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Study of hepatic energy metabolism on rats by six cold property traditional Chinese medicines

6种寒性中药对大鼠肝脏能量代谢的影响



全 文 :6种寒性中药对大鼠肝脏能量代谢的影响
黄丽萍1,3,彭淑红2,3,蒙晓芳3,胡强3,张盨3,余日跃3,刘红宁4,孙建宁1
(1.北京中医药大学 中药学院,北京 100102;2浙江大学 动物科学学院,浙江 杭州,310029;
3江西中医学院,江西 南昌 330006;4江西中医学院 现代中药制剂教育部重点实验室,江西 南昌 330006)
[摘要] 目的:探讨6种寒性中药对大鼠肝脏能量代谢影响的共同规律。方法:6种寒性中药(苦参、栀子、黄柏、黄芩、黄
连和龙胆)的水提取物分别60,70,84,60,70,40g·kg-1灌胃大鼠30d,测定大鼠肝脏Na+K+ATP酶、Ca2+ATP酶,琥
珀酸脱氢酶(SDH)的活性,肝糖原含量和肝脏解偶联蛋白2(UCP2)的mRNA表达水平。结果:6种寒性中药能显著降低Na+
K+ATP酶、Ca2+ATP酶的活性;6种寒性中药均有使SDH活性降低的趋势,其中黄柏、黄芩、黄连和龙胆的降低有统计学意
义;6种寒性中药有升高大鼠肝糖原含量的趋势,但是未达到显著水平;6种寒性中药有降低肝脏UCP2mRNA水平的趋势,其
中以苦参、黄柏、黄芩的降低有显著意义。结论:6种寒性中药可能通过降低肝脏线粒体SDH的活性从而减少ATP的生成,降
低肝脏Na+K+ATP酶、Ca2+ATP酶的活性从而减少ATP的消耗,减少肝脏UCP2mRNA的表达从而减少产热,起到调节肝
脏能量代谢的作用。
[关键词] 寒性中药;能量代谢;解偶联蛋白2mRNA表达
[收稿日期] 20090520
[基金项目]  国家 重 点 基 础 研 究 发 展 计 划 (973)项 目
(2006CB504702);江西省教育厅(GJJ09276)
[通信作者] 刘红宁,Tel:(0791)7118857;Email:lhongning@
yahoocomcn
[作者简介] 黄丽萍,硕士生导师,副教授,在职博士生,主要从事
药理研究和教学工作,Tel:(0791)7118919,Email:jxnchlp@
163com
  中药具有寒,热之性,采用现代科学技术,从本
质上揭示寒热药性理论科学内涵,不但能促进中药
药性理论的发展,对于丰富和发展中医药基础理论
具有强大的推动作用。近年来,很多学者从药性的
生物效应、药性物质基础等方面进行了较广泛的研
究,但没有取得突破性的进展。生物能量是维持机
体生命的重要物质基础,能量代谢是人体物质代谢
的最基本形式。中医的寒热证型与机体能量代谢的
关系密不可分,寒热中药可能通过影响能量代谢的
某些环节,实现对寒热证的调节[1]。本试验拟通过
对6种典型寒性中药对肝脏能量代谢的影响,试探
找出寒性中药的作用规律和药性特征,进一步为药
性的科学评价打好基础,从而更好的指导中药的临
床运用。
1 材料
11 药物及试剂
黄连 RhizomaCoptidis、黄芩 RadixScutelariae、
黄柏 CortexPhelodendri、栀子 FructusGardeniae、苦
参RadixSophoraeFlavescentis、龙胆 RadixGentianae
均购自北京市鹤元堂医药科技有限公司,批号均为
200610003。各药材产地及品种鉴别,各试剂盒的来
源及批号见参考文献[2]。
12 引物设计
所用引物通过引物设计软件Oligo6自行设计,
序列如下:内参基因 βactin参照 GeneBank基因序
列(NM_031144)设计,上游引物 5′TGGGTATG
GAATCCTGTG3′,下游引物 5′GTGTTGGCAT
AGAGGTCTTT3′。UCP2基因参照GeneBank基因
序列(NM_019354)设计,上游引物:5′AGGTAG
CAGGAAGTCAGAAT3′,下游引物:5′TAGAGG
GAAAGTGATGAGAT3′,均由上海生工合成。
13 药物制备
见参考文献[2]。
14 动物
SD大鼠,清洁级,雄性,体重(200±20)g,江西
中医学院动物中心提供,许可证号 SCXK(赣)2006
