全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 10 期 2011 年 10 月

• 2092 •
龙牙楤木三萜皂苷合成途径关键酶 AeFPS
赵春彦，成 颖
摘 因并
方法，设计特异引物，克隆 Sca I/B
有
登录 19226.1。成功构建了原核表达质粒 PS
关键 表达
中图 ：0253 - 2
sap alia elata
ZH Hong-d
C China
arnesyl diphosphate s in Aralia
elata. with
then the
induced b the obvious erence between bands
AeFPS accession Number: HM219226.1) was 1 040 bp
and c olyp
pET2 sformed
AGE a
li. This ful for investigating the activities or other
physiological functions of FPS protein.
Key words: Aralia elata (Miq.) Seem.; farnesyl diphosphate synthase (AeFPS); prokaryotic expression; Western blotting; cloning

龙牙楤木Aralia elata (Miq.) Seem. 又名辽东楤
木，系五加科楤木属植物，主要分布于我国东北。
其性味辛苦，有小毒，药用部位主要是根皮、树皮
及叶，具有补气安神、活血化瘀、利尿消肿、除湿
止痛之功效。用于治疗风湿性关节炎、肝炎、糖尿
病、神经衰弱、肾炎水肿等[1]。龙牙楤木的药效成
分为三萜皂苷，其皂苷元为齐墩果酸[2]。三萜皂苷
的代谢合成途径目前已经明确[3-6]，法呢二磷酸合
成酶（AeFPS）为类异戊二烯合成途径的关键酶之
一[7-8]，在人参、三七、拟南芥、玉米、银胶菊、辣
椒和棉花等 10 余种植物中有研究报道[6-11]。基于
此，本研究首次在龙牙楤木中克隆得到AeFPS，并
连接到原核表达载体上进行了原核表达，为研究
AeFPS蛋白生物学功能奠定了基础。

基因的克隆及原核表达
recom n was detected by SDS-P
AeFPS gene could be cloned and expressed in Escherichia co
慧，贾冬梅，邹宏达，原亚萍，吴 *
吉林大学植物科学学院，吉林 长春 130062
要：目的 克隆龙牙楤木法呢二磷酸合成酶（AeFPS）基
AeFPS 基因，并将该基因定向插入
进行原核表达。方法 以龙牙楤木为材料，采用 RT-PCR
amH I 切开的原核表达载体 pET-28a 上，转化大肠杆
Western blotting 进一步检测其为目菌 BL21，于 28 ℃，IPTG 诱导 5 h，经 SDS-PAGE 电泳分析，检测出明显的差异条带，
的基因。结果 克隆到 AeFPS 基因 cDNA 全长为 1 040 bp，含
号为 HM2 pET28a/AeF
1 029 bp 的开放阅读框（ORF），编码 342 个氨基酸，GenBank
、AeFPS 蛋白在 BL21 中高度表达，SDS-PAGE 和 Western
为研究 AeFPS 蛋白的活性及生blotting 鉴定了目标蛋白。结论 首次获得了 AeFPS 基因，并将其连入原核载体中成功表达，
化功能奠定了基础。
词：龙牙楤木；法呢二磷酸合成酶（AeFPS）基因；原核
分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号
；Western 杂交；克隆
670(2011)10 - 2092 - 05
Cloning and prokaryotic expressing of AeFPS
onins biosynthesis in Ar
gene: a key enzyme of triterpene
AO Chun-yan, CHENG Hui, JIA Dong-mei, ZOU
ollege of Plant Science, Jilin University, Changchun 130062,
a, YUAN Ya-ping, WU Ying
Abstract: Objective Cloning and prokaryotic expressing of f
Methods The AeFPS gene was amplified by RT-PCR
ynthase gene (abbreviated as AeFPS)
specific primers from A. elata and inserted into the prokaryotic
recombinant vector was transformed into BL21 stain. After
could be seen by SDS-PAGE and the AeFPS protein was
(GenBank
expression vector pET-28a which is digested by Sca I and BamH I,
y IPTG at 28 ℃ for 5 h, diff
detected by Western blotting too. Results The full-length cDNA of
ontained a 1 029 bp open reading frame (ORF) encoding a p
8/AeFPS has been successfully constructed. The BL21 tran
bined protein effectively. The protei
eptide of 342 amino acids. The prokaryotic recombined plasmid
recombined plasmid pET28/AeFPS had expressed AeFPS
nd Western blotting. Conclusion It is the first report that
work is help

