全 文 :天麻素对高糖诱导的神经小胶质细胞 IL1β,
IL6表达的影响
杜晓红,毛瑞阳,刘毅,李颖,单亦升
(温州医学院 附属第一医院,浙江 温州 325000)
[摘要] 目的:研究天麻素对高糖诱导的神经小胶质细胞白介素1β(IL1β)、白介素6(IL6)表达的影响。方法:将体外
培养的小鼠小胶质瘤细胞(BV2细胞)分成对照组、高糖组、天麻素低、中、高(25,50,100mg·L-1)剂量组,培养24h,观察细
胞形态。应用酶联免疫吸附法(ELISA)测定培养上清中 IL1β,IL6蛋白浓度,应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法评价
IL1β,IL6mRNA表达。结果:与对照组相比,高糖组培养24h后,细胞出现聚集,胞体、胞核变大,枝状突起明显,胞浆内颗粒
物增多现象,天麻素各剂量组上述改变较轻。与对照组相比,高糖组细胞培养上清液中IL1β,IL6浓度,以及细胞内IL1β,IL
6mRNA表达明显增加,具有显著统计学差异(P<005);而与高糖组相比,天麻素各组细胞培养上清液中IL1β,IL6浓度,以
及细胞IL1β,IL6mRNA表达均降低,均具有显著统计学差异(P<005),其中以中浓度天麻素组最为显著,与高、低浓度组
相比,均具有显著统计学差异(P<005)。结论:天麻素能抑制高糖诱导的神经小胶质细胞IL1β,IL6表达。
[关键词] 天麻素;高糖;BV2细胞;白介素1β;白介素6
[收稿日期] 20080915
[通信作者] 杜晓红,Tel:13819739506,Email:yaya2556@sina.
com
糖尿病神经病变是糖尿病常见的慢性并发症之
一,糖尿病患者中老年性痴呆的发病率明显高于正
常老年人[1],主要表现为轻、中度认知功能障碍,学
习和记忆能力下降[2]。实验证实糖尿病动物脑细
胞在形态学、神经生化、神经电生理等方面均发生了
改变[3],糖尿病患者神经系统炎症因子,如 IL1,IL
6,TNFα等表达增加,这些炎症因子可加速神经细
胞的凋亡,使学习能力下降。因此,推测高糖引起的
神经细胞微炎症状态可能也是糖尿病患者认知障碍
的一个重要原因[46]。
天麻素是中药天麻的主要成分,具有改善痴呆
症状的作用。日本学者发现天麻素治疗老年性痴呆
症有效率可高达811%[7]。目前对于天麻素在抗
氧化、稳定细胞膜等方面的作用已做了大量研
究[8]。但是,天麻素是否能抑制微炎症状态,尚未
有文献报道。本实验进行体外细胞培养,研究天麻
素对高糖所致的微炎症状态的作用。
1 材料
1.1 药物
天麻素(纯度 >99%)购自中国药品生物制品
检定所(批号110807200205)。天麻素溶于 DMEM
高糖培养基中,配成40g·L-1溶液,过滤除菌后4
℃保存。葡萄糖溶液:采用分析纯葡萄糖粉溶于
DMEM高糖培养基中,配成2mol·L-1溶液,过滤除
菌后4℃保存。
1.2 细胞株及试剂
小鼠小胶质瘤细胞(BV2细胞)购自中国医学
科学院协和医科大学基础医学细胞中心(编号
0063)。DMEM高糖培养基购自 hyclon公司,胎牛
血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司,进口
分装IL1β,IL6的ELISA试剂盒购自RB生物科技
公司,总 RNA提取试剂、RTPCR试剂盒购自宝生
物工程有限公司,琼脂糖为西班牙 Biowest进口
分装。
1.3 仪器
超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公
司),相差倒置显微镜(Olympus),台式高速离心机
(BeckmanCounter),-30℃低温冰箱(SANYO),-
70℃低温冰箱(Haier),全套琼脂糖凝胶电泳装置
(北京六一仪器厂),凝胶成像系统(BioSenSC620),
PCR仪(EppendortmastercyclergradientImageMaster
VDS),凝胶自动成像仪(瑞典Pharmacia公司)。
2 方法
2.1 细胞培养
含体积分数为01的胎牛血清的 DMEM高糖
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培养基置37℃ ,5%CO2的培养箱内培养,每天换1
