全 文 ：　　收稿日期:2003-12-30
　　基金项目:吉林省自然科学基金资助项目
文章编号:　0490-0756(2004)06-1259-05
培养因素对龙牙楤木体细胞胚胎发生的影响
李福安1 ,李建民2 ,李喜文3 ,王明宁1 ,邢　苗4
(1.青海医学院中医系 ,西宁 810001;2.青海师范大学生命科学系 ,西宁 810008;
3.东北师范大学遗传与细胞研究所 ,长春 130024;4.深圳大学 ,广东深圳 518060)
摘要:对龙牙楤木 Aralia elate(Miq.)Seen 幼芽体细胞胚胎发生过程中培养基的种类 、2 ,4-
D 、BA 、蔗糖浓度及活性碳等五个培养因素的影响进行了比较研究.结果表明 ,诱导体细胞胚胎
发生的适宜基本培养基为 MS 培养基;蔗糖浓度从 2%提高到 3%诱导率逐渐下降;当
2 ,4-D/BA比值低时 ,有利于体细胞胚胎发生频率的提高 ,但不利于胚状体的产生;当该比值高
时 ,必须添加活性碳才有利于提高体细胞胚胎发生的数量和质量.
关键词:龙牙楤木;组织培养;培养因素;体细胞胚胎发生
中图分类号:Q943　　　文献标识码:A
探索高频率诱导体细胞胚的条件 ,不仅是实现无性系繁殖 ,而且是人工种子研制的核心.龙牙楤木
(Aralia elate(Miq.)Seem)系五加科(Araliaceae)多年生乔本药用植物 ,又称刺老鸦 、鹊不踏(《本草纲
目》);以根及树皮入药 ,能补气 、活血 、祛风 、利湿 、止痛 ,主治慢性病气虚无力 、神经衰弱 、糖尿病 、风湿症肢
节作痛等病症[ 1] .其幼嫩茎叶作为有名的山菜 ,广受我国及东南亚国家人们的喜爱.我们在诱导龙牙楤木
幼芽体细胞胚胎发生和再生植株成功[ 2]的同时 ,对其胚胎发生中基本培养基 、2 , 4-D 浓度 、BA 浓度 、蔗糖
浓度 、活性碳等培养基组分的几个影响因素进行了比较研究.本文报道这些研究的结果.
1　材料与方法
1.1　材料
实验以野生龙牙楤木(Aralia elate (Miq.)Seen)的幼芽为材料.接种的幼芽为 4mm 左右的切段 ,愈
伤组织诱导培养基为 MA(MA 大量[ 3] +MS 微量+MS有机物质)和 MS 培养基 ,均附加 0.5mg/ L 2 ,4-D
+0.5mg/ L BA+0.5mg/L NAA+300mg/L 水解酪蛋白+2%蔗糖+0.7%琼脂 ,pH 调至 5.8 ～ 6.0 ,在温
度 25±1℃,光强 1500 ～ 2000Lx ,每日 16h光照条件下培养.
1.2　方法
比较 MA 、MS 二种培养基的盐浓度和 NH4+浓度 , 确定适宜的基本培养基.将诱导的愈伤组织按
2 ,4-D与 BA比值的高低二组 ,分别进行了植物激素的种类 、浓度及其配比试验.分别进行不同蔗糖浓度 、
不同含量活性碳的交互实验及其含水量测定试验.蔗糖浓度从 2%变动到 5%;活性碳含量从 0.02%变动
到 1%.
2　结果和分析
2.1　基本培养基对胚胎发生频率的影响
2.1.1　基本培养基对愈伤组织诱导的影响　在同样加有 0.5mg/L 2 , 4-D + 0.5mg/ L BA +0.5 mg/L
2004年 12月
第 41卷第 6期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan Universi ty (Natural Science Edition)
Dec.2004
Vol.41　No.6
NAA 的 MA 、MS两种基本培养基上 ,幼芽愈伤组织诱导率不同 ,其中 MA培养基上平均诱导率为93.8%,
MS培养基上则为 85%,且易褐化(表 1).比较表明二种培养基对幼芽愈伤组织诱导有差异 ,MA 培养基易
于诱导外植体愈伤组织.
