全 文 ：·药材与资源·
膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析
吴松权1 ,祖元刚2 ,管清杰2 ,吴基日1
①
(11 延边大学农学院 园艺系 ,吉林 龙井 　133400 ;21 东北林业大学 ,黑龙江 哈尔滨 　150040)
摘　要 :目的 　对膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因进行克隆及序列分析。方法 　应用 RT2PCR 和 cDNA 末端快速扩
增法 ,以膜荚黄芪根总 RNA 为模板克隆 PAL 基因。结果 　所克隆的膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因命名为
A mPAL , Genbank 登录号为 EF567076。序列分析表明 ,A mPAL 全长为 2 650 bp ,含有一个完整的 2 154 bp 开放读
码框。A mPAL 是植物苯丙氨酸解氨酶家族的一个新成员 ,推测其编码 718 个氨基酸的多肽 ,相对分子质量为
71805 ×104 ,等电点为 5196 ,与豆科植物已知的 PAL 氨基酸序列的同源并且相似性都大于 80 %。结论 　首次成功
地从膜荚黄芪中克隆出了 PAL 基因 ,为有效利用该基因调控药用植物苯丙烷代谢途径奠定了基础。
关键词 :膜荚黄芪 ;苯丙氨酸解氨酶 ;基因克隆
中图分类号 :R28212 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2010) 0320456205
Cloning and sequence analysis of a novel phenylalanine ammonia2lyase gene
from Ast ra galus membra naceus
WU Song2quan1 , ZU Yuan2gang2 , GUAN Qing2jie2 , WU ji2ri1
(11 Department of Horticulture , Agricultural College of Yanbian University , Longjing 133400 , China ;
21 Northeast Forest ry University , Harbin 150040 , China)
Abstract : Objective 　To clone and sequence t he cDNA encoding p henylalanine ammonia2lyase ( PAL)
gene f rom A st rag al us membranaceus1 Methods 　R T2PCR and RACE Techniques were used to clone a
p henylalanine ammonia2lyase gene f rom A1 membranaceus root s wit h the total RNA as t he template1 Re2
sults The cloned gene named as A mPAL and t he Genbank regist ry number is EF5670761 Squence analysis
showed that t he f ull2lengt h of A mPAL cDNA was 2 650 bp , including a 2 154 bp open reading f rame
(ORF)1 A mPAL was a new number of PAL family t hat consisted of 718 amino acids with p rediated mole2
cular weight of 71805 ×104 and isoelect ric point ( PI) of 51961 At t he same time , A mPAL had the homo2
logy with PAL of known leguminous plant s and shared above 80 % identity of amino acid sequences1 Con2
clusion It is t he first report t hat a novel PAL gene is cloned f rom A1 membranaceus1 This work lays a foun2
dation for regulating p henylp ropanoid pat hway of medical plant with A mPAL1
Key words : A st ra gal us membranaceus ( Fisch1 ) Bunge ; p henylalanine ammonia2lyase ; gene cloning
　　Koukol 和 Conn (1961)首次从绿色植物中发现
了苯丙氨酸解氨酶 ,并进行了纯化[1 ] 。苯丙氨酸解
氨 酶 ( p henylalanine ammonia2lyase , PAL , EC