次培养液,2~3d传代1次,每次实验前无血清培养
24h,使细胞处于同步化状态。
2.2 分组
培养的BV2细胞随机分为5组:对照组、高糖
组、天麻素低、中、高剂量组。各组细胞吸去原培养
液后,用葡萄糖为25mmol·L-1DMEM培养液,高
糖组用葡萄糖为45mmol·L-1的高糖培养液,天麻
素组用含天麻素为25,50,100mg·L-1的高糖培
养液(葡萄糖为45mmol·L-1),37℃,5%CO2的培
养箱内培养24h。
2.3 细胞形态学观察
取对数生长期 BV2细胞以2×105个/孔的密
度接种于6孔培养板中,每组设3个平行孔。培养
24h后,倒置相差显微镜下观察各组细胞形态学
变化。
2.4 培养细胞上清中IL1β,IL6测定
将细胞以1×105个/孔的密度接种于96孔细胞
培养板内,每孔加 100μL,每组设 6个重复孔,
细胞贴壁生长至80%时换无血清培养液培养24h,
使细胞同步化后,再换含不同浓度葡萄糖以及天麻
素的培养液进行培养,24h后吸取上清,12000r
·min-1离心5min,提取细胞上清, -80℃保存
待测。实验时将对照品与细胞上清加入96孔板,
每组设3个复孔,根据 ELISA试剂盒说明测上清
液中蛋白浓度。
2.5 RTPCR法半定量检测培养细胞 IL1β,IL6
mRNA表达情况
2.5.1 引物 根据 GenBank设计 IL1β,IL6及 β
actin引物设计如下:IL1β上游引物5′TCAGGCAG
GCAGTATCAC3′,下游引物 5′TTACACAGGACAG
TATAGATTC3′,扩增长度390bp,退火温度54℃,
30循环。IL6上游引物 5′TTCACAAGTCCGGA
CAGGAG3′,下游引物5′TGGTCTTGGTCCTTAGC
CAC3′,扩增长度488bp,退火温度54℃,32个循
环。βactin引物:上游引物 5′CCCACTCCTAAGAG
GAGGATG3′,下游引物5′AGGGAGACCAAAGCCT
TCAT3′,扩增长度214bp,退火温度52℃,28个循
环。由上海捷瑞生物工程公司合成,聚丙酰胺凝胶
电泳纯化。
2.5.2 RTPCR 总 RNA提取:将培养的 BV2细
胞从培养箱取出,小心吸出培养液,每孔培养板中加
入Trizol05mL,反复吹打使细胞脱落,根据宝生物
生物工程公司试剂盒说明提取细胞总 RNA,在紫外
分光光度计下读取260/280波长下的吸光度(A),
计算A260/A280在18~20。逆转录法合成cDNA:根
据宝生物公司 RT试剂盒说明,所采用的逆转录体
系为MgSO42μL(25mmol·L
-1),2×Bca1stBufer
5μL,RNaseFreedH2O075μL,dNTPMixture(各
10mmol·L-1)05μL,RNaseInhibitor(40U·
μL-1)025μL,BcaBESTPolymerase(22U·μL-1)
05μL,Random9mers05μL,实验样品 RNA05
μL,反应总体系为10μL。PCR扩增:以IL1β,IL6
及βactin上下游引物分别扩增目的基因及内参对
照,进行PCR反应,扩增反应体系为MgSO43μL(25
mmol·L-1),5×Bca2ndBufer8μL,灭菌蒸馏水
2775μL,BcaOptimizedTaq025μL,上下游引物
分别为05μL,反应总体系为40μL。扩增条件为
94℃预变性5min,94℃变性30s,退火30s,延伸1
min,72℃末端延伸10min,各引物具体退火温度及
循环次数见2.5.1。扩增产物琼脂糖凝胶电泳:取
溴酚蓝加样缓冲液2,8μLPCR扩增产物,混匀后
点样于2%琼脂糖凝胶(含 EB05mg·L-1)加样
孔中,120V电泳20min。
2.5.3 半定量结果分析 将PCR反应产物进行琼
脂糖凝胶电泳,凝胶成像分析系统成像,对扩增产物
的电泳条带进行灰度扫描,GelPro31软件分析各
条带吸光度,分别计算IL1β,IL6基因与 βactin比
值,每次实验均重复3次。
2.6 统计方法
实验数据用 SPSS110统计软件处理,所有数
据均用 珋x±s表示,各组数据符合方差齐性及正态分
