全 文 ：茵陈醇提物抗游离脂肪酸对体外培养 ＨｅｐＧ２
细胞脂毒性的作用及机制研究
陈少东１，２，冯琴１，彭景华１，许丽莉１，刘平１，刘成１，胡义扬１
（１．上海中医药大学 附属曙光医院 上海中医药大学肝病研究所 肝肾疾病病证教育部重点研究室
上海市高校中医内科学Ｅ研究院，上海 ２０１２０３；
２．厦门大学 医学院，福建 厦门 ３６１００５）
［摘要］　目的：研究茵陈醇提物对游离脂肪酸刺激ＨｅｐＧ２细胞所致肝脂毒性的抑制作用及机制。方法：制备大鼠的正常
血清和药物血清，在经毒性试验确定无药物毒性的前提下，分设正常组、模型组和茵陈醇提物组（１０％，１％，０１％ ３个剂量），
以相应浓度的正常血清和药物血清培养ＨｅｐＧ２细胞，同时添加长链游离脂肪酸（ＦＦＡ）刺激ＨｅｐＧ２细胞２４ｈ。观察：①细胞上
清肿瘤坏死因子（ＴＮＦα）含量（ＥＬＩＳＡ法）；②细胞内甘油三酯（ＴＧ）含量、细胞脂肪油红 Ｏ染色；③细胞内磷酸化 κＢ抑制蛋
白（ＰＩκＢ）、组织蛋白酶Ｂ（ｃｔｓｂ）、凋亡抑制基因相关Ｘ蛋白（Ｂａｘ）蛋白表达（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｉｎｇ法）；④细胞ＴＮＦα，ｃｔｓｂ和Ｂａｘ基
因表达（ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ）；⑤细胞内ｃｔｓｂ的表达和分布（免疫荧光法）。结果：模型组细胞内ＴＧ及上清ＴＮＦα含量显著升高，分
别达（５９０±１８６）ｍｇ·ｇ－１，（７７±１１）ｐｇ·ｍｇ－１，细胞内 ｃｔｓｂ，ＰＩκＢ的蛋白表达以及 ｃｔｓｂ，ＴＮＦα的 ｍＲＮＡ表达显著增强；而
１０％茵陈醇提物组细胞内ＴＧ和上清ＴＮＦα含量较模型组显著降低，仅为（３３５±５４）ｍｇ·ｇ－１，（５５±７）ｐｇ·ｍｇ－１，且显著抑
制细胞内 ｃｔｓｂ，ＰＩκＢ的蛋白表达以及 ｃｔｓｂ，ＴＮＦα的 ｍＲＮＡ表达。结论：茵陈醇提物对 ＦＦＡ诱导的 ＨｅｐＧ２细胞脂肪变性，
ＴＮＦα分泌有显著的抑制作用，其作用与抑制ｃｔｓｂ等基因和蛋白表达有关。
［关键词］　茵陈醇提物；游离脂肪酸；ＨｅｐＧ２细胞；肝脂毒性
［收稿日期］　２００９０１２０
［基金项目］　国家自然科学基金项目（３０６７２６３５）；上海市优秀学科
带头人计划项目（０６ＸＤ１４０１８）；上海市教委重点学科建设项目
（Ｙ０３０２）；上海高校创新团队（第一期）；福建省自然科学基金项目
（２００９Ｊ０５０８９）；厦门大学医学院院长基金项目
［通信作者］　胡义扬，Ｔｅｌ：（０２１）５１３２８８８８８１１１，Ｅｍａｉｌ：ｙｙｈｕｌｉｖｅｒ
＠１６３．ｃｏｍ
［作者简介］　陈少东，医学博士，厦门大学医学院教师。Ｅｍａｉｌ：
ｃｓｄ５０３５２０１＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
　　近年来临床实践和研究表明，中医药对非酒精
性脂肪肝的治疗有良好的效应和前景［１］。作者既
往对“祛湿化瘀复方”（由中药茵陈、栀子、虎杖、田
基黄、姜黄组成）的研究表明，该方具有显著的抗脂
肪肝效应，并存在抗氧化、抗脂毒性等作用［２５］。为
进一步剖析复方综合药理作用的主效应中药，作者
结合数学模型“均匀设计法”研究发现方中的茵陈
（醇提）是该方针对抑制脂肪变性和 ＴＮＦα分泌作
用环节的主效应中药［６］。为此，作者采用游离脂肪
酸诱导ＨｅｐＧ２细胞肝脂毒性体外模型，对茵陈醇提
物体外抗肝脂毒性作用及其机制进行了进一步深入
研究。
１　材料
１．１　细胞株
采用ＨｅｐＧ２细胞，购自中国科学院上海细胞生
物学研究所细胞库。
１．２　动物
ＳＤ雄性大鼠，ＳＰＦ级，３００ｇ左右，购自中国科
学院上海实验动物中心，合格证号 ＳＣＸＫ（沪）２００７
０００５，用于制备药物血清。
１．３　药物
茵陈 ＨｅｒｂａａｒｔｅｍｉｓｉａｅＳｃｏｐｏｒｉａｅ，购自上海华浦
中药饮片有限公司，生产批号２００６０８０３０３。制备工
艺：取茵陈１０００ｇ，加６０００ｍＬ９０％乙醇回流提取
３次，每次３ｈ，合并滤液，６０℃减压回收乙醇，得含
生药０３３ｇ·ｍＬ－１的茵陈醇提物。冷藏备用。
１．４　试剂
胎牛血清（ＦＢＳ），批号 ０４００１１Ｂ，ＰＲＭＩＭｅｄｉ
ｕｍ１６４０培养基干粉，批号１２８５０８２（ＧＩＢＣＯ公司）。
棕榈酸（ｐａｌｍｉｔｉｃａｃｉｄ），批号 Ｐ０５００、油酸（ｏｌｅｉｃ
ａｃｉｄ），批号 Ｏ１００８１Ｇ（Ｓｉｇｍａ公司）。甘油三酯