0001。饲养室温(24±2)℃,相对湿度50% ~60%
RH,昼夜自然明暗交替照明,给与大鼠标准饲料和
饮用水。
15 仪器
UV2000型紫外可见分光光度计(尤尼柯上海
仪器有限公司)、Labfuge400R台式低温离心机(德
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国Heraeus)、荧光定量PCR仪(BIOER)。
2 方法
21 分组与给药
见参考文献[2]。
22 试验取材
第31天将大鼠麻醉后,取出肝脏后迅速按照顺
序分成若干份,分别用锡箔纸包好,迅速放入液氮
中,然后转移至-80℃冰箱保存备用。每个实验指
标选用同一部位的肝组织进行。
23 大鼠肝脏 Na+K+ATP酶、Ca2+ATP酶、SDH
活性、肝糖原含量的测定
准确称量一定量肝组织,按重量体积比加9倍
生理盐水,制成10%的匀浆,1500r· min-1离心10
min,取上清液按试剂盒法进行肝脏 Na+K+ATP
酶、Ca2+ATP酶、SDH活性的测定以及肝糖原含量
的测定,组织蛋白的测定采用考马斯亮蓝法。
24 SYBRGreen实时定量PCR检测UCP2基因的
表达[3]
241 mRNA提取及反转录 取肝组织50~100
mg加入1mLTrizol,按照说明书步骤提取总 RNA。
紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度,吸光度(A)
A260/A280178~21,所提取的 RNA至 -70℃储存
备用。按反转录试剂盒说明进行cDNA合成。
242 UCP2和 βactin扩增效率的检测 取一份
反转录好的肝脏 cDNA样品,分别稀释至100,50,
20,10,5,2,1倍。测定每1个稀释倍数下的 ΔCT=
(CT,UCP2-CT,βactin),数据经过最小二乘法线性回归
分析。
243 UCP2mRNA的检测 取待测样品 cDNA,
按照荧光定量 PCR试剂盒说明书进行操作。反应
总体积20μL,cDNA为1~2μg,上、下游引物终浓
度为05μmol·L-1。反应条件:95℃1min,95℃
15s及60℃60s,共40个循环。最后做溶解曲线,
以确定扩增产物的特异性。所有样品均重复检测3
次,用2ΔΔCT方法来表示所检测样品相对于作为参照
因子样品的目的基因的表达倍数。ΔΔCT =
(CT,目的样本UCP2 - CT目的βactin) - (CT,参照样本UCP2 -
CT,参照样本βactin)。
25 统计学方法
采用SPSS150进行统计分析。资料经过方差
齐性检验,数据用 珋x±s表示。组间差异比较用独立
样本t检验。
3 结果
31 对大鼠肝脏 Na+K+ATP酶、Ca2+ATP酶和
SDH活性的影响
与空白组比较,6种寒性药物均能显著降低
肝脏 Na+K+ATP酶活性,苦参组降低1451%,
栀子组降低1741%,均达显著水平(P<005);
黄柏组降低 2111%,黄芩组降低 2480%,黄
连组降低2164%,龙胆组降低2586%,均有极
显著统计学差异(P<001)。6种寒性中药均能
降低肝脏 Ca2+ATP酶活性,其中苦参组降低
1404%,达显著水平(P<005);栀子组降低
2421%,黄 柏 组 降 低 3246%,黄 芩 组 降 低
3368%,黄 连 组 降 低 3456%,龙 胆 组 降 低
3790%,均有极显著统计学差异(P<001)。6
种寒性中药均能降低肝脏 SDH活性,苦参组和栀
子组分别降低780%和 1198%,无显著统计学
意义;黄连组降低1559%,有明显的统计学差异
(P<005);黄 柏、黄 芩、龙 胆 组 分 别 降 低
1882%,1844%,1977%,均具有极显著意义
(P<001)(表1)。
表1 6种寒性中药对大鼠肝脏Na+K+ATP酶、Ca2+ATP酶和SDH活性的影响(珋x±s) U·mg-1
组别 剂量/g·kg-1 n Na+K+ATP酶 Ca2+ATP酶 SDH
空白 - 10 379±061 570±062 526±096
苦参 60 10 324±0481) 490±1061) 485±076
栀子 70 10 313±0681) 432±0852) 463±064
黄柏 84 10 299±0552) 385±0782) 427±0772)
