全 文 ：诃子HPLC指纹图谱及模式识别研究
尹春梅1 ,韩世柳2 ,田成旺3 ,张铁军3* ,朱宏吉2*
( 1 吉林农业大学, 吉林 长春 130118; 2 天津大学化工学院,天津 300072; 3 天津药物研究院 ,天津 300193)
摘 要:目的 研究诃子的质量控制方法。方法 采用高效液相色谱建立诃子药材的 HPLC 指纹图谱, 收集了 12
批样品进行测定,并使用主成分分析对指纹图谱进行了模式识别研究。采用 HPLCMS 技术对色谱峰进行了初步
归属。结果 通过主成分分析可知,诃黎勒酸为其中比较重要的指标。结论 本方法为诃子质量控制及综合评价
奠定了基础。
关键词:诃子; 指纹图谱;主成分分析
中图分类号: R286 02 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 09146703
诃子为使君子科植物诃子 T erm inal ia chebula
Retz 或绒毛诃子 T bel l er ica ( Gaertn ) Roxb
的干燥成熟果实,为中国药典 收载品种,在我国产
量丰富。诃子苦、酸、涩、平,归肺、大肠经。具有涩
肠敛肺,降火利咽之功效,用于久泻久痢,便血脱肛,
肺虚喘咳,久咳不止,咽痛音哑。现代药理实验证明
诃子具有抑菌、杀灭或抑制恶性肿瘤细胞等作用, 临
床应用广泛,尤其在藏药和蒙药中最为常用。在藏
药学经典著作晶珠本草 中, 诃子被称为!藏药之
王∀。诃子在蒙药中也是使用频率最高的药物 [ 1]。
诃子富含鞣质成分。由于近年来对大分子酚酸类成
分的化学及生理活性研究较多, 除抑菌、消炎、清热
等作用外,还具有较强的清除自由基作用逐渐引起
人们的注意。又由于大分子酚酸成分的化学不稳定
性,对这类药材的质量控制也备受注意 [ 2]。高效液
相指纹图谱是控制药材质量的良好手段[ 35] , 罗文
等[ 6]建立 10批山楂 HPLC 指纹图谱,显示了精密、
稳定、重现性好的特点。本实验建立了诃子的高效
液相指纹图谱, 对其主要色谱峰进行了归属, 并使用
主成分分析法对指纹图谱进行了模式识别。
1 仪器与材料
Agilent1100高效液相色谱仪, 配置自动进样
器、柱温箱、UV 检测器、Ag ilent 1100色谱工作站;
AB204N 电子天平( M et t ler T oledo ) ; Autoscience
AS3120超声仪; 乙腈、甲醇为色谱纯, 其余试剂为
分析纯;没食子酸对照品购自中国药品生物制品检
定所;诃子样品由中新药业天津第六中药厂提供。
2 方法与结果
2 1 色谱条件:色谱柱为 Diamonsil C18柱( 200 nm #
4 6 mm, 5 m) ; 流动相:甲醇0 1%磷酸溶液, 梯度
洗脱: 0~ 10 m in, 2%甲醇, 10~ 38 min, 28%甲醇,
38~ 80 m in, 32%甲醇, 80~ 92 min, 40% 甲醇, 92
m in 以后, 50% 甲醇; 进样量: 2 L; 测定波长: 280
nm;体积流量: 1 mL/ min; 柱温: 25 ∃ 。
2 2 对照品溶液的制备:精密称取没食子酸对照品
3 25 mg,置 10 mL 量瓶中,加入甲醇9 mL,超声 20
m in,冷却后用甲醇滴定至刻度, 过 0 45 m 滤膜,
即得。
2 3 供试品溶液的制备:称取诃子药材粉末 0 5 g
(过 20 目筛) , 精密称定, 置于圆底烧瓶中, 加入
70%乙醇 50 mL,称定质量, 加热回流 30 min,冷却
补足质量,取上清液用 0 45 m 微孔滤膜滤过, 取
滤液,即得。
2 4 精密度试验:取供试品溶液,连续进样 5次,考
察各共有峰的相对保留时间及相对峰面积比值的一
致性,结果显示各共有峰的相对保留时间 RSD 值在
0 107 8%~ 0 434% ,相对峰面积比值的 RSD值在
0 188 1% ~ 3 253 1%, 均小于 5%。
2 5 稳定性试验:取同一批号的供试品溶液,分别
在 0、3、6、9、12、24 h进样,考察各共有峰的相对保
留时间及相对峰面积比值的一致性, 结果显示相对
保留时间的 RSD值在 0 189 1% ~ 0 872 7%, 相对
峰面积的 RSD值在 0 102 1%~ 4 799 1% ,二者均
小于 5%。
2 6 重现性试验:取同一批号的供试品溶液 5份,
进行测定,考察各共有峰的相对保留时间及相对峰
面积比值的一致性,结果显示相对保留时间的 RSD
值在 0 1282% ~ 1 034% ,相对峰面积的 RSD值在
