全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 10 期 2011 年 10 月

• 2125 •
张
666100
草进行遗
源保存及遗传育种等研究提供一定的理论依据。方法 采用 ISSR 分子
结果 从 行扩增，共扩增得
位点百分率
我国珠
025 6
yll th
ZH a, SONG
in
pula

清
1988 年，诺贝尔奖获得者Blumbetrg博士
与印度
外
分析，为珠子
草遗传
1 材
1.1
共 30 份，经中国医学科学院药用植物
Phyl
集当年
1.2
引物
聚合 物工程有限公司，DR001B）包
液（
mmo
（
（Qili
siona ），电泳仪（Biometra 公司），凝胶

珠子草遗传多样性的 ISSR 分析
忠廉，唐德英，张丽霞，宋美芳，李学兰*
中国医学科学院 药用植物研究所云南分所，云南 景洪
摘 要：目的 对分布于我国及缅甸、老挝 30 个居群的珠子
南及缅甸、老挝共 30 个珠子草居群进行多态性和聚类分析。
到条带 158 条，其中共有条带 43 条，多样性条带 115 条，多态
Shannon’s 多态性信息指数（I）为 0.676 0，多态性较高。结论
明显的居群特异性，种质资源遗传多样性较高。
关键词：珠子草；遗传多样性；ISSR；居群; 聚类分析
中图分类号：R282.1 文献标志码：A 文章编号：
ISSR analysis on genetic diversity in Ph
传多样性分析，为珠子草遗传连锁图谱构建、种质资
标记技术，对采自我国云南、广西、广东、福建、海
60 个 ISSR 引物中筛选出 23 条进
（PPB）为 72.78%，Nei’s 基因多样性（H）为 0.483 2，
子草居群大致分为沿海及内陆两大类，个别居群呈现
3 - 2 70(2011)10 - 2125 - 05
an us nriuri
Mei-fang, LI Xue-lan ANG Zhong-lian, TANG De-ying, ZHANG Li-xi
Yunnan Branch of Institute of Medicinal Plant Development, Ch
Key words: Phyllanthus nriuri Linn.; genetic diversity; ISSR; po
珠子草Phyllanthus nriuri Linn. 为大戟科叶
下珠属植物，又名苦味叶下珠、月下珠、小返魂、
霸贝菜，滇南傣族民间称“水米草”，为我国与印
度民间传统草药，药用全草，具有平肝 热、利
水解毒之功效，用于治疗肠炎、肝炎、痢疾、尿
路感染、无名肿痛等症状，还可用于治疗小儿疳
积、黄疸肝炎等病症[1-3]，一年生草本，在我国主
要分布于云南、广东、广西、海南等热带、亚热
带地区。
ese Academy of Medical Sciences, Jinghong 666100, China
tion; cluster analysis
料和方法
材料
所用样品
学者协作报道珠子草对治疗慢性乙型肝炎
病毒携带者有显著疗效[4]，自此以后，国内 关
于珠子草的研究报道日益增多，使人们对珠子草
有更深入的了解[5-6]。但随之而来的是人们对珠子
草野生资源的肆意采收，使其野生资源日益匮乏。
本实验采用ISSR分子标记技术对来自我国云南、
广东、广西、海南、福建 5 个省份及缅甸、老挝
不同居群的珠子草进行遗传多样性
图谱的构建、种质资源的保存及遗传育种
等研究提供一定的理论依据。

研究所云南分所唐德英研究员鉴定为珠子草
lanthus nriuri Linn.，具体样品来源见表 1。收
生新鲜嫩叶，经硅胶快速干燥后带回实验
室，−20 ℃低温保存。
试剂与仪器
DNA提取试剂盒：TIANGEN（DP305）；ISSR
，上海生工生物技术有限公司合成；rTaq DNA
酶（大连宝生
括：TaKaRa Taq DNA聚合酶（5 U/μL），10×缓冲
Mg2+），dNTP（各 2.5 mmol/L），MgCl2（25
l/L）；Marker，北京鼎国生物技术有限公司
B031）；其他试剂均为分析纯。
离心机（Eppendorf, Centrifuge 5424），振荡器
nbeier, QL-861），扩增仪（Biometra Profes-
l Standard
成像系统（Uvtec 公司, Uvixs-D55-20M）。