（ＴＧ），批号 ２００６１１０３３２、乳酸脱氢酶（ｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙ
·３７３２·
第３４卷第１８期
２００９年９月
　　　　　 　 　 　 　 　　　　　 　 　 　 　
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ　１８
　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２００９
ｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＬＤＨ），批号２００６０６０６、考马斯亮蓝蛋白
测定试剂盒，批号２００７１１０３３７（南京建成生物制品
研究所），ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒，批号 Ｐ００１２
（碧云天公司）。油红Ｏ，批号 ＷＦ２００６０３０７（上海化
学试剂站）。酶联免疫吸附分析（ＥＬＩＳＡ）人血浆
ＴＮＦα检测试剂盒，批号 ＫＨＣ３０１２（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ公
司）。ＰＩκＢ抗体（ｍｏｕｓｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌＩｇＧ），批号
９２４６、多克隆 ｃｔｓｂ抗体，批号 ０６４８０（ＣｅｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司）。Ｂａｘ抗体，批号ＺＭ０３００（北京中
杉金桥生物技术有限公司）。单克隆 ＧＡＰＤＨ抗体，
批号ＫＣ５Ｇ５（康成生物科技公司）。多克隆兔抗羊
Ⅱ抗，批号６４３５６（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓＩｎｃ公司）。ＡｎｔｉｒａｂｂｉｔＩｇＧ多克隆Ⅱ抗，批号
ｗ１０５６２（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司）。ｃｔｓｂ细胞
免疫荧光抗体为 ａｎｔｉｒａｂｂｉｔＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＣＹＴＭ５，批
号６２６１２０（美国 ＺＹＭＥＤ公司）。焦碳酸二乙酯
（ＤＥＰＣ），批号 Ｗ６７０１（Ａｍｒｅｓｃｏ公司）。ＲＮＡ抽提
试剂盒，批号 ２６０８Ａ（上海华舜生物工程有限公
司），ｃＤＮＡ合成试剂盒 ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄ
ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ，批号 Ｋ１６２２（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司）。
ＤＮＡＭａｒｋｅｒ，批号 ＤＲＲ０４１Ａ、荧光定量 ＰＣＲ试剂
盒，批号ＢＫ４４０２（ＴＡＫＡＲＡ公司），溴化乙锭，批号
Ｅ８７５１（Ｓｉｇｍａ公司）。ＲＮＡ上样缓冲液，批号
０６０４９２，ＤＮＡ上样缓冲液，批号０５０１０８４（北京鼎国
生物技术公司）。ＴＡＥ干粉（ＴｒｉｓＡｃｅｔａｔｅＥＤＴＡ），批
号ＢＲＬ２５３００（迪申生物技术公司）。引物合成自生
工公司，其序列及片段长度（表１）。
表１　目的基因引物序列及片段长度
目的基因 引物序列 片段／ｂｐ
βａｃｔｉｎ ５′ＴＧＡＣＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡ３′（Ｆ） ３３１
　 ５′ＡＴＧＧＧＣＡＣＡＧＴＧＴＧＧＧＴＧＡＣ３′（Ｒ） 　
ＴＮＦα ５′ＧＧＣＡＧＣＣＴＴＧＴＣＣＣＴＴＧＡＡＧＡＧ３′（Ｆ） １７１
　 ５′ＧＴＡＧＣＣＣＡＣＧＴＣＧＴＡＧＣＡＡＡＣＣ３′（Ｒ） 　
ｃｔｓｂ ５′ＡＡＧＣＴＴＣＧＡＴＧＣＡＣＧＧＧＡＡＣ３′（Ｆ） １３６
　 ５′ＡＴＴＧＧＴＧＴＡＧＡＴＧＣＡＧ３′（Ｒ） 　
Ｂａｘ ５′ＧＣＧＡＧＴＧＴＣＴＣＡＡＧＣＧＣＡＴＣ３′（Ｆ） １４３
　 ５′ＣＣＡＧＴＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＧＴＣＡＧＡＡ３′（Ｒ） 　
１．５　主要仪器