黄芩 60 9 285±0282) 378±0612) 429±0582)
黄连 70 10 297±0502) 373±0682) 444±0601)
龙胆 40 10 379±0612) 354±0712) 422±0572)
  注:与空白组比较1)P<005,2)P<001(表3同)。
32 对大鼠肝糖原含量的影响 6种寒药处理组与空白组比较肝糖原有升高含
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量的趋势,苦参组升高 3160%,栀子组升高
1144%,黄柏组升高316%,黄芩组升高1439%,
黄连组升高2583%,但均未达到显著水平,与空白
组比较,苦参组和栀子组肝糖原的增加接近显著水
平(表2)。
表2 6种寒性中药对大鼠肝脏糖元含量的影响(珋x±s)
组别 剂量/g·kg-1 n 肝糖元/mg·g-1
空白 - 10 2911±1080
苦参 60 10 3831±1650
栀子 70 9 3244±738
黄柏 84 9 3003±899
黄芩 60 10 3330±1064
黄连 70 10 3663±1464
龙胆 40 9 2821±1106
33 对大鼠肝脏UCP2mRNA表达的影响
与空白组比较,6种寒性中药都有降低大鼠肝
脏 UCP2mRNA表达量的趋势,其中苦参组降低了
3095%,黄柏组降低了1762%,达到极显著水平
(P<001);黄芩组降低了1575%,达到显著水平
(P<005);栀子组降低了 595%,黄连组降低了
1487%,龙胆组降低了2188%,无明显统计学意
义(表3)。
表3 6种寒性中药对大鼠肝脏UCP2mRNA
表达的影响的影响(珋x±s)
组别 剂量/g·kg-1 n UCP2mRNA/βactin
空白 - 10 109±029
苦参 60 9 075±0292)
栀子 70 9 102±027
黄柏 84 9 090±0222)
黄芩 60 9 092±0271)
黄连 70 8 093±028
龙胆 40 9 085±044
4 讨论
本文选择了6味寒性中药研究其对肝脏能量代
谢相关因子的影响。本文的选药原则是:所选中药
为《中国药典》所收载;寒性必须明确、无争议;寒性
典型、突出;所选中药必须是道地药材。6味中药给
药剂量均参考药典剂量范围,为临床人用高限剂量
的40倍。
Na+K+ATP酶、Ca2+ATP酶与ATP的分解关
系密切[4],均是通过消耗ATP来维持膜两侧离子浓
度的重要酶,酶活性的升高伴随有 ATP消耗的增
加。在本试验中的6种寒性中药均能显著降低大鼠
肝脏组中 Na+K+ATP酶和 Ca2+ATP酶活性,均
达到了显著水平,提示寒性中药的干预可使肝脏
ATP消耗减少。体内能量 ATP来自于底物水平磷
酸化和氧化磷酸化,以后者为主,氧化磷酸化反应是
在线粒体内进行的。SDH是线粒体内三羧酸循环
中的酶,它的活性增高,表明三羧酸循环的加快,同
时也标志着细胞内 ATP生成增多[4]。本试验中,6
种寒性中药组SDH活性都有降低趋势,黄芩、黄连、
黄柏、龙胆组达到极显著水平,表明黄芩、黄连、黄
柏、龙胆不同程度地减慢了体内三羧酸循环,使机体
ATP的生成减少。另外,除龙胆组外,苦参、栀子、黄
芩、黄连、黄柏对大鼠肝糖原含量均有升高的趋势,
提示该寒性中药可能减少肝脏对于葡萄糖的利用,
亦或是促进了糖原的合成,但此作用并无统计学差
异。
UCP2广泛存在于动物的骨骼肌、心肌、胎盘、
肝脏、胰腺、肾脏、肺、胃及小肠等组织的线粒体内膜
上,它主要作用是通过消除线粒体内膜两侧的质子
梯度差,从而使氧化过程和ATP生成的磷酸化过程
解偶联,使得氧化过程释放的能量全部以热能形式
散失[56]。在本试验中,6种寒性中药不同程度的降
低了肝脏 UCP2表达量,提示6种寒药可能通过不
同程度地抑制了UCP2的表达,降低了UCP2所导致
的质子漏,从而减少了氧化磷酸化的解偶联,肝脏产
热减少,这与文献报道寒性药物长期给药后动物产
热减少,体温下降也是一致的[7]。
《神农本草经》指出 “疗热以寒药,疗寒以热
药”,苦参、栀子、黄柏、黄芩、黄连和龙胆6味寒性
中药可能通过降低肝脏 Na+K+ATP酶、Ca2+ATP
酶的活性,从而减少 ATP的消耗,减少肝脏线粒体
SDH的活性从而减少 ATP的生成,减少肝脏 UCP2