期：2011-04-13
，硕士研究生，
3.com
8183210 E-mail: xlli_212@163.com
收稿日
作者简介：张忠廉（1982—），男，山西省阳泉市人，助理研究员
物分子生物学。Tel: 15924692393 E-mail: zzl0605@16
*通讯作者 李学兰 Tel: 1398
从事药用植物种质资源方面的研究，主要研究方向为药用植
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 10 期 2011 年 10 月

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种质资源
m re
表 1 珠子草
Table 1 Germplas
来源
sources of P. nriuri
经 度 纬 度 海拔/m编 号 采集地
1 云南省勐海县打洛镇 100°08′07.2″ 21°43′06.7″ 702
2 广西崇左市宁明县寨安乡
3 云南省景洪市勐养镇
10 ′ 150
10
10
10 .3″ 508
10
10
1 10
1 10 21°51′40.03″ 534
12 云南省玉溪市元江县东峨镇 101°51′09.9″ 23°41′03.7″ 770
14 海南省昌江县霸王岭 109°07.674′ 19°05.969′ 378
15 云南省红河州元阳县 23°11′41.7″ 290
16 海南省万宁县兴隆镇 109°29′999″ 19°30′887″ 57
17 海南省儋州市 109°30.048′ 19°30.855′ 100
广东省茂名市电白县
117°41.770′ 24°33.033′ 20
24 .
′13.9″ 21°16′53.7″ 616
26 云南省普洱市江城县 ′ 22°31.496′ 928
27
99°09′43.8″ 23°36′44.5″ 541
7°03.675′ 22°05.320
100°53′28.3″ 22°06′27.0″ 748
0°40′57.2″ 21°35′05.9″ 624
0°28′13.9″ 22°23′12.4″ 808
1°45′21.8″ 23°50′09
4 云南省景洪市勐龙镇
5 云南省景洪市勐海县勐往乡
6 云南省玉溪市新平县漠沙镇
7 云南省玉溪市新平县嘎洒镇
8 缅甸南板县
101°35′18.5″ 24°00′38.5″ 521
0°39′60.5″ 21°23′32.8″ 487
8°22′254″ 22°51′600″ 136
2°00′21.5″ 23°35′44.4″ 384
1°58′56.05″
9 广西省南宁市南药园
0 云南省玉溪市元江县李江镇
1 云南省景洪市橄榄坝
13 云南德宏州瑞丽市 98°02′57.2″ 24°04′49.9″ 844
102°56′07″
18 111°00.033′ 21°30.627′ 30
19 福建省厦门鼓浪屿 118°03.463′ 24°26.703′ 10
20 云南省红河州河口县 103°55′53.5″ 22°31′59.9″ 92
21 福建省漳州市
22 云南省景洪市勐仑镇 101°14′24″ 21°56′08.6″ 619
23 云南省景洪市勐腊镇 101°33′47.3″ 21°28′43.2″ 641
云南省景洪市勐腊县关累镇 101°15′32.8″ 21°42′39 2″ 583
25 云南省景洪市勐腊县勐满镇 101°18
101°44.161
老挝琅勃拉帮省南坎县 102°23′59.0″ 20°34′33.9″ 385
28 老挝琅勃拉邦 102°08′12.1″ 19°53′08.00″ 277
29 云南省临沧市永德县永康镇 99°27′47.2″ 24°11′46.9″ 894
30 云南省临沧市耿马县孟定镇