表 1　基本培养基愈伤组织诱导率比较＊
基本培养基 接种数(块) 成愈数(块) 诱导率(%) 愈伤组织生长状况
MA 48 45 93.8 生长旺盛 、绿色 、紧实
MS 40 34 85 生长快 、浅绿色 、坚硬 、易褐化
　　　＊培养基均加入 300mg/ L 水解酪蛋白 , 20g/ L蔗糖 , pH5.8～ 6.0(除注明外 ,后表均同).
2.1.2　基本培养基对胚胎发生频率的影响　将诱导的愈伤组织在 2 ,4-D浓度提高到 2mg/L 的对应培养
基中继代后 ,转移至加有 0.02%活性碳 MA 、MS 两种培养基上 ,表 2统计结果说明 ,二种培养基对体细胞
胚胎发生频率有不同的影响 ,MS培养基上发生率为 70%,MA培养基上发生率为 64%.相比之下 ,在 MS
培养基上胚胎发生所需时间短 ,平均胚数多 ,表明 MS 培养基更有利于诱导体细胞胚的发生.
表 2　基本培养基对体细胞胚发生的影响
基本培养基 继代块数 胚胎发生块数 胚胎发生率(%) 胚状体出现时间(周) 胚状体发生个数
MA 50 32 64.0 5 +
MS 40 28 70.0 4 ++
　　+示每块愈伤组织上胚状体发生相对较多 , ++示胚状体发生相对多
2.2　外源激素种类 、浓度对体细胞胚胎发生的影响
2.1.2　2 ,4-D浓度对胚胎发生频率的影响　表 3结果表明:2 ,4-D浓度的变化对胚胎发生影响很大.在愈
伤组织继代培养中 ,只有将 2 ,4-D浓度由 0.5mg/L 提高到 2mg/L 时愈伤组织才由块状 、紧实的非胚性愈
伤组织形成致密 、松散的颗粒状胚性愈伤组织;当 2 ,4-D浓度进一步提高 ,愈伤组织严重褐化 ,不利生长 ,
说明 2 , 4-D浓度对愈伤组织生长状态有较大影响 ,2mg/L 2 ,4-D有利于胚性颗粒状愈伤组织的形成 ,加入
活性碳一方面可减轻愈伤组织褐化 ,另一方面对体细胞胚发生率及胚状体的形成有促进影响.
表 3　2 , 4-D 浓度对胚胎发生的影响＊
　　　　MS 培养基+激素(mg/ L)　　
2 , 4-D NAA BA
伤组织生
长速度
胚状体
诱导率(%)
5 周时胚状体
个数/块 愈伤组织生长状态
0.5 0.5 0.5 ++ 0 0 黄色 、块状 、致密 、光滑
2 0.5 0.5 ++ 0 0 黄色、颗粒状 、致密 、松散、四周后渐褐化
3 0.5 0.5 + 0 0 褐化 、紧密 、不规则
2 0.5 　0.5＊＊ ++ 75.0 7 黄褐色 、松散 、出现胚状体
　　＊接入 4块直径约 1cm 愈伤组织块 , 4周后的生长量用“ +”示 , +表示增殖后的愈伤组织大约覆盖 100mL 三角瓶中
　　培养基表面的 1/ 4 ,依次类推(表 4同).＊＊:加 0.02%活性碳 6mg/ L
2.2.2　BA浓度对胚胎发生频率的影响　实验中将诱导的愈伤组织在 2 , 4-D 2mg/L +NAA 0.5mg/L +
BA 0.5mg/L 的相同培养基中继代三次后进行了不同浓度 BA 与 2 ,4-D 、NAA 两种生长素的不同浓度组
合与配比实验 ,结果表明(表 4):在龙牙楤木幼芽的体细胞胚胎发生中适宜浓度的 BA(2mg/L)对愈伤组
织生长有明显的促进作用 ,高浓度 BA(3mg/L)与不同浓度生长素适宜组合有利于体细胞胚胎发育 ,其中
2mg/L BA+0.05mg/L NAA 组合与 3mg/L+0.5mg/L NAA组合 ,胚胎发生率为 100%,其它如 3mg/L
BA +0.5mg/L2 ,4-D 、3mg/L BA 、4mg/L BA+0.5mg/L NAA组合胚胎发生率在 80%以上 ,显然均高于
前述 2mg/L 2 , 4-D+0.5mg/ L NAA+0.5mg/L BA+0.02%活性碳组合 ,但最终形成胚状体所需时间长 、
数量低.上述实验结果可能说明:BA与适宜浓度生长素配比下 ,可能起初对愈伤组织胚胎发生的形成有促进
1260 四川大学学报(自然科学版) 第 41卷
作用 ,而在其后发育中 ,则抑制胚状体的形成.2 ,4-D与 NAA相比 ,后者可能更有利于胚胎发生及胚状体的形成.
