全 文 ：1
4% ,酶解温度为 45
。
2
3
3
验证试验:分别按上述酶解最优提取工艺条
件提取人参皂苷 Rg1 ,重复进行 3次平行试验。结
果,人参皂苷 Rg1 提取率为( 2
05
0
047) mg/ g,
与正交试验最大值 2
06 mg/ g 接近。
3
讨论
本实验结果提示,与传统水提和醇提相比,采用
纤维素酶酶解提取人参皂苷 Rg1 提取率更高, 溶剂
用量减少, 对设备无特殊要求, 适合于工业化大生
产。酶解法提取最佳工艺条件为, 酶解时间 60
min, 纤维素酶用量为 1
4 % , 酶解温度为 45
。
酶解后用水回流提取 2次, 每次 1 h。优化后的提取
工艺稳定、可行。
参考文献
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清咽滴丸极性成分的高效液相指纹图谱及其模式识别的研究
张铁军1 ,韩世柳2 ,田成旺1 ,朱宏吉2*
( 1
天津药物研究院,天津
300193; 2
天津大学化工学院, 天津
300072)
摘
要: 目的
研究清咽滴丸的质量控制方法。方法
采用高效液相色谱建立了清咽滴丸极性部分的 H PLC 的指
纹图谱, 收集了不同批次的 12 批产品进行测定,并使用主成分分析对指纹图谱进行了模式识别研究。采用 H PLC-
DAD 技术进行了药材与制剂的相关性分析。结果
通过主成分分析可知, 甘草苷为其中比较重要的指标。相关
性研究表明,所确定的共有峰中有 6 个色谱峰来自甘草, 5 个色谱峰来自诃子。结论
此方法可较系统地用于清咽
滴丸的质量控制。
关键词:清咽滴丸; 指纹图谱;主成分分析
中图分类号: R286
02


文献标识码: A


文章编号: 0253-2670( 2010) 08-1282-04
HPLC Fingerprint and chemical pattern recognition method of polar components
in Qingyan Dropping Pill
ZHANG T ie- jun1 , HAN Sh-i liu2 , T IAN Cheng-w ang1 , ZHU Hong- ji2
( 1
T ianjin Inst itute of Pharmaceutical Resear ch, T ianjin 300193, China; 2
Schoo l o f Chemical Eng ineering
and Techno lo gy , T ianjin Univer sity, T ianjin 300072, China)
Abstract: Objective
T o establish a method for the quality cont ro l of Qingyan Dropping Pill
Methods
An HPLC method w as developed to establish the f ing er print of polar components in Qingyan Dr opping
Pill, and 12 samples f rom various batches w ere analy zed. Furthermo re, principal component analysis
( PCA) w as used to dif ferent iate and evaluate the w hole f ingerprints
T he relat ionship betw een Qingyan
Dropping Pill and their original her bs w ere invest igated w ith HPLC-DAD method
Results
T he result
show ed that liquir it in w as the key component of quality cont ro l
Among the chromatogr aphic peaks, there
w ere six chromatog raphic peaks coming f rom Gly cy r rhiz ae Radix et Rhiz oma; F ive chromatographic
peaks coming from Chebulae Fr uctus
Conclusion
This method can be used as quality contr ol for Qingyan
Dropping Pill

Key words: Qingyan Dr opping Pill; f ingerprint ; principal component analysis ( PCA)

1282
中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
* 收稿日期: 2009- 10-15
























清咽滴丸由甘草、诃子、青黛、人工牛黄、薄荷
脑、冰片 6味药材组成, 具有疏风清热、解毒利咽之
功效。目前清咽滴丸的质量控制主要是以靛蓝、靛
玉红、冰片和薄荷脑的薄层色谱鉴别和胆红素的测
定来实现的。指纹图谱是顺应中药多组分、多靶点
的整体综合作用的特点, 从
全成分
的角度出发的
一种现代中药质量控制方法, 现已成为国内外广泛
接受的中药质量控制评价模型 [ 1-4]。为了全面控制
其质量,本实验对清咽滴丸的指纹图谱进行了研究,
建立了清咽滴丸极性部分的 HPLC 指纹图谱, 采用
HPLC-DAD技术进行了药材与制剂的相关性分析,
同时结合主成分分析, 为中药的质量控制提供了一
种直观、简便、有效的手段。
1
仪器与材料
Agilent 1100高效液相色谱仪, 配置自动进样
器、柱温箱、UV 监测器、Agilent 1100色谱工作站;
Waters2695高效液相色谱仪, Waters996PDA 检测
器, Empow er Waters色谱工作站; AB204
N电子天
平: ( Mett ler Toledo ) ; Autoscience AS3120超声仪。
乙腈 (色谱纯,天津市天河化学试剂厂) ; 甲醇
(色谱纯,天津市康科德科技有限公司) ; 乙醇 (分析
纯,天津市天河化学试剂厂) ;磷酸(分析纯,天津市天
河化学试剂厂) ;样品来源于天津中药六厂,见表 1。
表 1
样品来源
Table 1
Source of samples
编号 批号 编号 批号 编号 批号
S1 627027 S5 627032 S9 627037
S2 627029 S6 627033 S10 627040
S3 627030 S7 627035 S11 627055
S4 627031 S8 627036 S12 627058
2
方法与结果
2
1
色谱条件:色谱柱为 Diamonsil C18柱( 200 mm