4131115) 是连接初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯
丙烷类代谢第一步反应的酶 ,是苯丙氨酸代谢途径
的关键酶、限速酶。它催化 L2苯丙氨酸生成反式肉
桂酸 ,从而进入苯丙烷类代谢的途径 ,生成香豆酸、
阿魏酸、芥子酸等中间产物 ,这些酸可以进一步转化
为香豆素、绿原酸 ,也可以形成 CoA 脂 ,再进一步转
化为类黄酮、木质素等次生代谢产物 (图 1) [2 ,3 ] 。
　　黄芪来源豆科植物膜荚黄芪 A st ragal us mem2
branaceus ( Fisch1 ) Bunge 或蒙古黄芪 A st ra gal us
membranaceus ( Fisch1 ) Bunge var1 mon g hol icus
(Bunge) Hsiao 干燥根 ,为传统的补气药 ,具有补气
固表、利尿排脓、敛疮生肌的功效。黄芪化学成分主
要含有皂苷类、类黄酮、多糖类等[4～6 ] 。本实验根据
·654· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
①收稿日期 :2009205212　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30860036)
作者简介 :吴松权 (1972 —) ,男 ,吉林龙井人 ,副教授 ,从事植物基因工程研究。
Tel :13944705260 　(0433) 3263389 　Fax : (0433) 3263483 　E2mail :arswsq @ybu1 edu1cn
图 1 　植物体内苯丙烷合成代谢的一般途径[ 3]
Fig11 　General pathway of phenalpropane synthesis and metabolism in plant[ 3]
已知的 PAL 的氨基酸序列进行同源序列比对 ,根据
其保守序列设计出简并引物 , 应用 R T2PCR 和
RACE 技术从膜荚黄芪中克隆 PAL 基因全长并进
行序列分析。这对从分子水平上探讨黄芪苯丙烷类
次生代谢途径具有重要意义。
1 　材料与方法
111 　材料 :膜荚黄芪种子采自延边大学农学院中草
药圃地。播种于花盆中 ,置于温度为 25 ℃、光照为
3 000 lx、光/ 暗为 16/ 8 h、湿度 60 %的培养室中培
养 30 d 后 ,取幼苗的根。
112 　试剂 : TRIzoL 购自 Gibco BRL 公司 ,反转录
试剂盒购于 TO YOBO ,5′和 3′RACE 试剂盒、各种
限制性内切酶、胶回收试剂盒、PMD182T 载体购自
宝生物工程有限公司。
113 　方法
11311 　总 RNA 的提取 :参照 TRIzoL 说明书操作。
11312 　引物设计与合成 :利用生物信息学资源在
NCBI 上寻找所有豆科植物的 PAL 蛋白序列 ,利用
DNAStar 软件进行多序列比对确定其共有的保守
区 ,设计了一对简并引物 A mPAL u 和 A mPAL d ;根
据 R T2PCR 获得的膜荚黄芪 PAL 基因片断 ,设计
3′2RACE 上游特异性引物 A mPAL u3′,5′末端 P 标
记引物 A mPALp5′, 5′端两对特异引物 A mPAL2
S1、A mPAL2A1 和 A mPAL2S2、A mPAL2A2 ,其碱
基序列如表 1 所示。
表 1 　引物设计
Table 1 　Design of primers
　　引物 碱基序列
A mPALu 5′2CA (C/ T) ( T/ C) / T ( T/ G) GA ( T/ C)
　GA GGT GAA ( G/ A) CG23′
A mPALd 5′2TC( G/ A) CA ( G/ A) AA (C/ T) CT(A/ T)
　GA (A/ T) GG(A/ G) T G23′
A mPALu3′ 5′2GGGT GTCAA T GGCGAACTCC23′
A mPALp5′ 5′2CA GTCACTACTA GC23′
A mPAL2S1 5′2GACTCT TACCA T T GCTCA GG23′
A mPAL2A1 5′2A TCT TAACCACCGGA T T GCG23′
A mPAL2S2 5′2TAA GGT GGA GT T GTCGGAA T23′
A mPAL2A2 5′2CCA TCCGCT TCACCTCA TCC23′
11313 　R T2PCR 合成保守区 cDNA :参照 TO YO2
BO 公司 Rever Tra Dash TM反转录试剂盒的说明书 ,
Oligo (d T) 20 为引物 ,以提取的膜荚黄芪总 RNA 为
模板 ,用 Rever Tra Ace 进行逆转录反应合成 cDNA
第 1 链 ,之后用简并引物 A mPAL u、A mPAL d 进行
PCR。反应条件 :预变性 94 ℃、2 min ,变性 94 ℃、
30 s ,退火 60 ℃、30 s ,延伸 72 ℃、2 min。30 个循环
结束后 72 ℃延伸 10 min ,取 PCR 产物在 1 %琼脂
糖凝胶上电泳。
11314 　3′2RACE 扩增 :参照 Ta KaRa 公司 3′2Full
RACE 试剂盒的说明书。使用 AMV 反转录酶由