收稿日期：2011-03-11
基金项目：吉林省科技厅资助项目（3D510X806604）
作者简介：赵春彦（1983—），女，山东郓城人，硕士研究生，主要从事药用植物生物技术研究。
Tel: 13086808840 E-mail: zhaochunyan-1984@126.com
*通讯作者 吴 颖 E-mail: wuying35969@126.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 10 期 2011 年 10 月

• 2093 •
1 材料与方法
龙牙楤木 Aralia elata (Mig.) Seem 采自吉林大
学
授 vector
购自 TaKaRa 公司；大肠杆菌 DH-5α 及质粒
性单组分 TMB 底物溶液均购自
均为国产分析纯。

1.2 方法
1.
试
剂盒合成 cDNA 第一链。RT-PCR 设计引物序列为
1.1 材料 筛选重组子。选取阳性克隆，经 PCR 检测
植物科学学院药用植物园，经吉林大学李彦舫教 受
鉴定为五加科楤木属龙牙楤木。pGM-T
pET-28a（载体含 Kan 筛选标记）和 BL21 菌种为
本实验室自制。
LA Taq 酶，限制性内切酶 BamH I、Sac I，
T4-DNA 连接酶，RNA 提取试剂盒及 cDNA 第一链
合成试剂盒购自 TaKaRa 公司；一抗 His-Tag（2A8）
Mouse mAb、沉淀
1.2.4 重组蛋白的诱导分析 将阳性工程菌在含卡
那霉素（10 μg/mL）的液体LB培养基培养，培养液
600 nm处测吸光度（A）值，培养至A
天根生化科技（北京）有限公司；羊抗小鼠抗体（二 电泳分析。
抗）购自武汉博士德生物工程有限公司；其他试剂 1.2.5 重组蛋白的 Wester
引物由金斯特科技（南京）有限公司合成，DNA
测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
电泳槽将目的蛋白转至 NC 膜上，5%脱脂蛋白封闭
2.1 RNA 提取及 cDNA 合成 采用 RNAiso plus 抗体孵育 1～2 h；通过沉淀型单
剂盒提取龙牙楤木嫩芽的总 RNA，利用反转录试 液与
FP：5-′CGCGGATCCGAATGAGCGATCTGAAGACGAG-3′；
RP：5-′CGAGCTCCTCAATTACTTACTTTTGCCGC-3′。
序与分析 将 PCR
大肠杆菌 DH-5α 感受态细胞，涂布氨苄平板，采
用单菌落摇菌碱裂解法提取质粒，对重组质粒进行
1.2.3 构建及鉴定 将含有目的基
因的 BamH
I 和 Sac I 双酶
连接 -5α 感受
态细胞，在含有 10 μg/mL 卡那霉素的 LB 培养基上
和酶切鉴
定验证重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌 BL21 感
态细胞，经过卡那霉素筛选阳性克隆、质粒 PCR
和 酶 切 鉴 定 获 得 工 程 菌 ， 并 命 名 为 BL21-
pET28a-AeFPS。
加上样缓冲液于沸水中煮 10 min，进行SDS-PAGE
n blotting 分析 表达产物
经 12% SDS-PAGE 电泳后，用 ST-I 型半干式转移
过夜，特异结合组氨酸标签的小鼠单克隆抗体孵育
1～2 h；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠
组分 TMB 底物溶
HRP 反应形成沉淀蓝褐色产物，进行重组蛋白
的 Western blotting 分析。
031 bp，编码 342 个氨基酸（图 2）。


M-DL2 000 1-阴性对照 2, 3-AeFPS 基因
M-DL2 000 1-negative control 2, 3-AeFPS gene
基因 RT-PCR 扩增电泳图
Fig. 1 RT-PCR electrophoretogram of AeFPS gene

