全 文 ：第 4 3卷 第 2期
2 0 01 年 6月
实 验 生 物 学 报
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龙牙穗木幼芽体细胞胚胎发生和植株再生 (简报 ) `
李建民 “ 李喜文 张德炎 ` “ 邢 苗 ` “
(东北师范大学遗传与细胞研究所 , 长春 1300 24 )
( “ 青海师范大学生物系 , 西宁 8 10 00 8)
( ” “ 湖北省咸宁教育学院 , 咸宁 4 37 100 )
( ” , ` 深圳大学 , 深习l} 518 060 )
龙牙穗木 [A ar zi a e la t e (M iq . ) 灰 e m」是五加科
穗木属的多年生乔本药用植物 ,又称刺老鸦 ,具有补
气 、 活血 、祛风 、 利湿 、止痛等功效 。 主要分布于我国 `
东北地区 、朝鲜 、 日本和俄罗斯的西伯利亚地 区川 。
其幼嫩茎叶是有名 的山菜 ,在我 国及东南亚一些 国
家很受欢迎 。 但是 ,近些年来由于人为恶性采伐 ,使
龙牙穗木的天然资源遭到 了严重的破坏 , 加之 自然
繁殖力低 、 更新速度慢 ,产量急剧下降 。 本文以长白
山区野生龙牙穗木 〔A ar z故 e勿 at (M iq . ) eS em . 〕的
幼芽为外植体 ,经组织培养诱导出胚性愈伤组织 ,并
以体细胞胚胎发生途径再生出新 的植株 , 建立 了一
整套稳定 、高效的胚状 体再生体系 。 该体系为进行
龙牙穗木种苗的快繁和细胞工程育种等奠定了重要
的基础 。
实验材料 的选取与培养 : 秋末取龙牙穗木落叶
枝条 ,在 2 3 一 2 5 ℃ 室内水浸 。 待其休眠芽萌发长至
1 一 3 Cm 幼芽后剪下 , 用 7 0 % 酒精浸泡 3 0 5 , 然后用
0
.
1% H g 1C 2 溶液灭菌 s m in ,无菌水冲洗 3 一 4 次 ,
在无菌条件下将幼芽切成 4 ~ 左右的切段
, 接种
于改 良的 M S 培 养基上 。 基本 培养基 为 M S 培养
基 , 附加 2 % 蔗糖 、 30 0 gm 几 水解酪蛋白 、 0 , 7 % 琼
脂 , p H 5 . 8 ,添加激素为 ( 1) M S I 培养基 : 0 . 5 m g几
2
,
4 一 D + 0
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5 哩 L/ B A + 0 . 5 m g L/ N A A : ( 2 ) M S
2 培养基 : 2 . 0 1 119几 2 , 4 一D + 0 . s n l g几 B A + 0 . 5
m g L/ N A A
; ( 3 ) M S
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3 培养基 : 2 . 0 哩L/ 2 , 4一 D +
0
.
