提 RNA。取 500 L 上
层水相转移至另一个 Eppendorf 管中, 加等体积异
丙醇 15~ 30 % 静置 1 h 后, 4 % 、12 000 ∃ g 离心
15 m in, 弃上清, 沉淀即为总 RNA。加 0 5 mL、
75% 乙醇震荡洗涤 1 次, 4 % 、10 000 ∃ g 离心 10
m in,小心吸干乙醇,空气干燥。当 RNA 沉淀变澄
清透明时,加 50 L DEPC 水, 58 % 水浴 10 min溶
!763!中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
解 RNA, 并测定其在 260、280 nm 的吸光度值, 计
算总 RNA 浓度,于 - 20 % 储存备用。
2 3 3 RTPCR: 采用 Rrem ier 5 引物设计软件设
计引物序列。NAT 1、actin 引物由上海生工生物
技术服务有限责任公司合成。NAT1: 正向引物为
5 CA CCCGGAT CCGGGA TCATGGACATT GA
AGC3 , 反向引物为 5 GGT CCT CGAGT CAA T
CACCATGT TT GGGCAC3 , 885 bp。act in: 正
向引物为 5 GCT CGT CGTCGA CAA CGGCT C3 ,
反向引物为 5 CAAACA TGATCT GGGTCAT CT
T CTC3 , 331 bp。按照 T aKaRa RNA PCR Kit
( AMV ) Ver. 3. 试剂盒说明书步骤操作。反应完
成后,取 20 L PCR 扩增产物与 5 L 上样缓冲液
混匀,加样至 1% 琼脂糖凝胶 (含 EB 1 g / mL) , 50
V 电泳约 2 h。用凝胶成像系统紫外透射照像, 以
PCR 产物与 act in 相对吸光度之比对数据进行
分析。
2 4 数据处理:数据以 x ∋ s 表示, 采用 t检验对数
据进行处理。
3 结果
3 1 葎草酮对 SGC7901 细胞毒作用: M TT 法检
测葎草酮对体外培养 SGC7901 细胞生长抑制作
用, 结果表明葎草酮对 SGC7901 细胞的 IC50为
3631 mol/ L , 阿霉素对 SGC7901 细胞的 IC50为
04 mol/ L ,表明葎草酮对 SGC7901 细胞具有较好
的抑制作用。
3 2 不同浓度葎草酮对 SGC7901 完整细胞
NAT1 活性的影响: 与阴性对照组比较, 葎草酮能
够减少 SGC7901 完整细胞中 AcPABA 生成的
量,并且随着葎草酮浓度的增加, AcPABA 生成的
量逐渐减少。结果见表 1。
3 3 葎草酮作用不同时间对 SGC7901 完整细胞
NAT 1活性的影响: 28 mo l/ L葎草酮分别作用于
表 1 不同浓度葎草酮对 SGC7901 完整细胞 NAT1 活性的
影响 ( x∋ s, n= 6)
Table 1 Ef fect of humulon in different concentration on NAT1
activity in intact SGC7901 cells (x ∋ s, n= 6)
组 别 C/ ( mo l! L- 1 ) AcPA BA 的生成量/ nmol ( 1∃ 106细胞)
阴性对照 0 0 364 7∋ 0 009 8
葎草酮 28 0 350 6∋ 0 003 4* *
56 0 298 3∋ 0 006 4* *
112 0 288 6∋ 0 006 8* *
224 0 265 4∋ 0 005 2* *
448 0 221 1∋ 0 009 3* *
与阴性对照组比较: * * P < 0 01
* * P< 0 01 v s n egative cont rol g rou p
SGC7901细胞 24、48、72 h,随着作用时间的增加,
SGC7901细胞中 AcPABA 生成的量逐渐增多,但
葎草酮组与同一时间段的阴性对照组比较,能够显
著减少 AcPA BA 生成的量。结果见表 2。
3 4 葎草酮对 SGC7901细胞细胞质 NAT 1 活性
的影响: 不同剂量的葎草酮作用于 SGC7901 细胞,
与阴性对照组比较, 能够显著降低细胞质中 Ac
PABA 的生成量,并且随着葎草酮浓度的增大, Ac
PABA 的生成量逐渐降低。结果见表 3。
表 2 葎草酮作用不同时间对 SGC7901 完整细胞 NAT1
活性的影响 (x ∋ s, n= 6)
Table 2 Effect of humulon on NAT1 activity in intact
SGC7901 cells at diff erent times following
its administration (x ∋ s, n= 6)
组 别 药物浓度/
( mol ! L- 1 )
A cPABA 的生成量/ nmol ( 1 ∃ 106细胞)
24 h 48 h 72 h
阴性对照 0 0 316 1 ∋ 0 011 5 1 206 4 ∋ 0 018 7 1 575 2 ∋ 0 015 4