表 4　BA浓度对胚胎发生频率的影响
MS 培养基+激素(mg/ L)
BA 2 , 4-D NAA
愈伤组织
生长速度
胚状体
诱导率(%)
平均胚状体
诱导率(%)
8周时每块愈伤
组织平均胚状体数
平均胚
状体数
0.5 0.5 0.5 ++ 0 0 0 0
1 +++ 42.9 37.8 5 7
1 0.05 +++ 33.3 4
1 0.1 +++ 25.0 11
1 0.5 +++ 50.0 7
2 ++++ 50.0 58.0 8 18
2 0.05 ++++ 100.0 41
2 0.1 +++ 44.4 6
2 0.5 ++ 37.4 16
3 ++ 83.3 70.8 11 19
3 0.05 ++ 50.0 7
3 0.1 ++ 50.0 32
3 0.5 ++ 100.0 26
3 ++ 83.3 67.1 11 16
3 0.05 +++ 58.7 24
3 0.1 +++ 42.9 23
3 0.5 ++++ 88.3 5
4 ++ 14.3 39.1 7 14
4 0.05 ++ 22.2 1
4 0.1 ++ 40.0 22
4 0.5 ++ 80.0 27
2.3　蔗糖浓度对胚性愈伤组织形成和胚胎发生频率的影响
表 5结果表明:随着蔗糖浓度的提高(2%～ 4%),颗粒状胚性愈伤组织形成时间缩短 ,而当蔗糖浓度
为5%时 ,颗粒状胚性结构出现时间延长 ,可见适宜浓度的蔗糖有利于胚性愈伤组织的形成.含水量测定
结果显示随着蔗糖浓度的升高 ,愈伤组织含水量下降 ,表明愈伤组织含水量与外界渗透压有直接关系 ,可
能说明约 80%以上的含水量或低于 4%的蔗糖浓度对形成胚性愈伤组织结构有利.在添加 0.02%活性碳
的同一基本培养基上 ,当蔗糖浓度由 2%提高到 3%时 ,含水量明显下降 ,胚胎发生率由 69.2%下降为 63.
9%(参见表 7),胚状体发生所需时间缩短 ,说明体细胞胚胎发生频率的提高 ,与适宜的蔗糖浓度有关.