%1467%中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
* 收稿日期: 20100115 基金项目:国家! 十一五∀科技支撑计划项目( 2006BA06A01)作者简介:尹春梅( 1962 & ) ,女,副教授,从事药用植物栽培和质量评价研究。
* 通讯作者 张铁军 T el: ( 022) 23006848
0 1261% ~ 3 9184% ,二者均小于 5%。
2 7 样品测定: 取 12 批样品, 分别制备供试品溶
液,进样测定,确定 15个共有峰。用中药色谱图的
指纹图谱评价系统 软件( 2004A)进行色谱峰的匹
配,制定了以没食子酸为参照物的标准指纹图谱, 并
制备了 12批样品的叠加图,见图 1。
图 1 没食子酸对照品色谱图( A)、诃子药材标准指纹图
谱( B)和 12 批样品 HPLC叠加色谱图(C)
Fig 1 HPLCChromatograms of gallic acid reference sub
stance (A) , ChebulaeFructus crude drug standard
fingerprint ( B) , and 12 batches of samples ( C)
2 8 色谱峰的归属: 采用液质联用,只将上述流动
相中的磷酸替换为甲酸, 进行测定,并参考相关的文
献报道[ 78] ,对部分主要的色谱峰进行了定性, 结果
见表 1。保留时间为 tR = 47 163 min的 7号峰的质
谱解析见图 2,保留时间为 tR= 58 282 m in 的 10号
峰的质谱解析见图 3。
表 1 诃子色谱峰的成分归属
Table 1 Arrangement of components peaks
in Chebulae Fructus
峰号 tR / min 准分子离子峰 相对分子质量 归属化合物
7 47163 953[ M- H ] - 954 诃黎勒酸
10 58282 955[ M- H ] - 956 诃子酸
2 9 主成分分析: 采用 SPSS 统计分析软件对 12
个样本进行了主成分分析, 即将它们投影至低维空
间来看它们之间的微细差别, 先将 12 # 15的原始数
据矩阵经标准化处理,再对其进行运算,主成分个数
提取原则为主成分对应的特征值大于 1 的前 m 个
主成分。由分析可知, 前 2个主成分的累计贡献率
就可以达到 93 86%, 包含了大部分信息,故提取前
2个特征值。其中,第一主成分为 = 10 197, 方差
贡献率为 72 834%, 贡献率最大,包含的信息最多,
影响也最大。第二主成分为 = 2 944, 方差贡献率
为 21 026%。两个主成分的得分图见图 4, 图中每
个点对应 1 个样本。可见此 12个样本分为 3 类。
每一个载荷量表示主成分与对应变量的相关系数。
初始因子载荷矩阵见表 2。
图 2 m/ z 953 的一级(A)及二级(B)负离子质谱图
Fig 2 Negative ion MS spectra of 1st ( A) and 2nd ( B)
of m/ z 953 ion
图 3 m/ z 955 的一级(A)及二级(B)负离子质谱图
Fig 3 Negative ion MS spectra of 1st ( A) and 2nd ( B)
of m/ z 955 ion
图 4 主成分得分图
Fig 4 Scoring analysis of main principal components
将主成分载荷矩阵中的数据除以主成分相对应
的特征值开平方根便得到两个主成分中每个指标所
对应的系数, 经计算可得主成分的模型为: F1 =
0 2987 19 X 1 + 0 2903 84 X 2 + 0 235 619 X 4 +
0 234 507 X 5 + 0 308 3 X 6 + 0 309 221 X 7 +
0 248 302 X 8 + 0 217 037 X 9 + 0 217 167 X 10 +
0 297 692 X 11 + 0 244 696 X 12 + 0 221 803 X 13 +
0 305 477 X 14 + 0 279 889 X 15 ; F2 = - 0 162 46
X 1 - 0 037 07 X 2 - 0 381 54 X 4 - 0 377 13 X 5 -
0 073 36 X 6 - 0 078 37 X 7 + 0 276 208 X 8 +