布,组间比较用 t检验或方差分析,P<005为有显
著性差异。
3 结果
3.1 天麻素对细胞形态的影响
正常BV2细胞在传代后2~4h即贴壁,生长
迅速,胞体较小,呈圆形,少量细胞有突起。高糖组
培养24h后,可发现较多细胞聚集成团,有的胞体
变得肥大,胞核大而圆,核仁明显;有的胞体变为梭
形,由胞体伸出1个或多个较长的枝状突起,细胞立
体感、折光度减弱,胞浆内颗粒物增多。而天麻素
组,这种改变相对不明显,细胞突触减少,立体感,折
光度增强(图1)。
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A.对照组;B.高糖组;C.天麻素25mg·L-1组;
D.天麻素50mg·L-1组;E.天麻素100mg·L-1组。
图1 天麻素对各组细胞形态的影响(×200)
3.2 天麻素对IL1β,IL6蛋白表达的影响
与对照组相比,高糖组培养上清液 IL1β,IL6
浓度明显升高,具有显著统计学差异(P<001)。
与高糖组相比,天麻素各组培养上清中 IL1β,IL6
浓度均明显降低,有显著统计学差异(P<001),其
中以天麻素50mg·L-1组最低,与天麻素 25,100
mg·L-1组相比,具有显著统计学差异(P<005)。
见表1。
表1 天麻素对IL1β,IL6蛋白表达的影响
(珋x±s,n=5) ng·L-1
组别
剂量
/mg·L-1
IL1β IL6
对照 - 2574±1572 12585±3662
高糖 - 11953±15911) 3937±17511)
天麻素 25 9932±19661,2,3) 32706±23531,2,3)
50 7694±17161,3) 21736±28811,2)
100 8835±18721,2,3) 26317±22321,2,3)
注:与对照组比1)P<001;与高糖组比2)P<005;与天麻素50
mg·L-1组比3)P<005(表2同)。
3.3 天麻素对IL1β,IL6mRNA表达的影响
RTPCR结果提示,高糖组培养24h后,IL1β,
IL6mRNA表达量明显高于对照组,具有显著统计
学差异(P<001),天麻素组,IL1β及 IL6的 mR
NA表达有所减少,与高糖组相比,均具有显著性差
异(P<001),其中以天麻素50mg·L-1组表达量
最少,与天麻素25,100mg·L-1组相比,具有统计
学差异(P<005),见表2。
表2 各组间细胞IL1β及IL6mRNA相对表达量
(珋x±s,n=5)
组别
剂量
/mg·L-1
IL1βmRNA IL6mRNA
对照 - 113±027 105±013
高糖 - 277±0291) 397±0331)
天麻素 25 266±0311,2,3) 328±0301,2,3)
50 21±0411,2) 265±0331,2)
100 24±0281,2,3) 304±0261,2,3)
4 讨论
神经小胶质细胞广泛分布于大脑和脊髓,是中
枢神经系统(CNS)的巨噬细胞[9]。持续激活的小胶
质细胞可释放大量炎性因子,如IL1β,IL6,TNFα,
以及一氧化氮(NO),可造成神经细胞损伤,影响神
经细胞功能[10]。因此,研究如何阻断或减少神经小
胶质细胞产生炎症因子具有重要意义。为此,本研
究选用BV2细胞系进行培养,研究天麻素对高糖
诱发产生IL1β,IL6的影响。
BV2细胞系[11]为携带癌基因v.raf/v.myc反
转录病毒J2感染原代培养的小鼠小胶质细胞而获
得永生细胞系。该细胞系高度纯化,基本具备了原
代培养的小鼠小胶质细胞的形态学、表型以及各项
功能特点,且相对较易培养,常用来代替正常小鼠小
胶质细胞进行实验。
本研究证实高糖能诱发 BV2细胞产生 IL1β,
IL6增多。有研究发现高血糖条件下,细胞产生糖
基化终末产物(AGE)增多[12],增多的 AGE通过激
活DAGPKC信号转导系统,产生大量的氧自由基
(ROS)和一氧化氮(NO)[13],二者作为一种前趋化
因子,激活小胶质细胞,导致炎性细胞因子大量生
成[14]。也有研究发现高糖环境下,多元醇通路的
活性增高,消耗了大量的 NADPH,同时激活了蛋白
激酶A(PKA),使NADPH生成减少,进而导致 GSH
水平下降,削弱了自由基清除系统,导致 ROS堆