ＰｒｉｍｏＲ型低温高速离心机和ＢＢ１５型ＣＯ２培养
箱（德国Ｈｅｒａｅｕｓ公司）。ＨＦｓａｆｅ１５００型生物安全柜
（ＨＥＡＬＦＯＲＣＥ公司）。倒置生物显微镜３７ＸＢ（上海
光学仪器厂）。ＰｈｉｌｉｐｓＴｅｃｎａｉ电子显微镜。Ｍ５多功
能酶标仪（美国ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ公司）。ＦＡ１００４分
析电子天平（美国Ｄｅｎｖｅｒ公司）。ＰＣＲ扩增仪Ｒｏｔｏｒ
ＧｅｎｅＲＧ３０００（美国基因公司）。ＪＹ２００电泳仪（北京
市君意机电技术公司）。ＢｉｏＲａｄ电泳仪、ＸＲＣＩ型Ｘ
射线暗匣（上海医疗器械五厂）。复日ＦＲ９８０生物电
泳图像分析系统（上海复日科技有限公司）。ＨＰ
ＳｃａｎｊｅｔＸＰＡ型扫描仪（惠普公司）。
２　方法
２．１　细胞培养
ＨｅｐＧ２细胞株以０２５％胰酶＋００２％ＥＤＴＡ消
化传代，以含１０％胎牛血清的１６４０培养液在含５％
ＣＯ２＋９５％空气的３７℃培养箱中培养。加药前以
无血清１６４０洗涤２次。
２．２　药物血清制备
按１０ｍＬ·ｋｇ－１鼠重，生药０３３ｇ·ｍＬ－１剂量
给大鼠灌服药物，２次／ｄ，连续３ｄ，末次灌胃结束后
禁食，１ｈ后无菌条件下从腹腔静脉取血，静置３～４
ｈ，３０００ｒ·ｍｉｎ－１、２０ｍｉｎ、４℃离心，超净台上分离
血清。将分离得到的血清置于５６℃水浴中３０ｍｉｎ
灭活，－７０℃冷藏备用。
２．３　药物血清毒性试验
分别设１０％，２０％，３０％胎牛血清组、正常大鼠
血清组和茵陈醇提物药物血清组，每组３皿，作用于
ＨｅｐＧ２２４ｈ后，取上清检测ＬＤＨ活性。
２．４　分组与用药
２．４．１　茵陈醇提物体外抗肝脂毒性实验　ＨｅｐＧ２
培养２４～４８ｈ，细胞长满７０％ ～８０％，换液，分正常
组、模型组以及１０％，１％，０１％３个剂量茵陈醇提
物组，每组各４皿。正常组、模型组添加１０％正常
大鼠血清，１０％茵陈醇提物剂量组添加１０％茵陈醇
提物药物血清、１％茵陈醇提物剂量组添加１０％正
常大鼠血清稀释 １０倍的 １０％茵陈醇提物药物血
清，０１％茵陈醇提物剂量组添加１０％正常大鼠血
清稀释１００倍的１０％茵陈醇提物药物血清，不同茵
陈醇提物组的血清浓度仍保持为１０％。除正常组
外，各组添加 ＦＦＡ（油酸：棕榈酸浓度为０５×１０－３
ｍｏｌ·Ｌ－１∶０２５×１０－３ｍｏｌ·Ｌ－１）［７］。刺激２４ｈ收
集上清及细胞，检测细胞内 ＴＧ、上清 ＴＮＦα含量及
进行细胞油红Ｏ染色。
２．４．２　茵陈醇提物体外抗肝脂毒性的作用机制研
究　ＨｅｐＧ２培养２４～４８ｈ，细胞长满７０％ ～８０％，
换液，分正常组、模型组、最佳效应茵陈醇提物剂量
组（取体外抗肝脂毒性实验所得效应强度最佳的剂
·４７３２·
第３４卷第１８期
２００９年９月
　　　　　 　 　 　 　 　　　　　 　 　 　 　
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ　１８
　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２００９
量组进行作用机制研究），每组各４皿。正常组、模
型组添加１０％正常大鼠血清，１０％茵陈醇提物剂量
组添加１０％茵陈醇提物药物血清。除正常组外，各
组添加ＦＦＡ。刺激２４ｈ收集上清及细胞，检测如下
项目。
２．５　检测项目和方法
２．５．１　细胞内ＴＧ含量　参考 ＨｅｉｄｅｒＪＧ方法提取
细胞层总脂质［８］，冰上刮下细胞层后，加入３ｍＬ异
丙醇洗净，移入试管，混匀３ｍｉｎ（破膜），分装３管。
取出其中一套，室温离心（３０００ｒ·ｍｉｎ－１，１５ｍｉｎ），
脂类溶于异丙醇，下层沉淀为蛋白。取上清８０℃以
上水浴使异丙醇蒸发至干，所得为脂类物质，重新溶
于９μＬ异丙醇，加入９００μＬ酶试剂，采用ＧＰＯＰＡＰ
法，酶标仪５４６ｎｍ处测吸光度（Ａ），求出各样本的
ＴＧ含量（ｍｇ·Ｌ－１）。下层沉淀溶于２００μＬ１ｍｏｌ·
Ｌ－１ＮａＯＨ，取 ３０μＬ进行检测，得蛋白浓度（ｇ·
Ｌ－１）。细胞内ＴＧ含量通过细胞层总蛋白含量进行
校正，得ＴＧ含量（ｍｇ·ｇ－１）。
２．５．２　细胞油红 Ｏ染色　细胞爬片取出后，用预
冷的ＰＢＳ洗３遍，吹干，入１０％甲醛固定１ｈ。加油
红Ｏ染液，室温下２ｈ，再用ＰＢＳ洗３遍。光学显微
镜观察拍照。
２．５．３　细胞上清 ＴＮＦα含量（ＥＬＩＳＡ法）　以 ５０
μＬ上清进行检测，求出各样本的 ＴＮＦα含量（ｐｇ·