葎草酮 28 0 276 2 ∋ 0 015 6* * 0 629 4 ∋ 0 023 2* * 0 751 8 ∋ 0 015 3* *
与阴性对照组比较: * * P< 0 01
* * P < 0 01 v s negat ive cont rol group
表 3 葎草酮对 SGC7901 细胞细胞质 NAT1 活性的影响
( x∋ s, n= 6)
Table 3 Effect of humulon in dif ferent concentration on NAT1
activity in cytoplasm of SGC7901 cells ( x∋ s, n= 6)
组 别 给药浓度/ ( mol! L- 1 ) AcPABA 的量/ ( pmo l! mg- 1)
空白对照 0 0
阴性对照 0 4 040 0∋ 0 039 9
葎草酮 28 3 710 0∋ 0 018 9* *
56 3 590 0∋ 0 024 6* *
112 3 390 0∋ 0 025 1* *
224 3 240 0∋ 0 019 5* *
448 3 080 0∋ 0 041 7* *
与阴性对照组比较: * * P< 0 01
* * P < 0 01 v s negat ive cont rol group
3 5 葎草酮对 SGC7901 细胞 NAT mRNA 表达
的影响: RTPCR 实验结果表明,不同剂量的葎草酮
作用于 SGC7901 细胞,与阴性对照组比较, 葎草酮
能够显著降低 SGC7901 细胞 NAT1 mRNA 的表
达,并且随着葎草酮浓度的增大, NAT 1 mRNA 表
达的量逐渐降低。结果见图 1。
4 讨论
据调查发现, 肿瘤大约有 90% 是由外源性因
素引起的, 而这些外源性因素中 70% 是由化学致
癌物引起的[ 10, 11] 。目前发现具有致癌或促癌作用
的化学物种类繁多,以芳香烃、芳香胺硝基化合物和
偶氮化合物为主。芳香胺类化合物其本身无致癌
性,但是经过体内药物代谢酶代谢之后能转变为活性
很强的终极致癌物。此外,还包括胺类代谢产物,如
!764! 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
1~ 5葎草酮 ( 448、224、112、56、28 m ol ! L - 1) 6阴性对照
与阴性对照组比较: * P< 0 05 * * P< 0 01
* P < 005 * * P< 0 01 v s n egative cont rol g rou p
图 1 葎草酮对 SGC7901 人胃癌细胞 NAT1 mRNA
表达的影响
Fig. 1 Effect of humulon on expression of NAT1 mRNA
in SGC7901 cells by RTPCR assay
羟胺、酰胺等化合物,其中一些具有很强的致癌性。
通常参与芳香胺类化合物的代谢活化的酶有 3
种: P450、乙酰基转移酶与硫转移酶。其中 N乙酰
基转移酶 ( NAT ) 是大多数哺乳动物体内参与二相
乙酰化反应的代谢酶。NAT 在人体中具有两种亚
型 NAT1 和 NAT 2[ 12] , 两者在结构上有一定相似
性, 但在组织分布和生物学作用方面相差较大。
NAT1 表达于人体大多数组织, 催化对氨基水杨酸
和 PABA 等物质的乙酰化代谢。NAT2 又称芳香
胺 N乙酰化转移酶,主要催化芳香胺进行乙酰化转
移反应。NAT2 表达于肝脏和肠道,在体内参与 20
多种肼类化合物及致癌性芳香胺和杂环胺类化合物
的生物激活或灭活代谢。目前国内对 NAT 的研究
主要集中在临床对肝癌、肺癌多态性的报道, 而关于
其实验方面的研究较少。而国外文献有发现通过影
响 NAT 的活性来达到抗肿瘤的作用的报道 [ 13~ 17]。
由于细胞质中酶蛋白的量甚微, 很难直接测定
其蛋白质的量。所以, 酶的活性通常是指酶催化反
应的能力,其衡量的标准是酶促反应速度的大小。
酶促的反应速度可在适宜的反应条件下, 用单位时
间内底物的消耗或产物的生成量来表示。HPLC
法较比色法与分光光度法更为精确,数据重现性较
好。PABA 是 NAT 1 特异性底物, 其经 NAT1 代
谢后生成较为稳定的乙酰化 AcPABA, AcPABA
在紫外 266 nm 处吸收最大, HPLC 能准确检测出
其量。所以本实验采用 HPLC 方法, 以 PABA 为
底物,测定葎草酮对 SGC7901 细胞 NAT1 活性的
影响。
MTT 法结果表明葎草酮对人胃癌细胞 SGC
7901 具有较好的抑制作用,进一步对其作用机制进
行研究,葎草酮对 SGC7901 细胞 NAT1 活性影响
实验结果显示: ( 1)葎草酮能够显著降低 SGC7901
完整细胞和细胞质中 AcPABA 的生成量, 并且随
着葎草酮作用剂量增大, AcPABA 的生成量逐渐
减少,呈现良好的线性关系。( 2)随着作用时间的增
加, AcPABA 的生成量逐渐增加, 但是与其相同时
间点的阴性对照组比较, 葎草酮组 AcPABA 的生