4
6 mm, 5
m) ;流动相乙睛-0
1%磷酸溶液;进样量 10

L;波长260 nm;体积流量 1 mL/ min;柱温25
;洗脱
梯度见表 2。
表 2
洗脱梯度
Table 2
Gradient elution
时间/ min 乙睛/ % 0
1%磷酸/%
0 2 98
10 12 88
20 15 85
35 28 72
60 48 52
65 60 40
85 69 31
2
2
对照品溶液的制备
2
2
1
没食子酸对照品溶液的制备:精密称取没食
子酸对照品 3
25 mg, 置 10 mL 量瓶中, 用甲醇定
容,超声 20 min, 冷却后补足质量, 过 0
45
m 滤
膜,即得。
2
2
2
甘草酸对照品溶液的制备: 精密称取甘草酸
对照品 2
58 mg,置 10 mL 量瓶中,用甲醇定容,超声
20 min,冷却后补足质量,过 0
45
m滤膜,即得。
2
2
3
甘草苷对照品溶液的制备: 精密称取甘草苷
对照品 0
54 mg,置 10 mL 量瓶中,用甲醇定容,超声
20 min,冷却后补足质量,过 0
45
m的滤膜,即得。
2
2
4
混合对照品溶液的制备:分别量取 1 mL 没
食子酸对照品溶液、甘草酸对照品溶液、甘草苷对照
品溶液,组成混合对照品溶液。
2
3
供试品溶液的制备:将清咽滴丸置于研钵中研
成粉末状,称取 1
000 g 药粉,置于 100 mL 圆底烧
瓶,加入25 mL 70% 乙醇水溶液,称定质量,回流提
取 2 h,冷却后称定质量, 用 70% 乙醇溶液补足失
重,滤过,作为供试品溶液。
2
4
方法学考察
2
4
1
精密度试验:取供试品溶液, 连续进样 5次,
考察各共有峰的相对保留时间及相对峰面积比值的
一致性, 结果显示各共有峰的相对保留时间 RSD值
为 0
49% ~ 1
52% , 相对峰面积比值的 RSD 值为
0
41%~ 3
28%, 均小于 5%, 表明该方法的精密度
良好。
2
4
2
稳定性试验:取同一批号的供试品溶液,分
别在 0、3、6、9、12、24 h 进样,考察各共有峰的相对
保留时间及相对峰面积比值的一致性, 结果显示相
对保留时间的 RSD 值为 0
41% ~ 1
55% , 相对峰
面积的 RSD 值为 0
27% ~ 4
75%, 二者均小于
5% ,表明该方法的稳定性良好。
2
4
3
重现性试验: 取同一批号的供试品溶液 5
份,进行测定,考察各共有峰的相对保留时间及相对
峰面积比值的一致性, 结果显示相对保留时间的
RSD值为 0
07% ~ 0
66%, 相对峰面积的 RSD值
为 0
29% ~ 4
33% ,二者均小于 5% ,表明该方法的
重现性较好。
2
5
样品测定:取不同批次的 12批样品分别制备供
试品溶液,测定,确定 17个共有峰。用
中药色谱图
的指纹图谱评价系统
软件( 2004A)进行色谱峰的匹
配,对照品色谱图见图 1,以没食子酸( S)为参照物的
标准指纹图谱见图 2, 12批样品的叠加图见图 3。
2
6
主成分分析:主成分分析是将原来众多具有一
定相关性的指标重新组合成一组相互无关的综合指
标来代替原来指标的统计方法, 也是数学上处理降

1283
中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
维的一种方法[ 5] 。实验采用 SPSS 统计分析软件对
此 12个样本进行了主成分分析,即将它们投影至低
维空间来看它们之间的微细差别, 先将 12
17的原
始数据矩阵经标准化处理,再对其进行运算, 主成分
个数提取原则为主成分对应的特征值大于 1的前 m
个主成分。结果 3个主成分的累计贡献率就可以达
到 89
695% ,包含了大部分信息, 故提取前 3 个特
征值。其中,第一主成分为
= 8
886, 方差贡献率
为 55
539%, 贡献率最大,包含的信息最多, 影响也
最大; 第二主成分为
= 4
393, 方差贡献率为
27
454%, 第三主成分为
= 1
0722,方差贡献率为
6
7014%。取前 3个得分矢量来做图, 见图 4。图
中每个点对应 1个样本, 12个样本分为 3类。