1.3
.1 基因组 DNA 的提取 药材经灭菌水清洗晒
干后，液氮充分研磨，按照天根生物技术有限公司
生产的 DP305 型植物 DNA 快速提取试剂盒的方法
提取基因组 DNA。 DN
胶电泳检测，
适当稀释后，
.2 PCR反应 ISSR
ol/L、dNTP 0.2 mmol/L、引物 0.5 μmol/L、
TaqDNA聚合酶 1.25 U、缓冲液 2 μL和模板DNA
20～50 ng，加dd H2O至 20 μL。
PCR 扩增程序：94 ℃预变性 4 min；接着进行
30 个循环：94 ℃变性 45 s，50～55 ℃（因引物序
45 s，72 ℃延伸 2 min；
循环结束后 72 ℃延伸 10 min。各取 PCR 反应液 5
μL 缓冲液，在 2%琼脂糖凝胶上电泳，电
0 V，电 90 min，经溴化乙锭（EB）染色后

引物序列按照加拿大哥伦
生物技术实验室的 ISS 引物序列设计，
共 60 个引物。
从 60 个 ISSR 引物中筛选出扩增条带清晰、多样性
好、重复性高的 ISSR 引物用于样品的遗传多样性
分析，每个选定的引物重复扩增 2 次。每条引物退
火温度进行摸索，使之达到最好扩增效果。
1.3.4 数据统计 利用所筛选出的引物扩增所有
ISSR-PCR 反应 列不同退火温度不同）退火
1.3
所提 A 样品经 0.8%琼脂糖凝 在凝胶成像仪上观察并照相记录。
3 引物筛选 ISSR核酸蛋白分析仪测其原始质量浓度，
−20 ℃保
1.3.
R存备用。
反应体系为 20 μL：Mg2+ 1.5
比亚大学
由上海生工生物技术有限公司合成，1.3
mm
μL，加 1
压 10 泳
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 10 期 2011 年 10 月

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珠子草样品，扩增电泳 2 次。针对某一同源带（同
记
为“1”，无条带的记为“0”，生成 0、1 二态性数
据 出
现
多态性位点百分率（PPB）、Nei’s 基因多样性（H）、
应
品在该位点存在差异。对 60 个 ISSR 引物进行筛选，
好的引物用于 ISSR-PCR 分析，具体引物序列、退火
温度及条带扩增数见表 2。用筛选出的引物对 30 份
材料进行 PCR 扩增，并对扩增片段进行统计分析。
大部分条带长度在 200～2 000 bp，不同引物扩增的
数在 3～11，平均每个引物检测到 7 个位点，形
成了带型丰富、片段大小及其组合不同的电泳图谱。
指标可以说明各居群间彼此遗传关系的远近，30 个
居群间的 GS 系数在 0.626 6～0.968 4，其中样品 2
最高，达到 0.968 4，样
品 8 与 28 间的遗传关系最远，GS 仅为 0.626 6。
的遗传多样性相当丰富。
编 号 引物序列 退火温度/℃ 总扩增条带数 共有条带数 编 号 引物序列 退火温度/℃ 总扩增条带数 共有条带数
一引物扩增的电泳迁移率一致的条带）有条带的
矩阵；对于较弱条带，如在重复性试验中反复
，赋值 1。利用 PopGene32 对其进行分析，统计 位点
Shannon’s 信息指数（I）；根据 Nei’s 遗传距离，采
用NTSYS-pc2.1分析软件的UPGMA法进行系统聚
类分析，构建系统聚类图。
2 结果与分析
2.1 引物筛选及遗传多样性分析
图 1、2 为引物 UBC855 对 30 个样品的扩增结果。
共扩增得到 158 条条带，其中共有条带数 43，
多样性条带数 115，PPB 值为 72.78%，H 值为 0.483
2， I 值为 0.676 0，多态性较高。遗传相似系数（GS）
对于显性标记的 ISSR，每一条扩增条带都对
着一个 DNA 分子位点，出现多态性扩增带，说明样 与 9、10 与 12 间的 GS 值
共筛选出 23 个扩增条带较多、谱带清晰、多态性较 总体上，各居群间
表 2 所筛选出的引物及引物扩增条带数
Table 2 Screened primers and their amplification bands
UBC 807 (AG)8T 52 5 3 UBC 844 (CT)8RC 55 6 1
UBC 809 (AG)8G 54 6 3 UBC 845 (CT)8RG 55 5 1
UBC UB 53 6 2 810 (GA)8T 52 4 3 C 846 (CA)8RT
UBC 818 (CA)8G 54 8 1 UB RC 55 7 3 C 847 (CA)8
UBC 821 (CA)8T 52 7 1 UBC 848 (CA)8RG 55 11 2
UBC 825 (AC)8T 52 10 4 UBC 850 (GT)8YC 55 6 1
UBC 827 (AC)8G 54 10 2 UBC 851 (GT)8YG 55 7 0
UBC 828 (TG)8A 52 7 0 UBC 853 (TC)8RT 53 3 1
UBC 831 (AC)8YA 53 6 4 UB 8 2 C 855 (AC)8YT 53
UBC 834 (AG)8YT 53 4 2 UB 7 3 C 856 (AC)8YA 53
UBC 840 (GA)8YT 53 5 0 UBC 857 (AC)8YG 55 11 3
UBC 841 (AG)8YC 55 8 1