成量明显减少。结果表明葎草酮能显著抑制
NAT 1 的活性, 并且这种抑制作用和剂量、时间正
向成依赖关系。在相同的酶活性下, 酶表达的量也
与酶的催化能力密切相关, 酶的量越多,催化的能力
越强,即酶的活性和酶的量是影响酶催化能力的两
个因素。因此,进一步观察葎草酮对 NAT 1 酶的表
达是否有影响。
考察葎草酮对 NAT1 mRNA 表达的影响, 发
现葎草酮可以明显减少 SGC7901 细胞中 NAT1
mRNA 的表达量。NA T1 mRNA 的表达量减少,
相应的 NAT 1蛋白表达的量也相应减少,这可能是
葎草酮降低机体将芳香胺类化合物催化为乙酰化芳
香胺的另一个机制。
综上所述,葎草酮通过抑制 NAT 1的活性和减
少 NAT 1酶的表达两个方面减少细胞将芳香胺类
化合物代谢为乙酰化的芳香胺类致癌物的量,从而
预防癌症的发生, 防止癌症的进一步恶化。
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金丝桃苷对离体大鼠腹主动脉的舒张作用及其机制研究
王启海1, 2 ,陈志武1*
( 1 安徽医科大学 药理学教研室, 安徽 合肥 230032; 2 安徽中医药高等专科学校 药学系,安徽 芜湖 241000)
摘 要:目的 研究金丝桃苷对离体大鼠腹主动脉环的舒张作用并探讨其可能的作用机制。方法 在大鼠离体腹
主动脉环上,分别观察累积浓度的金丝桃苷 ( 1∃ 10- 6. 5~ 1∃ 10- 4 mol/ L ) 对 KCl ( 30 mmol/ L ) 和 U46619 (血栓
素类似物, 1 ∃ 10- 7 mol/ L ) 预收缩血管环的作用。结果 金丝桃苷能够浓度依赖性舒张由 KC1 和 U46619 预收
缩的血管环,最大舒张率分别为 ( 52 2 ∋ 7 2) %、( 80 7 ∋ 4 1)% ; 去除血管内皮后, 最大舒张率分别降为 ( 15 4 ∋
1 2)%、( 21 6∋ 1 2)% , 与内皮完整组比较有显著差异 (P < 0 01)。在 30 mmol/ L KCl和 1 ∃ 10- 7 mol/ L U46619
预收缩的内皮完整血管环,用一氧化氮 ( NO) 合酶抑制剂 ( LNAME, 3∃ 10- 4 mol/ L ) 预温育后, 金丝桃苷的最大
舒张率分别降为 ( 23 0 ∋ 3 0) %、( 40 3 ∋ 3 6) % ,与未加 LNAM E 组比较有显著差异 (P < 0 01) ; 用环氧酶抑制
剂吲哚美辛 ( 1∃ 10- 5 mo l/ L) 预温育对金丝桃苷的舒张血管作用没有明显的影响;在 U46619 预收缩的血管环, 合
用 LNAME 和吲哚美辛不能完全阻断金丝桃苷引起的血管舒张 ,最大舒张率为 ( 36 6∋ 1 9) % ,与去内皮组比较
差异显著 ( P< 0 01)。结论 金丝桃苷具有内皮依赖性和较弱的非内皮依赖性血管舒张作用, 其内皮依赖性血管
舒张可能涉及到内皮 NO 和内皮依赖性超极化因子 ( endotheliumder ived hyperpolar izing facto r, EDH F ) 的释放。
关键词:金丝桃苷; 血管舒张; 内皮依赖性超极化因子 ( EDH F)
中图分类号: R285 5 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 05076605
金丝桃苷属于黄酮醇苷类化合物, 化学名称为
槲皮素3OD吡喃半乳糖苷, 广泛存在于锦葵
科、藤黄科、豆科、杜鹃花科等多种植物中 [ 1] ,是贯叶
连翘、红旱连、黄蜀葵、菟丝子、山楂等植物药中的有
效成分[ 2]。前期研究表明金丝桃苷对神经细胞[ 3] 和
心肌细胞[ 4, 5] 中钙离子内流有抑制作用, 对心脑缺
血再灌注性损伤具有明显的保护作用 [ 4, 6]。并且研
究还表明金丝桃苷可使狗血压下降,可抑制去甲肾
上腺素引起的离体家兔主动脉条的收缩 [ 7] , 表明金
丝桃苷对家兔血管有舒张作用, 但其血管舒张机制
尚未见报道。本研究在离体大鼠腹主动脉血管环
上,观察金丝桃苷的舒张作用,并探讨其可能的作用
机制。
1 材料
1 1 药品与试剂: 金丝桃苷由安徽医学研究所提
供,黄色粉末,质量分数∗96 0% ,使用前用二甲基
!766! 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
收稿日期: 20091013 基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30840104) ; 教育部博士点基金资助项目 ( 2007036605)作者简介:王启海( 1980 ∀ ) ,男,安徽霍邱人,药理学硕士研究生,研究方向为心脑血管药理学。
T el : 15156326268 Email: w angqihai_1982@ yah oo. com . cn
* 通讯作者 陈志武 T el: 13515669237 Em ail : w zcx iong@ mai l. hf . ah. cn