在 25 μL的反应体系中，dNTP 0.5 μL（10
mmol/L），引物各 1.0 μL（10 μmol/L），模板cDNA
200 ng，LA Taq 酶 0.25 μL（5 U/μL），10×LA Taq
缓冲液 2.5 μL，加dd H2O补足至 25 μL。PCR扩增
条件：94 5℃ min；94 1℃ min，58 1℃ min，72
℃ 90 s，35 个循环；72 ℃ 10 min。
1.2.2 目的片段的回收、克隆测
2 结果与分析
2.1 AeFPS 基因 cDNA 序列的扩增及序列分析
以逆转录合成的 cDNA 第一链为模板，利用特
异引物 FP、RP 进行 PCR 扩增，产物经 0.8%琼脂
糖凝胶电泳检测，扩增带为单一的大小约为 1 000
bp 的片段（图 1）。克隆到 pGM-T 载体上经 PCR、
酶切鉴定后测序，结果为 1 040 bp，利用 NCBI 的
ORF finder 功能确定包含完整的开放阅读框为 3～1
产物回收后与克隆载体 pGM-T 连接。连接产物转 利用 Expasy 中的 Protparam 进行该氨基酸序列
化
PCR、酶切鉴定，上海生工对阳性克隆进行测序。
将测序结果经 BLAST 软件进行同源性比对，采用
NCBI软件的ORF finder确定该基因的开放阅读框。
利用 Expasy、SMART 软件进行蛋白质基本理化性
质和功能位点分析。利用 DNAman 软件完成多序列
比对。
原核表达载体的
重组质粒 pGMAeFPS 和 pET-28a 分别用
切，回收目的片段和载体，经 T4-DNA 图 1 AeFPS
酶 16 ℃过夜连接，转化大肠杆菌 DH
600值为 0.7～
1.0 时，加入终浓度为 1.0 mmol/L异丙基硫代-β-D
半乳糖苷（IPTG）诱导 5 h，分别收集上清和沉淀，
M 1 3

p

1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
2
2 000 b
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 10 期 2011 年 10 月

• 2094 •
分析，相对分子质量为 39 559.6，
.83。带正电荷的氨基酸残基（天门冬氨
酸和
。
基本理化性质的
等电点为 5
谷氨酸）总数为 50 个，带负电荷的氨基酸残
基（精氨酸和赖氨酸）的总数为 44 个。该蛋白质
不稳定指数为 39.04，说明蛋白质是稳定的。利用
Signal P 3.0 Server 蛋白信号肽预测服务器分析蛋白
AeFPS，该蛋白 N 端不含信号肽序列。通过
DNAman 与人参、西洋参、积雪草、蒿属、烟草、
拟南芥等氨基酸序列的同源性比对，同源性达到
80%以上（图 3）。因此可以确定克隆到的基因为
AeFPS 基因。首次克隆得到该基因，GenBank 登录
号为 HM219226.1

图 2 AeFPS 的 cDNA
Fig. 2 cDNA and deduced am
序列及推
ino
导的氨基酸序列
acid sequences of AeFPS gene
88ARALIA_ELATA.TXT
88MEDICAGO_TRUNCATULA.TXT
15NICOTIANA_TABACUM.TXT
88PANAX_GINSENG.TXT
88PANAX_NOTOGINSENG.TXT
89ARABIDOPSIS_THALIANA.TXT
89ARTEMISIA_ANNUA.TXT
88CAPSICUM_ANNUUM.TXT
88CENTELLA_ASIATICA.TXT
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178ARALIA_ELATA.TXT
178MEDICAGO_TRUNCATULA.TXT
105NICOTIANA_TABACUM.TXT
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178PANAX_NOTOGINSENG.TXT
179ARABIDOPSIS_THALIANA.TXT
179ARTEMISIA_ANNUA.TXT
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178CENTELLA_ASIATICA.TXT
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图 3 不同植物 A
Fig. 3 Comparison on amino acid sequ
序列比较
of AeFPS gene from different plants
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 10 期 2011 年 10 月

• 2095 •
AeFPS 成功连接到 pET-28a 后，转化 BL21 感受
态细胞，卡那霉素筛选重组子，质粒提取 PCR（图 4）
和酶切（图 5）验证确定该基因已成功转化 BL21 菌。

M-DL2 000 1-重组质粒 PCR 2-空白对照
M-DL2 000 1-PCR of recombined plasmid 2-blank
图 4 PCR 鉴定
Fig. 4 Identification by PCR