Ｌ－１），最后用细胞层总蛋白浓度校正，即 ＴＮＦα含
量测定值／细胞层总蛋白（ｍｇ·Ｌ－１），得ＴＮＦα含量
（ｐｇ·ｍｇ－１）。
２．５．４　细胞 ＰＩκＢ，ｃｔｓｂ，Ｂａｘ蛋白表达　Ｗｅｓｔｅｒｎ
Ｂｌｏｔｉｎｇ法［９］。
２．５．５　细胞ｃｔｓｂ的表达和分布检测　细胞免疫荧
光法［１０］。
２．５．６　细胞 ＴＮＦα，ｃｔｓｂ，Ｂａｘ基因表达　ｒｅａｌｔｉｍｅ
ＰＣＲ法［１１］。
２．６　统计方法
所有数据均使用 ＳＰＳＳ１１０软件包进行统计学
分析。计量资料以珋ｘ±ｓ表示。数据经过正态分布及
齐性检验，组间比较采用单因素方差分析Ｑ检验。
３　结果
３．１　茵陈醇提物药物血清对ＨｅｐＧ２细胞的毒性
茵陈醇提物药物血清、胎牛血清以及正常大鼠
血清，相同浓度下，两两比较上清ＬＤＨ活性，无统计
学差异。但三者上清 ＬＤＨ活性均随浓度增加呈上
升趋势。提示一定浓度的大鼠血清也存在毒性作
用。为了排除血清本身的影响，故后续实验均添加
１０％或１０％浓度以下的正常大鼠血清或药物血清
（表２）。
表２　不同浓度茵陈醇提物药物血清对ＨｅｐＧ２细胞
上清ＬＤＨ活性的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
组别 ＬＤＨ／Ｕ·ｇ－１
１０％胎牛血清 ４８７±１１０
１０％正常大鼠血清 ４５９±１２０
１０％茵陈醇提物药物血清 ４８４±８５
２０％胎牛血清 ５２４±７５
２０％正常大鼠血清 ５１６±２１
２０％茵陈醇提物药物血清 ５１９±５８
３０％胎牛血清 ５５８±８４
３０％正常大鼠血清 ５５５±４３
３０％茵陈醇提物药物血清 ５５６±４６
３．２　茵陈醇提物抗肝脂毒性的作用
３．２．１　细胞内 ＴＧ含量及上清 ＴＮＦα蛋白表达
变化　与正常组细胞内 ＴＧ含量（１４１±１３）
ｍｇ·ｇ－１相 比，模 型 组 ＦＦＡ刺 激 后 升 高，达
（５９０±１８６）ｍｇ·ｇ－１（Ｐ＜００１）。各剂量茵陈
醇提物组细胞内 ＴＧ含量较模型组有所降低，但
以１０％茵陈醇提物剂量组（３３５±５４）ｍｇ·ｇ－１
效果最佳（Ｐ＜００５）。本实验结果重复 ２次，结
果一致。较之正常组细胞上清 ＴＮＦα蛋白含量
（４８±７）ｐｇ·ｍｇ－１，模型组经 ＦＦＡ刺激后，显著
升高达（７７±１１）ｐｇ·ｍｇ－１（Ｐ＜００１）。各剂量
茵陈醇提物组均能抑制 ＴＮＦα的蛋白表达，但仅
１０％茵陈醇提物剂量组下降明显，为（５５±７）
ｐｇ·ｍｇ－１（Ｐ＜００１）（表３）。
３．２．２　细胞脂肪油红 Ｏ染色变化　正常组 ＨｅｐＧ２
细胞呈不规则多角形或卵圆形生长，胞质染色浅淡
或无明显着色。模型组在 ＦＦＡ刺激后，胞质内广泛
着色，红色脂滴大而多。而１０％茵陈醇提物剂量组
的上述变化显著减轻（图１）。
３．３　１０％茵陈醇提物抗肝脂毒性作用及其对
“ＦＦＡｃｔｓｂＴＮＦα”通路的影响
３．３．１　细胞 ＰＩκＢ，ｃｔｓｂ，Ｂａｘ蛋白表达　较之正常
组，模型组细胞ＰＩκＢ，ｃｔｓｂ蛋白表达均显著增加，而
Ｂａｘ蛋白表达未见显著变化。１０％茵陈醇提物剂量
组能显著抑制 ＰＩκＢ，ｃｔｓｂ蛋白表达（图２），本实验
重复３次，结果一致。
３．３．２　细胞ＴＮＦα，ｃｔｓｂ和 Ｂａｘ基因表达变化　较
·５７３２·
第３４卷第１８期
２００９年９月
　　　　　 　 　 　 　 　　　　　 　 　 　 　
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ　１８
　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２００９
　　 表３　细胞内ＴＧ，上清ＴＮＦα含量变化（珋ｘ±ｓ，ｎ＝４）
组别 剂量 ＴＧ／ｍｇ·ｇ－１ ＴＮＦα／ｐｇ·ｍｇ－１
正常 １０％正常大鼠血清 １４１±１３ ４８±７
模型 １０％正常大鼠血清 ５９０±１８６１） ７７±１１１）
０１％茵陈醇提物 ０１％茵陈醇提物药物血清 ４８３±１８７ ６４±１７
１％茵陈醇提物 １％茵陈醇提物药物血清 ４３０±７７ ６３±１７
１０％茵陈醇提物 １０％茵陈醇提物药物血清 ３３５±５４２） ５５±７３）
　　注：与正常组比１）Ｐ＜００１；与模型组比２）Ｐ＜００５，３）Ｐ＜００１（表４同）。
Ａ．正常组；Ｂ．模型组；Ｃ．０１％茵陈醇提物组；Ｄ．１％茵陈醇提物组；Ｅ．１０％茵陈醇提物剂量组。
图１　不同剂量茵陈醇提物组细胞脂肪油红Ｏ染色（×２００）
１．正常组；２．模型组；３．１０％茵陈醇提物组。