RNA 反转录成 cDNA ,然后用 3′2RACE 上游特异
性引物 A mPAL u3′和 3 sites Adapter 引物 (5′2CT2
GA TCTA GA GGTACCGGA TCC23′) 进 行 PCR。
·754·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
反应条件 :预变性 94 ℃、2 min ,变性 94 ℃、30 s ,退
火 58 ℃、30 s ,延伸 72 ℃、1 min。30 个循环结束后
72 ℃延伸 10 min ,取 PCR 产物在 1 %琼脂糖凝胶上
电泳。
11315 　5′2RACE 扩增 :参照 Ta KaRa 公司 5′2Full
RACE 试剂盒的说明书。以总 RNA 为模板 ,使用
A mPALp5′引物进行反转录反应 ,合成第 1 链 cD2
NA ,使用 RNase H 分解 Hybrrid DNA2RNA 中的
RNA 链 ;使用 T4 RNA Ligase 使单链 cDNA 进行
环化或形成首尾连接物 ;然后进行巢试 PCR。第一
轮 PCR 用 5′端特异引物 A mPAL2S1 和 A mPAL2
A1。反应条件 :预变性 94 ℃、2 min ,变性 94 ℃、30
s ,退火 55 ℃、30 s ,延伸 72 ℃、1 min。30 个循环结
束后 72 ℃延伸 10 min。第二轮 PCR 用 A mPAL2
S2 和 A mPAL2A2 ,以稀释 10 倍的第一轮 PCR 产物
为模板。反应条件 :预变性 94 ℃、2 min ,变性 94
℃、30 s ,退火 56 ℃、30 s ,延伸 72 ℃、1 min。30 个
循环结束后 72 ℃延伸 10 min ,取 PCR 产物在 1 %
琼脂糖凝胶上电泳。
11316 　克隆与测序 : PCR 产物从胶上回收后 ,克隆
入 pMD 182T 载体 ,构建重组质粒 ,操作方法按
pMD 182T 载体重组操作说明书 (宝生物工程有限
公司提供) 进行。将重组质粒转化感受态 E1 col i
J M109 ,通过蓝白斑筛选、用限制性内切酶 B am
HI/ S al Ⅰ双酶切电泳筛选重组子 ,鉴定为阳性克隆
的菌株 ,送至上海英俊生物公司进行测序。
11317 　序列分析 : 将所定测定的序列结果通过
DNAStar 软件寻找最大开放阅读框 (ORF) 并翻译
成氨基酸序列、预测蛋白质相对分子质量和等电点 ,
通过 National Center for Biotechnology Informa2
tion (NCBI) p rotein blast 程序进行同源性检索 ,通
过 Mega 311 分析软件与其他植物的 PAL 氨基酸
序列进行多重比较。
2 　结果与分析
根据豆科植物 PAL 的保守区序列设计简并引
物 A mPAL u 和 A mPAL d ,以总 RNA 反转录合成的
cDNA 为模板 ,PCR 产物获得一个约 1 600 bp 大小
的预期片段 ,DNA 序列测定表明产物大小为 1 571
bp (图 22A) ,命名为 A mPAL2R T。根据此保守区
cDNA 设计了 3′2RACE 和 5′2RACE 特异引物 (见
11312 引物设计与合成) 。采用 3′2RACE 上游特异
性引物 A mPAL u3′和 3 sites Adapter 引物扩增得到
了一个 796 bp 大小的 cDNA 片段 ,序列测定结果表
明其为 A mPAL 的 3′端上游编码序列 (图 22B) ,命
名为 A mPAL23′。采用 5′2RACE 两队特异引物巢
试 PCR 得到了一个 401 bp 大小的 cDNA 片段 ,序
列测定结果表明其为 A mPAL 的 5′端上游编码序
列 (图 22C) ,命名为 A mPAL25′。
A2R T2PCR 　B23′2RACE 　C25′2RACE 　12PCR 产物　M2DL 2000 相对分子质量标准
A2R T2PCR 　B23′2RACE 　C25′2RACE 　12PCR product s 　M2DL 2000 Marker
图 2 　膜荚黄芪 PAL 基因 PCR扩增结果
Fig12 　PCR Products of A1 membranaceus PAL gene
　　依据 A mPAL2R T、A mPAL23′和 A mPAL25′的
核苷酸序列 ,通过拼接获得了膜荚黄芪 PAL 基因的
全长 cDNA 序列命名为 A mPAL , NCBI 登陆号为
EF567076。利用 DNAStar 软件对获得的 A mPAL
全长 cDNA 进行序列分析 (图 3) ,图中方框部分为
起始密码子和终止密码子。A mPAL cDNA 全长
2 650 bp ,包括 2 154 bp 的 ORF ,199 bp 的 5′非转
译区 (5′U TR) ,283 bp 的 3′非转译区 (3′U TR)和 14
bp 的 polyA 尾。推测其编码 718 个氨基酸 ,相对分
子质量 ( MV )为 71805 ×104 ,等电点 ( PI)值为 5196。
登录 NCBI 主页 ,使用Blast 同源性检索并进行
核苷酸比对显示 A mPAL 与一些豆科植物序列高度