2.2 聚类分析
根据样品居群间GS值，运用UPGMA（unweighted
群亲缘关系远近与其地理分布距离及气候类型有
直接关系，样品采集地点地理位置距离越远，样
本的亲缘关系越远，距离越近，亲缘关系越近。
首先是样品 8、28、14 各成一支

pair-group method with arithmetic-means）方法进行聚
类分析，所得聚类结果见图 3。总体上看，各居
，说明此 3 份样
在 GS 为 0.81
时分 南省内部分居群组成，包
括来
另一
虽同 挝的 遗传距离较
仅为 ，样品 28 自成一支，样品 27
却
，进
一步证明珠子 同居 样性。
3 讨论
平均 20 ℃，相对湿度 75%以上，多生长于路侧、
品与其他居群均有较大的遗传距离；
为两大支，一支由云
自景洪、临沧、德宏、玉溪、普洱地区的样品； 珠子草，一年生草本植物，喜湿热，生长温度
支以广西、广东、福建、海南等沿海地区样品
为主要组成部分，其中还包括来自云南省红河州、
景洪市勐腊县等地区的样品。值得注意的是，样品
27 与 28 是来自老 样品，但二者
大，GS 0.740 5
与来自广西、景洪勐腊地区的样品聚为一支；样
品 14、16、17 均为来自海南省境内的样品，但样品
14 独立为一支，样品 16 与 17 聚为一支，且与样品
14 遗传距离较大，GS 分别为 0.702 5、0.759 4
草在不 群间丰富的遗传多
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图 1 物 UBC SR-PCR 扩增结果
. 1 ISSR amples
with

图 2 物 UBC -PCR 扩增结果
. 2 ISSR samples
with
草 ISSR 聚类图
、荒滩等阴湿之地，主要分布在热带、
但近年有文献报道珠子草在我国
北方 种栽培效果良好 分说明其
环境适应能力。而一个物种对环境变化的适应能力
强 具有丰富的遗传多样性或
基因遗传变异能力之上， 样性或 变
异 种对环境变 力越强 年
来 标记技术被 药材的 多
样 。本实验 子标记 ，
对 传多样性进 果显示 子
草 遗传多样性
子草各居群间丰富的遗传变异能力，一方面充分说
明珠子草具有较强的环境适应能力，另一方面对珠
子 遗传背景的研究和种质利用有较好
的参考价值。
聚类图可以看出，广东、广西等沿海
地 居群亲缘关 为一支 南
省 居群聚为一 群如云 河
州及景洪市勐腊县虽地处云南省境内，遗传背景却
与 城市居群相 地理位 近
广西等地有直接关系，可能是作为沿海居群及内陆
居群的一个交集地带；个别居群与其本地居群地理
位 缘关系却较 况可能 个
居群特殊的环境因素有关，
步
我国及印度 代表性 族
药 传多样性及 变异的 格
局 子草种质资 护策略 指
导 过本实验可 遗传多 丰
富 种质资源 的基因特 。
谢产物，而次
培研
引 855 对样品 1～15 的 IS
Fig -PCR amplification of 1—15 s
Primer UBC855
引 855 对样品 16～30 的 ISSR
Fig -PCR amplification of 16—30
Primer UBC855