图２　细胞ＰＩκＢ，ｃｔｓｂ，Ｂａｘ蛋白表达
之正常组，模型组细胞ＴＮＦα和ｃｔｓｂ基因表达显著
增加（Ｐ＜００１），但 Ｂａｘ基因表达未见显著变化。
１０％茵陈醇提物剂量组均能抑制ＴＮＦα和ｃｔｓｂ基因
表达（Ｐ＜００５，Ｐ＜００１）（表４）。
３．３．３　细胞内ｃｔｓｂ免疫荧光表达　细胞免疫荧光法
显示，正常状态时，ｃｔｓｂ呈点状分布（和溶酶体定位一
致）。ＦＦＡ刺激后，ｃｔｓｂ从溶酶体释放出来，广泛弥漫
地分布在胞浆中，表达增加（荧光较强），而１０％茵陈
醇提物组的上述变化受到明显抑制（图３）。
表４　细胞ＴＮＦα，ｃｔｓｂ和Ｂａｘ基因表达变化（密度积分比值）（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
组别 剂量 ＴＮＦα ｃｔｓｂ Ｂａｘ
正常 １０％正常大鼠血清 １５３±０４８ １６２±０５３ １４２±０５９
模型 １０％正常大鼠血清 ３７７±０５４１） ５７±０６９１） １３５±０７９
１０％茵陈醇提物 １０％茵陈醇提物药物血清 ２３５±０２８２） ３４８±０３６３） ０９２±０５６
４　讨论
茵陈具有利胆保肝、抗病原微生物、抗癌、抗动
脉粥样硬化、兴奋平滑肌等多方面的活性［１２１５］，本
研究发现，中药茵陈（醇提）显著的治疗脂肪肝效应
与其抗肝脂毒性有关，且与“ＦＦＡｃｔｓｂＴＮＦα”通路
密切相关。
·６７３２·
第３４卷第１８期
２００９年９月
　　　　　 　 　 　 　 　　　　　 　 　 　 　
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ　１８
　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２００９
Ａ．正常组；Ｂ．模型组；Ｃ．１０％茵陈醇提物组。
图３　细胞内ｃｔｓｂ免疫荧光表达变化（×２００）
　　 ＦＦＡ异常增多在非酒精性脂肪性肝病
（ＮＡＦＬＤ）的发病中起着重要的作用。当 ＦＦＡ异常
增多时，其很强的细胞毒性，可作为去垢剂损害细胞
质、线粒体和溶酶体膜等，引起生物膜损伤［１６］。近
年来，Ｆｅｌｄｓｔｅｉｎ等人［１７］研究发现，ＨｅｐＧ２细胞经
ＦＦＡ刺激后，刺激Ｂａｘ向溶酶体内转位，促使ｃｔｓｂ释
放到胞浆，激活ＩκＢ激酶β（ＩＫＫβ）使ＩκＢ磷酸化，
导致核因子 ｋａｐｐａＢ（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａＢ，ＮＦ
κＢ）的活化，使之向细胞核内移位，启动炎症因子如
ＴＮＦα的基因转录、大量表达引起 ＴＧ的蓄积、发生
脂肪变性，造成肝脏脂毒性，ＴＮＦα又能进一步促进
溶酶体渗透，激活ＮＦκＢ，形成一个加重肝损伤的循
环，即“ＦＦＡｃｔｓｂＴＮＦα”通路。
本研究结果显示，在无细胞毒性剂量范围下
（１０％浓度药物血清），不同剂量茵陈醇提物（１０％，
１％，０１％）具有抗 ＦＦＡ诱导 ＨｅｐＧ２细胞内 ＴＧ变
性、ＴＮＦα分泌的肝脂毒性作用，但以１０％药物血
清效应最强，提示该药的抗脂毒性作用具有剂量依
赖性。
本研究结合 １０％茵陈药物血清对“ＦＦＡｃｔｓｂ
ＴＮＦα”通路的影响，探讨茵陈醇提物体外抗肝脂毒
性作用机制。实验结果表明，ＨｅｐＧ２细胞经 ＦＦＡ刺
激后，Ｂａｘ的蛋白和基因表达均未见显著性改变，提
示Ｂａｘ在本通路中的作用可能与 ＦＦＡ刺激后向溶
酶体内转位，促使 ｃｔｓｂ释放到胞浆，激活了 ＮＦκＢ／
ＩκＢ信号转导途径有关［１８］。经ＦＦＡ刺激后，模型组
ｃｔｓｂｍＲＮＡ及蛋白、ｐＩκＢ蛋白、ＴＮＦαｍＲＮＡ及蛋
白表达均显著升高。茵陈药物血清则可显著抑制上
述作用环节，提示茵陈醇提物抗肝脂毒性的作用机
制与有效抑制ｃｔｓｂｍＲＮＡ及蛋白表达有关，从而达
到抑制ＮＦκＢ的活化，通过ＮＦκＢ／ＩκＢ信号转导途
径抑制ＴＮＦαｍＲＮＡ转录，以阻断ＴＮＦα的生物活
性和靶效应。
以上结果表明，中药茵陈醇提物对 ＦＦＡ的肝脂
毒性具有直接的、高强度的干预作用，其机制与有效
抑制ｃｔｓｂ表达从而抑制ＮＦκＢ活化等有关。
［参考文献］
［１］　 胡义扬．加强中医药治疗脂肪性肝病的深入研究［Ｊ］．中国中
西医结合杂志，２００４，２４（１）：１２．
［２］　 冯琴，张慧，胡义扬，等．祛湿化瘀方对单纯高脂饮食诱导的
大鼠脂肪肝的防治作用［Ｊ］．中西医结合肝病杂志，２００６（１）：
２６．
［３］　 张慧，冯琴，胡义扬，等．祛湿化瘀方对 ＣＣｌ４复合高脂低蛋白