M-DL2 000 1-重组质粒酶切
M-DL2 000 1-enzyme digestion of recombined plasmid
图 5 酶切鉴定
Fig. 5 Identification by enzyme digestion
2.3 目的基因的 SDS-PAGE 电泳
鉴定成功的阳性工程菌BL21 同时划线选用菌
落摇菌，提取质粒PCR鉴定，阳性菌液按菌液与培
养基 1︰100 比例扩摇，转化空载体pET-28a的BL21
菌作为对照培养过程与阳性克隆同时进行。当A600
值处于 0.7～1.0 时，分别从样品和对照中取出部
分菌液作为未经IPTG诱导的对照，剩余加入终浓
度为 1.0 mmol/L IPTG，诱导 5 h，
心，分离得上清和

M-蛋白相对分子质量标准 1-含空载体工程菌（未诱导）上清
2-含空载体工程菌（诱导）上清 3-阳性克隆（未诱导）上清
4, 5-阳性克隆（诱导）上清
M-protein molecular weight standard
1-engineered strain transfered empty vector supernatant without IPTG
2-engineered strain transfered empty vector supernatant with IPTG
3-positive engineered strain supernatant without IPTG
4, 5-positive engineered strain supernatant with IPTG
图 6 SDS-PAGE 电泳图
Fig. 6 Electrophoretogram of SDS-PAGE
g 分析
PAGE 电泳结果，进行了
Western blotting 分析。因 pET-28a 载体本身含有组
氨酸标签，因此不用做纯化蛋白而直接将表达目的
蛋白提取产物 SDS-PAGE 电泳后，采用电转方式将
蛋白转移到 NC 膜上，5%脱脂奶粉 4 ℃封闭过夜，
用特异结合组氨酸标签的小鼠单克隆抗体 His-Tag
（2A8）Mouse mAb 孵育 1～2 h，辣根过氧化物酶
（HRP）标记的二抗孵育 1～2 h，沉淀型单组分 TMB
底物溶液反应，可以看到明显的特异条带。证明
AeFPS 基因在工程菌 BL21 中成功表达。
3 讨论
龙牙楤木的药理作用与人参相似，有“适应原
样作用”[12]，所以研究龙牙楤木三萜皂苷具有重要
的意义。三萜皂苷的代谢合成途径目前已经明确为
甲羟戊酸代谢途径[3-6]。AeFPS基因催化合成的法呢
二磷酸（FPP）不但是倍半萜类化合物的前体，同
时也是三萜类化合物合成的分支点[4]。AeFPS基因
隆及功能研究已有报道，本研究首
研究龙牙楤木体
2.2 龙牙楤木原核表达载体的构建和阳性工程菌
的获得
目的片段及 pET-28a 经过 BamH I 和 Sac I 双酶
切，纯化、连接，构建重组表达载体。单克隆经 PCR
和酶切检测为 1 000 bp 左右，测序后序列比对确定
AeFPS 克隆到载体 pET-28a 上。
沸 10 min，分别取 25 μL上样，SDS-PAGE电泳结
果显示上清和沉淀中均在 40 000 左右有明显的差
异带（图 6）。这与通过生物信息学软件预测的目
的蛋白大小一致。
取各组菌液离 在多种植物中克
沉淀，分别加入上样缓冲液煮 次在龙牙楤木中克隆到该基因，为
2.4 Western blottin
为了进一步验证 SDS-
M 1 2 3 4 5
97 200
66 400
44 300
39 600
29 900

20 100
14 300
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2 000 bp
1 000 bp
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250 bp
100 bp
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 10 期 2011 年 10 月

• 2096 •
楤木作为药食两用的木本植物，市场需求
量大
科学界的研究热
点，
速表达蛋白，为下一步蛋白纯化以及生物功能分析
奠定了基础。同时也为以后的植物体外实验提供了
理论依据。然而原核细胞与真核细胞存在着差异，
因此该研究只是一个起步，更加深入的机制还有待
进一步研究。
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: 291.

内三萜皂苷合成代谢途径奠定了理论基础。
龙牙
，生长缓慢且周期长，又因为环境污染、资源
的不合理利用等原因，目前已不能满足市场需求。
随着生物技术的发展，以体外实验来模拟体内条件
生产生物体内的化学成分正是目前
采用生物技术缓解资源短缺问题，是中药现代
化的目的之一。本研究把目的基因导入到原核细胞
表达，由于原核生物生长周期短、繁殖快因此可快
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