同源 ,如与红三叶 T ri f ol i um p ratense L1 、百脉根
L ot us corni ucul at us L1 var1 j a ponicus Reg1 和豌豆
Pisum sati v um L1 的相似性分别为 88 %、84 %和
83 % ,特别是与同属于黄芪属的膜荚黄芪的变种蒙
·854· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
古黄芪相似性最高为 96 % ; 氨基酸比对也显示
A mPAL 与豆科植物 PAL 同源 ,与豌豆、大豆 Gl y2
ci ne m ax (L1 ) Merr1 和苜蓿 Medicago sati v a L1
相似性分别为 9117 %、8818 %和 7917 % ,特别是与
同属于黄芪属的膜荚黄芪的变种蒙古黄芪相似性最
高 (9811 %) 。同时在推测的 A mPAL 第 204、205 和
206 个氨基酸位置上有丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸残
基 ,它们被认为是各物种 PAL 蛋白中高度保守的氨
基酸基序 (Motif ) [7 ] ,说明 A mPAL 是 PAL 基因家
族中的新成员。
图 3 　膜荚黄芪 PAL 基因的全长 cDNA序列
Fig13 　Full cDNA sequence of A1 membranaceus PAL gene
·954·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
　　为研究 A mPAL 和其他植物 PAL 之间的进化
关系 ,以氨基酸序列作为分析对象 ,利用 DNAStar
软件构建了 PAL 分子进化树 (图 4) 。从进化树中
可知植物之间的进化关系 ,裸子植物 (火炬松) 单独
聚为一类 ( Ⅰ) ,而所有被子植物聚合成另一大类
( Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ) ,其中按照物种亲缘关系的远近又分为
3 大类 :禾本科植物聚为第 2 类 ( Ⅱ) ;豆科植物聚为
第 3 类 ( Ⅲ) ;被子植物其他科聚为第 4 类 ( Ⅴ) ;并且
双子叶植物 ( Ⅲ、Ⅳ) 的遗传距离小于单子叶植物
( Ⅱ) ;该结果与传统的分类结果一致。
PAL 的 GenBank 登录号为 : AmPAL ( ABQ63094) , AmPALv
( P27991) , Tp PAL (BA E7125211) , ShPAL ( P45732) , MsPAL
( X58180) , TsPAL ( P45734) , PsPAL (BAA0088511) , Gm2
PAL (CAA371291 1) , Nt PAL ( P25872) , St PAL ( P31425) , Ib2
PAL ( P14166) , LePAL (Q49835) , DcPAL (O23865) , PcPAL
( P45729) , At PAL ( AAC18870) , OsPAL ( P14717) , TaPAL
(Q43210) , Pt PAL ( P52777)
PAL GenBank accession numbers are : mPAL ( ABQ63094 ) ,
AmPALv ( P27991 ) , Tp PAL ( BA E7125211 ) , ShPAL
( P45732 ) , MsPAL ( X58180 ) , TsPAL ( P45734 ) , PsPAL
(BAA0088511) , GmPAL ( CAA3712911) , Nt PAL ( P25872) ,
St PAL ( P31425) , IbPAL ( P14166) , LePAL ( Q49835) , Dc2
PAL (O23865) , PcPAL ( P45729) , At PAL (AAC18870) , Os2
PAL ( P14717) , TaPAL (Q43210) , Pt PAL ( P52777)
图 4 　植物 PAL 的分子进化树
Fig14 　Molecular phylogenetic tree of plant PAL
3 　讨论
本研究中使用的植物材料没有经过任何诱导处
理 ,所提取总 RNA 中 mRNA 的量足够满足克隆
A mPAL 基因的需要 ,表明 PAL 基因在膜荚黄芪中是
以结构基因的形式存在的 ,因此 ,支持 Hahlbrock
等[8 ]关于 PAL 基因作为结构基因在植物的不同发展
阶段活性会有所变化的观点。
近年来转 PAL 基因研究表明 ,转 PAL 基因植
物 ,PAL 活性明显增加 ,并且 PAL 活性的增加与次生
代谢产物的富集呈显著的正相关[9 ,10 ] 。通过本研究
克隆了膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因并进行了序列
分析 ,这对开展黄芪次生代谢基因工程研究 ,利用遗
传转化技术提高黄芪特定次生代谢产物量从而改良
黄芪品质具有重要意义 (此项工作正在进行中) 。
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