积[15]。此外,高糖条件下,糖酵解途径中的代谢产
物堆积,转向其他代谢途径,其中,6磷酸果糖在谷
氨酰胺6磷酸酰氨转移酶的催化下进入氨基己糖
代谢途径,己糖胺通路激活可以上调基因转录。这
些因素可能是高糖诱发 BV2细胞产生 IL1β,IL6
的主要原因。
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本研究发现天麻素能抑制 BV2细胞产生细胞
因子,具体机制目前尚不清楚,推测可能与减少细胞
产生NO和 ROS有关。有研究显示天麻素能够减
少 LDH 漏出量,抑制 NOS活性,减少 NO产
生[1617]。天麻素还能增加细胞超氧化物歧化酶
(SOD)含量,降低丙二醛(MDA)含量,有效地清除
超氧阴离子自由基,减少自由基产生,抑制脂质过氧
化生成[1819]。天麻素的这些作用可能与抑制小胶
质细胞的活化和过度增生,减少前炎症细胞因子
(ILI,IFNγ,IL6,TNFα)的表达有关。此外,天麻
素还可能通过减轻小胶质细胞活化,上调 Bcl2和
下调Bax的表达,抑制调亡,减轻炎症反应。
总之,高糖可以诱发神经小胶质细胞分泌 IL
1β,IL6增多,而天麻素可抑制这种作用,但具体机
制尚不完全清楚,有待进一步研究。
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GastrodinerepressesexpressionofIL1β,IL6inducedby
hyperglycemiaingittercels
DUXiaohong,MAORuiyang,LIUYi,LIYing,SHANYisheng
(TheFirstAfiliatedHospitalofWenzhouMedicalColege,Wenzhou325000,China)
[Abstract] Objective:Inflammatoryfactorshavebeenknowntoinducenervecelsapoptosisanddecreaselearningcapacityof
diabetics.TheaimofthisstudyistoevaluatetheinhibitoryefectofGastrodineontheexpressionofinterleukin1β(IL1β),interleu
kin6(IL6)inculturingforgitercels(BV2cels)inducedbyhighconcentrationofglucose.Method:TheBV2celsincubatedin
vitrowithdiferentconcentrationsofglucoseandgastrodineweredividedintofivegroups:controlgroup(glucose:25mmol·L-1),
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highconcetrationofglucose(glucose:45mmol·L-1HCG)groupandGastrodinegroups(glucose45mmol·L-1withgastrodine25
mg·L-1(LG),50mg·L-1(MG),100mg·L-1(HG).Afterculturingfor24h,morphologicalchangesofcelswereobservedby
invertedphasecontrastmicroscope.ThesupernatantproteinofIL1βandIL6wasdetectedbyELISA.ThemRNAexpressionofIL1β
andIL6wasassessedbyReversetranscriptionpolymerasechainreaction(RTPCR).Result:Thecelswerepronedtoaggregate,
someofthemwithhypertrophy,distinctnucleoliandbranchshapedhyperplasyinHCGgroup,whilelesschangeinGastrodinegroups.