表 5　不同蔗糖浓度对胚性愈伤组织形成及胚状体形成的影响
MS 培养基+激素(mg/ L)　　
2 , 4-D BA NAA 蔗糖(%) 形状 表面 颜色 质地
含水量
(%)
出现胚性
颗粒结构天数
0.5 0.5 0.5 2 块状 光滑 黄色 致密 、坚硬 94.4 —
2 0.5 0.5 2 颗粒状 较粗糙 浅黄褐色 致密 、松散 93.1 51
2 0.5 0.5 3 颗粒状 粗糙 黄褐色 疏松 、柔软 88.6 43
2 0.5 0.5 4 颗粒状 粗糙 黄褐色 疏松 、柔软 80.1 28
2 0.5 0.5 5 颗粒状 不规则 黄褐色 疏松 、柔软 72.4 35
2 0.5 0.5 2＊ 颗粒状 不规则 黄褐色 疏松 、柔软 92.2 28(胚状体)
2 0.5 0.5 3＊ 颗粒状 不规则 黄褐色 疏松 、柔软 78.4 37(胚状体)
　　＊加活性碳 0.02%
1261第 6期 李福安等:培养因素对龙牙楤木体细胞胚胎发生的影响
2.4　活性碳对胚胎发生频率的影响
表 6实验结果表明:在高 2 , 4-D浓度下 ,龙牙楤木体细胞胚胎发生与活性碳的存在可能是必需的 ,它
有利于胚状体的形成 ,从前述抑制或减轻愈伤组织褐化来看 ,可能与其抑制胚状体形成的代谢产物等有
关[ 3] .为了判明活性碳对龙牙楤木体细胞胚形成的影响 ,我们在 MS-2培养基中分别加入 0.02%、0.2%、
1%的活性碳 ,结果见表 6 ,从胚胎发生形成胚状体形态看.高浓度(1%)活性碳下形成的胚状体个体较大 、
呈白色 、饱满 ,加 0.02%活性碳形成的胚状体则较小 ,半透明 、柔软 ,而加 0.2%活性碳的则介于二者之间 ,
这说明活性碳对龙牙楤木胚状体发生频率和形态都有重要的作用.相比之下 , 0.2%的活性碳适宜于胚胎
的发生 ,获得较好质量的胚状体.比较表 4结果 ,高浓度 BA 下形成的胚状体 ,虽然不需加活性碳 ,且胚胎
发生频率高 ,但其形成时间长 ,平均每块愈伤组织中胚状体个数显著低于添加活性碳的高浓度 2 ,4-D培养基.
表 6　活性碳含量对胚胎发生频率的影响
MS 培养基+激素(mg/ L)　　
2 , 4-D BA NAA
活性碳含量
(%)
胚状体发生率
(%)
胚状体出现
时间(周) 胚状体质量
2 0.5 0.5 0 0 - -
2 0.5 0.5 0.02 69.2 4 个体小 、半透明 、粒状 、柔软
2 0.5 0.5 0.2 77.0 4 个体略大 、乳白色 、饱满 、质地硬
2 0.5 0.5 1 73.7 4 个体大 、白色 、饱满 、质地硬
0 1～ 4 0.5 ～ 1 0 见表 4 7 个体较小 、乳黄色 、细长 、质地硬
2.5　蔗糖浓度 、活性碳二交互因素对胚胎发生频率的影响
二交互因素的实验结果显示:在龙牙楤木体细胞胚胎发生过程中 , MS 培养基中平均胚胎发生率为
71%;2%蔗糖浓度优于 3%,且效果较为明显;活性碳的不同含量对胚胎发生频率有一定的影响 ,0.2%的
活性碳的含量 ,其胚状体形成率高于 0.02%和 1%二组.
表 7　二因素对体细胞胚胎发生的影响＊
因素
蔗糖浓度(%) 活性碳含量(%) 胚胎发生率(%) 平均胚胎发生率(%)
2 0.02 69.2
2 0.2 77.0 73.2
2 1 73.7
3 0.02 63.9
3 0.2 75 68.7
3 1 67
　　　　　＊培养基组成:MS+2 , 4-D 2mg/ L+BA 0.5mg/ L+NAA 0.5mg/ L
3　讨论
经MA 和 MS二种基本培养基的比较发现 ,在外植体愈伤组织诱导时 ,低盐 、低 NH+4 浓度 MA 培养
基较理想;而诱导胚胎发生时 ,以高盐 、高 NH+4 浓度的 MS 培养基效果好.表明龙牙楤木幼芽的体细胞胚
胎发生要求高盐浓度和高 NH+4 浓度.