s m g几 队 + o . s m g几 N A A + 0 . 2 % 活性炭 。
培养温度为 2 5℃ , 每 日 16 h 光照培养 , 光照强度为
1
,
50 0 一 2 , 0 0 0 L u x 。 对于诱导后形成的愈伤组织和
胚状体置于 Ol y m uP S 实体解剖镜下观察 、 照相 。
实验观察结果报告如下 :
愈伤组织诱导与胚性愈伤组织形成
龙牙稳木幼芽切段 接人 M S I 培养基培养 d7
后 ,在切 口 处开始膨大 , 形成淡绿色致密的愈伤组
织 ,且生长旺盛 。 一个月后的统计和观察结果表明 ,
幼芽愈伤组织诱导率为 9 3 . 8% ,愈伤组织的颜色渐
变为浅黄色 (图 1 ) , 其体积 比原始的外植体大约增
加了 2 一 3 倍 。 将其转入 M S Z 培养基 ,愈伤组织长
势为先快后慢 , 培养四周后其表面的部分愈伤组织
转变为褐色 , 同时在另外部分愈伤组织表面产生表
面光滑 、质地紧密的颗粒状结构物 (图 2 , 大箭头所
示 ) ,这些颗粒部分会从愈伤组织表面脱落下来 (图
2
,小箭头所示 ) 。 若单独培养这些颗粒 ,它们可直接
发育成试管苗 。 因此 , 可认定这种愈伤组织为胚性
愈伤组织 。
体细胞胚胎发生及植株再生
将上述胚性愈伤组织转至含有 0 . 2 % 活性炭的
M S 一 3 培养基上 ,其颜色程度有所减弱 , 逐渐呈黄
褐色 , 愈伤组织表面颗粒状结构物的数量也逐渐增
多 ,体积增大 。 培养 3 一 4 周后 , 这些颗粒变为白色
或浅褐色的突起物 (图 3 ) , 其形态特征清晰可辨 ,并
易于从愈伤组织上剥离下来 。 在实体显微镜下观察
发现 , 这些突起物均为处于球形期 、 心形期 、 鱼雷期
和子叶期的体细胞胚 (图 4 一 7) 。 由图 7 中可见子
叶期的胚状体是由两片叶原基和一条较粗胚根所构
成 ,这是体细胞胚具有的典型两极性特征 。 同时 , 在
一些胚性愈伤组织表面还可发现丛生的胚状体 (图
8 )
。 再经 4 一 5 周的培养 ,这些胚状体可发育成幼苗
(图 9 ) ,这些幼苗 的个体形态与正常种子萌发的幼
苗十分相似 (图 10 ) ,具有正常的根 、 茎 、 叶器官 。 将
幼苗转移到含 1% 活性炭 的 1甩 M S 无激素基本培
养基上 , 一个月后可长至 5 Cm 高 、具有 3 一 5 片真叶
的试管苗 (图 1 1 ) 。 开瓶练苗 4 一 s d , 即可移栽成活
(图 1 2) , 成活率达 7 5% 以上 。 经过 3 年的重复实验
证明 ,这套龙牙穗木胚状体再生体系是十分稳定的 ,
在 10 0 m ! 培养瓶内产生的胚状体幼苗均可达 30( )
本文 20 00 年 8 月 10 日收到 。 2 () 00 年 12 月 19 日接受 。
、 吉林省 自然科学基金资助项 目 。
13 8李建民 李喜文 张德炎 邢 苗 34 卷
株以上 ,是进行龙牙槐木种苗快速繁殖 、 细胞工程育
种以及胚状体发生与调控机理研究 的 良好实验系
统 。
外源激素对五加科植物体细胞胚胎发生的影响
自从 2 0 世纪 50 年代末 , 人们在胡萝 卜根组织
培养过程中发现胚状体以来 〔2〕 , 已经从许多种植物
的不同器官 、组织 、 细胞和原生质体培养 中获得了胚
状体 s[, 4〕。 目前 , 关于植物胚状体 的起源及其形态
发生过程也都有 了 比较明确 的结论川 , 但是 , 如何
运用外源激素对 于不 同科 、 属植物的胚状体发生进
行有规律的调控 , 尚无定式可言 。
在体细胞胚的诱导 中外源激素起着非常重要的
作用 s[, 6〕。 aH ! pe ir n阎曾指出 ,胡萝 卜胚状体发生分
为二个阶段 , 第一阶段包括外植体细胞的脱分化 、愈
伤组织的诱导及胚性细胞或细胞团的形成 。 这一阶
段所用的培养基必须添加外源生长 素类物质 ,主要
是 2 , 4一 D ;第二阶段包括胚状体 的形成和发育 ,此 阶