%1468% 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
表 2 初始因子载荷矩阵
Table 2 Matrix of initial f actors
峰号 主成分
1 2
1 0 953 882 - 0 278 739
2 0 927 267 - 0 063 600
4 0 752 388 - 0 654 610
5 0 748 837 - 0 647 041
6 0 984 478 - 0 125 873
7 0 987 419 - 0 134 461
8 0 792 888 0 473 894
9 0 693 051 0 686 417
10 0 693 466 0 676 791
11 0 950 603 - 0 296 406
12 0 781 374 0 511 267
13 0 708 271 0 643 067
14 0 975 461 - 0 187 037
15 0 893 752 - 0 171 121
0 400 076 X 9 + 0 394 466 X 10 - 0 172 76 X 11 +
0 297 99 X 12 + 0 374 81 X 13 - 0 109 01 X 14 -
0 099 74 X 15。
两个主成分中, F1 是特征值最大的, 而第一主
成分中系数最大的为 X 7 ,即为峰 7相对于峰 3的面
积经标准化数值, 从归属图上可知, 峰 7为诃黎勒
酸,证明诃黎勒酸的量在诃子的质量控制中起着相
对比较重要的作用。
3 讨论
3 1 流动相的选定: 选用不同比例的甲醇水磷
酸、乙睛水磷酸等流动相体系, 进行试验对比, 以
确定最佳流动相的组成及洗脱梯度。结果表明, 乙
睛水磷酸系统, 药材中的组分分离不理想。甲醇
水磷酸系统,各组分均可基线分离,故选择甲醇水
磷酸系统为流动相。
3 2 检测波长的选择: 取供试品溶液, 进样 2 L,
进行 210~ 400 nm 的全波长扫描,并各波长下的色
谱图进行分析比较。结果表明, 在 280 nm 时图谱
中可以尽可能地获取色谱组分信息以反映体系组成
的全貌,因此选择 280 nm 作为检测波长。
3 3 提取方式的选定:试验了水、30%乙醇、50%乙
醇、70%乙醇提取, 结果表明 70%乙醇相比其他几
种溶剂,提取的成分多,故选用 70%乙醇作为提取
溶剂。另外,比较了超声提取与回流提取,发现回流
提取出的峰较多, 提取率较高, 因此, 样品采用回流
提取。
参考文献:
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定[ J] 中国药科大学学报, 2001, 32(2) : 9193
醋柳黄酮固体分散体的制备研究
谢 燕,邹珊珊,李国文* , 荣 蓉,蔡贞贞*
(上海中医药大学, 上海 201203)
摘 要:目的 将醋柳黄酮制成固体分散体, 提高醋柳黄酮中有效成分的体外溶出。方法 以溶出度为指标,选择
载体;通过单因素和正交试验筛选最佳制备工艺 ,制备固体分散体。结果 醋柳黄酮固体分散体的优化制备工艺
为:醋柳黄酮与 Polaxamer188比例为 1∋ 4,以每 7 5 g 固体分散体溶于 200 mL 80%乙醇中, 超声 25 min, 挥发溶
剂, 4 ∃ 固化 10 h, 研成小块,干燥 24 h, 取出研细,得醋柳黄酮固体分散体。结论 以 Po laxamer188 为载体制备的
醋柳黄酮固体分散体体外溶出迅速,可用于制备速效、高效的醋柳黄酮口服制剂。
关键词:醋柳黄酮; 固体分散体; P olaxamer188;溶出度
中图分类号: R286 02 文献标识码: B 文章编号: 02532670( 2010) 09146905
%1469%中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
* 收稿日期: 20100130 基金项目:上海市自然科学基金资助项目( 09ZR1431700) ;上海市教育委员会预算内科研项目( 09jw 22)作者简介:谢 燕( 1978 & ) ,女,重庆璧山人,硕士,助理研究员,主要从事中药新制剂与新剂型的研究与开发。
T el : (021) 51322044 Email: rosexie_2004@ 163 com
* 通讯作者 李国文 T el: ( 021) 51322042 Fax : ( 021) 51322043 Email : lgw shutcm@ 163 com