表 2为初始因子载荷矩阵, 每一个载荷量表示
主成分与对应变量的相关系数。将主成分载荷矩阵
中的数据除以主成分相对应的特征值开平方根便得
图 4
主成分得分图
Fig
4
PCA Figure
表 2
初始因子载荷矩阵
Table 2
Initial factor loading matrix of PCA
峰号 主成分
1 2 3
2
0
894 1 - 0
183 7
0
019 3
3
0
557 0 - 0
206 0 - 0
146 0
4
0
957 8 - 0
088 0 - 0
198 5
5
0
912 9 - 0
282 0 - 0
253 6
6
0
655 9 - 0
128 9 - 0
528 7
7
0
964 3 - 0
080 8 - 0
177 2
8
0
830 9 - 0
129 9
0
146 8
9 - 0
176 8
0
978 4
0
052 2
10
0
951 5
0
098 9 - 0
196 8
11 - 0
078 5 - 0
992 2
0
003 4
12 - 0
670 1
0
681 9
0
177 0
13 - 0
258 0
0
952 0 - 0
060 0
14 - 0
537 5
0
830 1
0
106 1
15 - 0
207 6 - 0
959 9
0
151 7
16 - 0
389 2
0
916 8
0
062 7
17 - 0
190 1 - 0
080 8
0
951 6
到 3个主成分中每个指标所对应的系数, 经计算可
得主成分的模型为:


F1= 0
100 6 X2 + 0
062 7 X 3+ 0
107 8 X4 + 0
102 7
X 5+ 0
073 8 X 6+ 0
108 5 X 7+ 0
093 5 X 8- 0
019 9 X 9+
0
107 1 X 10 - 0
008 8 X 11 - 0
075 4 X 12- 0
029 0 X 13 -
0
060 5 X 14- 0
023 4 X 15- 0
043 8 X 16- 0
021 4 X17
F2= - 0
041 8 X 2 - 0
046 9 X 3 - 0
020 X 4- 0
064 2
X 5- 0
029 3 X 6- 0
018 4 X 7- 0
029 6 X 8+ 0
222 7 X 9+
0
022 5 X 10 - 0
225 9 X 11 + 0
155 2 X 12+ 0
216 7 X 13 +
0
189 0 X 14- 0
218 5 X 15+ 0
208 7 X 16- 0
018 4 X17
F3= 0
018 0 X 2 - 0
136 3 X 3- 0
185 1 X 4 - 0
236 5
X 5- 0
493 1 X 6- 0
165 3 X 7+ 0
136 9 X 8+ 0
048 7 X 9-
0
183 6 X 10 + 0
003 1 X 11 + 0
165 1 X 12- 0
056 1 X 13 +
0
099 0 X 14+ 0
141 4 X 15+ 0
058 5 X 16+ 0
887 5 X17
F1、F2、F3分别表示 3个主成分, X 2、X 3 ,


X 17分别表示各个色谱峰的相对于标准峰(峰 1)的
相对峰面积经标准化后的数据。
3个主成分中, F1 是特征值最大的, 即是
信息

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中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
最多
的指标,而第一主成分中系数最大的为 X 7 , 即
为峰 7相对于峰 1的面积经标准化数值, 从对照品
色谱图可知,峰 7为甘草苷,证明甘草苷在清咽滴丸
的质量控制中起着相对比较重要的作用。
2
7
色谱峰归属的初步判断:采用 HPLC-DAD技术
进行了药材与制剂的相关性分析。通过色谱保留时
间和紫外吸收光谱图鉴定了清咽滴丸中色谱峰的生
药来源,通过阴性对照进一步对其色谱峰进行确认。
共确定了 11个色谱峰的药材来源,其中, 5、7
11号
6个色谱峰来自甘草, 1~ 4、6号 5个色谱峰来自诃子
(见图5、6) ,这为追踪成药质量与生药质量的相关性
和建立可行的质量标准提供了依据。
图 5
清咽滴丸高极性部分与甘草( A)和缺甘草阴性(B)
色谱指纹图谱镜像图
Fig
5
Fingerprint of shared peaks between high


polar components in Qingyan Dropping
Pill with Glycy rrhizae Radix et Rhizoma
( A) and negative sample withont Glycyrrhizae
Radix et Rhizoma ( B)
3
讨论
流动相的选定: 选用不同比例的甲醇-水-磷酸、
乙腈-水-磷酸等流动相体系进行试验对比, 以确定
最佳流动相的组成及洗脱梯度。结果表明, 使用甲
醇-水-磷酸系统时, 制剂中组分分离不理想。使用
图 6
清咽滴丸高极性部分与诃子色谱指纹图谱镜像图
Fig
6
Fingerprint of shared peaks between high
polar components of Qingyan Dropping Pill
with Chebulae Fructus ( A) and negative
sample without Chebulae Fructus (B)
乙腈-水-磷酸系统时,各组分均可基线分离,故选择
乙腈-水-磷酸系统为流动相。


检测波长的选择: 取供试品溶液,进样 10
L,
进行 210~ 400 nm 全波长扫描,并各波长下的色谱
图进行分析比较。结果表明, 在 260 nm, 从图谱中
可以尽可能地获取色谱组分信息以反映体系组成的
全貌,因此选择 260 nm 作为检测波长。
提取方式的选定: 比较了水、30%乙醇、50%乙
醇、50%甲醇、70%乙醇提取, 结果表明 70%乙醇相
比其他几种溶剂提取的成分多,故选用 70%乙醇作
为提取溶剂。另外,比较了超声提取与回流提取,发
现回流提取出的峰较多, 提取率较高,因此,样品采
用回流提取。
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中草药
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