的表达从而减少产热,从而纠正热证患者或动物模
型与能量代谢增高[8]有关的病理生理基础。其他
的寒性中药是否也有相同或相似的作用,这6种寒
性中药影响肝脏能量代谢更深层的机制如何,尚需
进一步研究。
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Studyofhepaticenergymetabolismonratsbysixcoldproperty
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4KeyLaboratoryofModernPreparation,MinistryofEducationJiangxiUniversityofTraditional
ChineseMedicine,Nanchang330006,China)
[Abstract] Objective:Toinvestigatethecommonrulehepaticenergymetabolismonratsbysixcoldpropertyoftraditional
Chinesemedicines(TCM)Method:TheactivitiesofNa+K+ATPase,Ca2+ATPaseandSDH,thecontentofhepaticglycogen,and
themRNAexpressionofhepaticuncouplingprotein2(UCP2)weremeasuredaftertheratsandbeenadministratedwithwaterextractsof
RadixSophoraeFlavescentis,FructusGardeniae,CortexPhelodendri,RadixScutelariae,RhizomaCoptidis,RadixGentianaerespec
tivelyat60,70,84,60,70,40g·kg-1dosesfor30days,twiceadayResult:TheactivitiesofNa+K+ATPase,Ca2+AT
PaseandSDHweredepressedsignificantlybysixcoldpropertyTCMThedecreasedtendencyofSDHwasobservedbysixcoldproper
tyofTCM,whilestatisticalsignificancewasobtainedinCortexPhelodendri,RadixScutelariae,RhizomaCoptidis,RadixGentianae
TheincreasedtendencyofhepaticglycogencontentwasfoundbysixcoldpropertyTCM,whilestatisticalsignificancewasnotobtained
insixgroupsThedecreasedtendencyofthemRNAexpressionofUCP2wasfoundbysixcoldpropertyTCM,whilestatisticalsignifi
cancewasobtainedinRadixSophoraeFlavescentis,CortexPhelodendri,andRadixScutelariaegroupsConclusion:Thesixcold
propertyTCMhavethegoodefectsonhepaticenergymetabolismbydecreasingtheactivityofmitochondriaSDHtoreducetheproduc
tionofATPbydecreasingtheactivitiesofNa+K+ATPase,Ca2+ATPasetocutdowntheconsumptionofATP,bydecreasingthe
mRNAexpressionofhepaticUCP2todecreasetheheatproduction
[Keywords] coldpropertyTCM;energymetabolism;mRNAexpressionofhepaticUCP2
[责任编辑 古云侠]
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