詹祥灿(1983)[ 5]报道的石刁柏 E3系胚状体发生中 ,生长素(2 , 4-D)与细胞分裂素(KT)比值高低不
同时 ,均有体细胞胚发生.本研究结果与其基本一致 ,所不同的是在高浓度 2 ,4-D(2mg/L)时必须加入活
性碳才可产生胚状体 ,并有利于提高体细胞胚胎发生的数量和质量 ,且该系统较为稳定[ 2] .在高浓度 BA
情况下 ,随着与生长素的不同配比 ,其胚胎发生频率有较大差异 , BA与生长素适宜浓度的配比 ,有利于胚
胎发生频率的提高 ,但形成胚状体所需时间长 、且数量少 ,表现出 BA 对胚状体形成的抑制作用;至于其胚
1262 四川大学学报(自然科学版) 第 41卷
胎发生率与胚状体形成间的关系 ,有待进一步研究.
周思君等(1992)报道[ 6] ,当蔗糖浓度高于 1.5%时 ,大豆幼胚体细胞胚胎发生频率降低.高的蔗糖浓
度能提高玉米幼胚的发生频率[ 7] .而本研究结果表明适宜浓度的蔗糖(4%)对胚性愈伤组织的诱导有利 ,
在胚胎发生过程中 , 2%的蔗糖有利于胚状体的产生.
Fridborg 等(1975)[ 8]和 Hanower等(1982)[ 9]分别报道了在胡萝卜和油椰胚胎发生过程中 ,在含生长
素或含生长素与细胞分裂素的培养基上添加活性碳时 ,直接由愈伤组织产生了胚状体 ,我们在实验中取得
了和他们一致的结果.从不同含量活性碳的作用比较结果 ,可以看出 0.2%的活性碳其胚胎发生率较高 ,
胚状体质量较好.
参考文献:
[ 1] 　吉林省中医中药研究所.长白山植物药志[ M] .长春:吉林人民出版社 , 1982.
[ 2] 　李建民 , 李喜文 ,张德炎 , 等.实验生物学报 , 2001 , 34(2):137-141.
[ 3] 　马铃薯种薯生产协作组.植物学报 , 1976 , 18(3):223-238.
[ 4] 　奚元龄 , 颜敬昌译.植物细胞培养手册[ M] .北京:农业出版社 , 1992.
[ 5] 　詹祥灿.植物生理学报 , 1983 , 9(3):317-324.
[ 6] 　周思君 , 尹光初 ,等.植物学通报 , 1992 , 9(2):38-43.
[ 7] 　Lu C.Theoret.Appl.Genet , 1983 , 62:109-112.
[ 8] 　Fridbo rg G , Eriksson T.Physiol Plant , 1975 , 34:306-308.
[ 9] 　Hanower J , Pannetier C.I n vitro vegetative propagation of the oil palm , Elaeie guieensis Jacq[ M] .Tokyo :Plant Tissue
Culture.Abe Photo Printing Co.L td , 1982.
The Influential Factors of the Somatic Embryogenesis
of Aralia Elate (Miq.)Seem.
LI Fu-an1 , LI Jian-min2 , LI X i-wen 3 , WANG Ming-ning1 , XING Miao4
(1.Dept of Chinese Medicine , Qinghai M edicine College , Xining 810001 , China;2.Dept of Biology ,
Qinghai Normal University , Xining 810008 , China;3.Institute of Genetics and Cy tolog y , Northeast
Normal University , Changchun 130024 , China;4.Shenzhen University , Guangdong Shenzhen
518060 ,China)
Abstract:Five factors which inf luence the frequency of somatic embryogenesis from immature embryos of Ar-
alia elate(miq.)seem ., such as the kind of medium ,2 ,4-D ,BA , swcrose concentration and activated charcoal
w ere studied.The results indicate that the best medium was MS;The ef ficiency of embryogenesis increased as
the sucrose concentration decreased from 2% to 3%.While 2 ,4-D to BA decreased it w as good for heighten-
ing the f requency of somatic embryogensis , but somatic embryoids were not observed.Contrady , i t is good
for increasing quanti ty and quali ty of somatic embryogensis wi th activated charcoal.
Key words:Aralia elate (miq.)seem ;tissue culture;influential factors;somatic embryogenesis
1263第 6期 李福安等:培养因素对龙牙楤木体细胞胚胎发生的影响