段必须在降低 2 , 4 一D 浓度或完全去除 2 , 4 一D 条件下
才能进行 。 K am ad a 和 aH r ad a[ 6〕研究胡萝 卜离体培
养的工作也进一步证明了这一点 。
然而 , 我们在龙牙穗木幼芽组织培养中发现 ,在
较低浓度的 2 , 4一D ( 0 . 5 m g几 )培养基上 只能产生
可增殖的愈伤组织 , 但未能形成胚性细胞 团 。 只有
将 2 , 4 一D 浓度提高到 2 . o mg 几 时才可获得胚性愈
伤组织 、 胚性细胞团和胚状体 。 看来在龙牙穗木愈
伤组织诱导和胚性细胞或细胞团形成 阶段 , 使用较
高浓度的 2 , 4一D 是十分有利 的 。 这与在胡萝 卜胚状
体诱导时需要去掉 2 , 4 一D 的实验结果 5[ 〕是有很大差
异的 。 这种不同的结果可能是由实验材料之间的差
异引起的 。
有趣的是 ,外源激素对龙牙稳木胚状体发生 的
调控过程与国内 已经报道的五加科中人参 仁7」、西洋
参 〔S }和三七 [” 〕等植 物的胚 状体发生过程 是基本相
似的 ,它们都是在含有以生长素为主要外源激 素的
培养基上直接分化出胚状体的 , 它们之间的区 别仅
在于人参 、 西洋参和龙牙稳木是在含有 2 , 4 一 D 培养
基上进 行胚胎发生 的 , 而三 七胚状 体是 在 IA A 或
N A A 作用下直接诱导形成 的 。 从外 源激素对上述
几种五加科植物胚状体发生的调控 过程来看 , 推测
五加科中其他植物的胚状体发生有可能也具有相似
的过程 , 即需要生长素诱导产生胚性愈伤组织 ,并在
含有较高的生长素培养基上直接获得胚状体 。 这也
许是外源激素诱导五加科植物胚状体发生的一个基
本定式 。
关键词 : 龙牙惚木 幼芽 体细胞胚胎发生 2 , -4 D
参 考 文 献
【1」张继有 、 严仲恺 、李海 日 、 王本祥 、 张文仲 、 赵洪泉 , 1982 ,
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2期 龙牙穗木幼芽体细胞胚胎发生和植株再生 1 39
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14 0 李建民 李喜文 张德炎 邢 苗 34 卷
图 版 说 明
图 版 工
图 1 M SI 培养基上继代培养的愈伤组织 。 xZ
图 2 M S Z 培养基上培养的胚性愈伤组织及胚性颗粒状结构 (箭头所示 )。 x20
图 3 胚性愈伤组织表面发育的胚状体 。 xs
图 4 一 7球形期 (图 4 )。 公形期 ( 图 5 )、 鱼雷期 (图 6 )和子叶期 ( 图 ) 7的胚状体 。 xo l
图 8子叶期的丛生胚状体 。 丫 10
图 9一 10 M S 3 培养基上由胚状体发育的幼苗 。
图 n 在 l左 M S 无激素培养基上培养的小植株 。
图 12 移栽 l个月后的植株 。
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1 40 李建民 李喜文 张德炎 邢 苗 3 4卷
图 版 说 明
图 版 工
图 1 M S I 培养基上继代培养的愈伤组织 。 x Z
图 2 M S Z 培养基上培养的胚性愈伤组织及胚性颗粒状结构 (箭头所示 )。 x 20
图 3 胚性愈伤组织表面发育的胚状体 。 x s
图 4一 7 球形期 (图 4 )。 公形期 (图 5)、 鱼雷期 (图 6)和子叶期 (图 7 )的胚状体 。 x lo
图 8 子叶期的丛生胚状体 。 丫 10
图 9 一 10 M S 3 培养基上由胚状体发育的幼苗 。
图 n 在 l左 M S 无激素培养基上培养的小植株 。
图 12 移栽 l 个月后的植株 。
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