饮食诱导的大鼠脂肪肝的防治作用［Ｊ］．上海中医药杂志，
２００６，４０（３）：５２．
［４］　 张慧，冯琴，李红山，等．祛湿化瘀方对非酒精性脂肪性肝炎
大鼠组织蛋白酶Ｂ和肿瘤坏死因子 α表达的影响［Ｊ］．中西
医结合学报，２００８，２３（９）：５１．
［５］　 张慧，胡义扬，冯琴，等．祛湿化瘀方对游离脂肪酸诱导的
ＨｅｐＧ２细胞脂肪沉积和 ＴＮＦα分泌的抑制作用［Ｊ］．中国中
西医结合杂志，２００７，２７（１２）：１１０７．
［６］　 陈少东，胡义扬，冯琴，等．基于均匀设计的祛湿化瘀复方抗
肝脂毒性作用的主效应中药分析［Ｊ］．中国中西医结合杂志，
２００８，２８（５）：４２２．
［７］　 胡义扬，张慧，陈少东，等．一种用于脂肪肝脂毒性药理研究
的体外模型［Ｊ］．中华肝脏病杂志，２００８，１６（２）：１２１．
［８］　 ＨｅｉｄｅｒＪＧ，ＢｏｙｅｔＲＬ．Ｔｈｅｐｉｃｏｍｏｌｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｆｒｅｅａｎｄ
ｔｏｔａｌｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｉｎｃｅｌｓｉｎｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．ＪＬｉｐｉｄＲｅｓ，１９７８，１９
（４）：５１４．
［９］　 姜彬．蛋白质免疫印记分析法实验条件的研究［Ｊ］．生物学研
究方法与技术，２００８，２５（５）：２０４．
［１０］　白丽，王晶．活细胞免疫荧光法在免疫偶合物研究中的应用
［Ｊ］．大理医学院学报，２００１，１２（４）：１．
［１１］　张新，蒲晓允．ＰＣＲ法检测人类脲原体Ｕ．Ｐａｒｖｕｍ和Ｕ．Ｕｒｅａ
ｌｙｔｉｃｕｍ［Ｊ］．第三军医大学学报，２００６，２８（１７）：１７８４．
［１２］　熊玉兰，周钟鸣，王彦礼，等．茵陈有效成分对四氯化碳损伤
的原代培养大鼠肝细胞的作用［Ｊ］．中国实验方剂学杂志，
２００２，８（１）：３２．
［１３］　杨家芬，欧阳颗．清热解毒中药对３种肠道寄生原虫的体外
·７７３２·
第３４卷第１８期
２００９年９月
　　　　　 　 　 　 　 　　　　　 　 　 　 　
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ　１８
　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２００９
抑制作用［Ｊ］．中国抗感染药杂志，２００１，１（１）：４３．
［１４］　杨太成，赵树进，冼江，等．茵陈提取物的纯化及体外抗肿瘤
作用［Ｊ］．广东医学，２００２，２３（２）：１４９．
［１５］　于永红，胡昌兴，孟卫星，等．茵陈、赤芍、三棱、淫羊霍对家兔
实验性动脉粥样硬化病灶的消退作用及原癌基因 Ｃ２ｍｙｃ，
Ｃ２ｆｏｓ，Ｖ２ｓｉｓ表达的影响［Ｊ］．湖北民族学院学报：医学版，
２００１，１８（２）：４．
［１６］　ＵｎｇｅｒＲＨ．Ｔｈｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙｏｆｃｅｌｕｌａｒｌｉｐｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｎｎｕ
ＲｅｖＰｈｙｓｉｏｌ，２００３，６５：３３３．
［１７］　ＦｅｌｄｓｔｅｉｎＡＥ，ＷｅｒｎｅｂｕｒｇＮＷ，ＣａｎｂａｙＡ，ｅｔａｌ．Ｆｒｅｅｆａｔｙ
ａｃｉｄｓｐｒｏｍｏｔｅｈｅｐａｔｉｃｌｉｐｏｔｏｘｉｃｉｔｙｂｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇＴＮＦαｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎｖｉａａｌｙｓｏｓｏｍａｌｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００４，４０：１８５．
［１８］　ＦｏｇｈｓｇａａｒｄＬ，ＷｉｓｓｉｎｇＤ，ＭａｕｃｈＤ，ｅｔａｌ．ＣａｔｈｅｐｓｉｎＢａｃｔａｓａ
ｄｏｍｉｎａｎｔｅｘｅｃｕｔｉｏｎｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｔｕｍｏｒｃｅｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙ
ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ［Ｊ］．ＪＣｅｌＢｉｏｌ，２００１，１５３：９９９．
ＲｅｓｅａｒｃｈｏｆＨｅｒｂａＡｒｔｅｍｉｓｉａｅＳｃｏｐｏｒｉａｅｉｎｈｉｂｉｔｓｔｈｅｈｅｐａｔｉｃｌｉｐｏｔｏｘｉｃｉｔｙ
ＣＨＥＮＳｈａｏｄｏｎｇ１，２，ＦＥＮＧＱｉｎ１，ＰＥＮＧＪｉｎｈｕａ１，ＸＵＬｉｌｉ１，ＬＩＵＰｉｎｇ１，ＬＩＵＣｈｅｎｇ１，ＨＵＹｉｙａｎｇ１
（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＬｉｖｅｒＤｉｓｅａｓｅｓｏｆＳｈｕｇｕａｎｇＨｏｓｐｉｔａｌ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＬｉｖｅｒｋｉｄｎｅｙＤｉｓｅａｓｅＰａｔｅｒｎｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，
ＥｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＳｈａｎｇｈａｉＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＳｈａｎｇｈａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，
Ｓｈａｎｇｈａｉ２０１２０３，Ｃｈｉｎａ；ＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｅｇｅＸｉａｍｅｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＸｉａｍｅｎ３６１００５，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｅｆｅｃｔｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＨｅｒｂａＡｒｔｅｍｉｓｉａｅＳｃｏｐｏｒｉａｅｉｎｈｉｂｉｔｓｔｈｅｈｅｐａｔｉｃｌｉｐｏｔｏｘ
ｉｃｉｔｙｍｏｄｅｌｉｎｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｒａｔｒｅｇｕｌａｒｓｅｒｕｍａｎｄｍｅｄｉｃｉｎｅｓｅｒｕｍ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｓａｆｔｙｏｆｍｅｄｉｃｉｎｅｔｈｉｃｋｎｅｓｓｂｙｔｏｘｉｃｉｔｙｔｅｓ
ｔｉｎｇ，ｎｏｒｍａｌａｎｄｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅａｄｄｅｄ１０％ ｎｏｒｍａｌｒａｔｓｅｒｕｍ，ＨｅｒｂａＡｒｔｅｍｉｓｉａｅＳｃｏｐｏｒｉａｅｇｒｏｕｐｗａｓａｄｄｅｄ１０％ ｍｅｄｉｃｉｎｅｓｅｒｕｍ
ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｆｏｒ２４ｈ，ＦＦＡｗａｓａｄｄｅｄｔｏａｌｔｈｅｇｒｏｕｐｓｂｕｔｔｈｅｎｏｒｍａｌｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｆｏｒ２４ｈ．Ｔｈｅｉｎｄｉｃｅｓｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｂｅｌｏｗ：ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆ
ｓｅｒｕｍｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒα（ＴＮＦα）ｂｙＥＬＩＳＡ，ｃｅｌｕｌａｒｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｃｏｎｔｅｎｔ（ＴＧ），ＯｉｌＲｅｄＳｔａｉｎｉｎｇ；ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｅｌｕｌａｒ
Ｂｃｌ２ＡｓｓａｃｉａｔｅｄＸｐｒｏｔｅｉｎ（Ｂａｘ），ｐｈｏｓｐｈｏＩκＢ（ＰＩκＢ）ａｎｄＣａｔｈｅｐｓｉｎＢ（ｃｔｓｂ）ｂｙＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｉｎｇ；ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｅｌｕｌａｒ
ＴＮＦα，ＢａｘａｎｄｃｔｓｂｂｙｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ；ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｃｔｓｂｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ａｆｔｅｒｂｅｉｎｇ
ｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈＦＦＡｆｏｒ２４ｈｏｕｒｓ，ＴＧｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆＨｅｐＧ２ｉｎｔｈｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐｉｎｃｒｅａｓｅｄｍａｒｋｅｄｌｙ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ，ｎｏｔ
ｏｎｌｙｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｓｅｒｕｍＴＮＦα，ｂｕｔａｌｓｏｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｅｌｕｌａｒｃｔｓｂ，ＰＩκＢａｎｄｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｔｓｂ，ＴＮＦαｉｎ
ｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．Ｃｏｎｔｒａｓｔｔｏｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，ＴＧｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎｄｅｃｒｅａｓｅｄｍａｒｋｅｄｌｙｉｎｔｈｅＨｅｒｂａＡｒｔｅｍｉｓｉａｅＳｃｏｐｏｒｉａｅｇｒｏｕｐ．ＴｈｅＨｅｒｂａ
ＡｒｔｅｍｉｓｉａｅＳｃｏｐｏｒｉａｅｉｎｈｉｂｉｔｅｄＴＮＦαｃｏｎｔｅｎｔ，ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｅｌｕｌａｒｃｔｓｂ，ＰＩκＢａｎｄｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＮＦαｓｉｇｎｉｆｉ
ｃａｎｔｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＨｅｒｂａＡｒｔｅｍｉｓｉａｅＳｃｏｐｏｒｉａｅｈａｓａｄｉｒｅｃｔｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｎＨｅｐＧ２ｓｔｅａｔｏｓｉｓａｎｄＴＮＦαｓｅｃｒｅｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙｌｏｎｇｃｈａｉｎ
ＦＦＡ．ＴｈｅｅｆｅｃｔｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＨｅｒｂａＡｒｔｅｍｉｓｉａｅＳｃｏｐｏｒｉａｅｉｎｈｉｂｉｔｓｔｈｅｈｅｐａｔｉｃｌｉｐｏｔｏｘｉｃｉｔｙｈａｓｃｌｏｓｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｎｔｈｅ
ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｔｓｂ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　ＨｅｒｂａＡｒｔｅｍｉｓｉａｅＳｃｏｐｏｒｉａｅ；ｆｒｅｅｆａｔｙａｃｉｄ；ＨｅｐＧ２；ｈｅｐａｔｉｃｌｉｐｏｔｏｘｉｃｉｔｙ
［责任编辑　古云侠］
·８７３２·
第３４卷第１８期
２００９年９月
　　　　　 　 　 　 　 　　　　　 　 　 　 　
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ　１８
　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２００９