图 3 以 Nei’s 遗传距离构建的珠子
Fig. 3 ISSR dendrogram of P. nriuri based
on Nei’s genetic distance
所以，在对珠子草进行种质资源调查及保护时应尽
可能多地涉及到各个居群，尤其是那些具有基因特
异性的居群，以尽可能地保持其物种水平较高的遗
传多样性。作为药用植物，其发挥特殊药理活性的
有效成分大多数是植物自身的次生代
沟边、渠旁15 14 13 12 11 M 10 9 8 7 6 5 4 3 2
亚热带雨林地区，
地区引 [7]，充 较强的
弱与否建立在其是否
种内遗传多 遗传
越丰富，物 化的适应能 。近
，ISSR分子 广泛应用于 遗传
性分析中[8-10] 运用ISSR分 技术
珠子草的遗 行分析，结 ，珠
具有丰富的 ，从DNA水平上验证了珠
草育种材料
从 ISSR
区的珠子草 系较近，聚 ；云
内各珠子草 支，个别居 南红
广东等沿海 近，这与其 置靠
置相近但亲 远，此种情 与每
具体影响因素还需进一
探索。
珠子草是 民间具有 的民
，了解其遗 各居群遗传 分布
对于制定珠 源采集及保 具有
性作用。通 知，珠子草 样性
，且个别居群 具有很明显 异性
生物质在协调植物与环境的关系上充当重要角色，
即次生代谢物质是植物为适应一定的环境变化长期
生存选择的结果[11-13]，换句话说，外界生存环境条
件的不同在某种程度上会导致相同品种的药用植物
体内次生代谢物质产生变化，所以，从药用角度来
说，也应尽量完善地保护珠子草种质资源遗传多样
性、避免近交衰退的同时，加大珠子草异地栽
究，同时对遗传特异性强的个别居群进行引种驯化。
1
30 28 27 26 17 16 29 25 24 23 22 21 M 20 19 18

1
11
22
29
13
30
3
7
26
10
12
4
2
18
17
9
23
24
27
25
5
6
21
19
15
20
16
8
28
14
0.70 0.77 0.84 0.90 0.97
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987, 84: 274-278.
P, Subramanian S, Blumberg B S, et al.


of the g phyllanthus is chem y, pharmacology
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谢的
大学学报, 2003, 26(10): 67-71.


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》（CN: 11-2163/R, I : 0513-4 ）是由中国药学会主办、中国医学科学院药物研究所承办、国
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参考文献
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欢 2 年《药 学报》
《药学学报 SSN 870
内外公开发行 和综述、 究论文、 究简 态。本刊自
年创刊以来， 科 ，旨在促 国内外学 交流
合成药物化学 药 物分 剂 生药学等
《药学学报》
《药学学报》名 被世界主要检索系统收录，
刊物，在国际上享有一定知名度。本刊
知名度、高学术水平）期刊；
，2001 年入选中国期刊方阵“双高”
年被评为第二届“国家期刊奖百种重点科技期刊”
优秀期刊奖”二等奖； 年连续
协精品科技期刊 项 类）；
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