ThesupernatantproteinofIL1βishigherinHCGgroupthancontrolgroup(11953±1591)ng·L-1vs(2574±1572)ng·L-1
(P<001),butlowerinthegastrodinegroupsthanHCGLG(9932±1966)ng·L-1,MG(7694±1716)ng·L-1,HG
(8835±1872)ng·L-1vs(11953±1591)ng·L-1(P<005).ThesupernatantproteinofIL6proteinalsohigherinHCG
thancontrolgroup(3937±1751)ng·L-1vs(12585±3662)ng·L-1(P<001),andlowerinthegastrodinegroupsthan
HCG(LG32706±2353)ng·L-1,MG(21736±2881)ng·L-1,HG(26317±2232)ng·L-1vs(3937±1751)ng·
L-1,P<005).ThemRNAexpressionofIL1βwasincreasedsignificantlyhigherinHCGthancontrolgroup(277±029)vs
(113±027)(P<005),butdecreasedsignificantlyingastrodinegroupsthanHCGLGA(266±031),MGA(21±041),
HGA(24±028)vs(277±029)(P<005).ThemRNAExpressionofIL6washigherinHCGthancontrolgroup(397±
033)vs(105±013)(P<005,butloweringastrodinegroupsthanHCGLG(328±03),MG(265±033),HG(304±
026),vs(397±033)(P<005).Conclusion:GastrodinecaninhibittheexpressionofIL1β,IL6inculturedBV2celsin
ducedbyhighconcentrationofglucose.
[Keywords] gastrodine;highglucose;BV2cels;IL1β;IL6
[责任编辑 古云侠]
全国第八次中医药创新与发展学术研讨会暨首届新世纪中药科技创新论坛征文通知
由中华中医药学会主办、《中华中医药杂志》社承办的“全国第八次中医药创新与发展学术研讨会”将于2009年7月在辽
宁丹东举行。会议将邀请著名中医药专家、国家级课题组负责人、相关政策法规制定部门的领导做专题报告。现将有关征文
事宜通知如下:
一、征文内容:(1)读经典作临床的心得体会;(2)全国第一、二、三、四批名老中医、省级名老中医临床经验总结;(3)中医
药学科基础研究的新方法、新进展;(4)中医药学科临床研究的新思路;(5)名老中医用药心得,民间偏方、验方验案分析;(6)
中医药独特诊疗技术的发掘与应用;(7)中医药学科科研思路与方法学的研究;(8)中医药医疗器具、器械、设备的开发及临床
应用研究;(9)药用植物与中药(含民族医药,下同)鉴定新技术研究、中药资源开发与可持续利用发展研究及中药材规范化种
植(GAP)研究;(10)中药化学成分及有效成分的提取、分离、鉴定及分析研究,中药制剂技术、工艺及质量标准评价和稳定性
研究,中药炮制创新技术及规范化研究,中药药理、毒理及中药临床应用研究;(11)药事管理与法律法规研究;(12)中医药医
疗、教学及科研管理研究;(13)国家级、省部级、局级科研课题的最新研究进展及成果展示。
二、征文要求:(1)未正式公开发表过的论文。(2)论文力求主题鲜明、论据充分、资料详实。(3)稿件篇幅在4000字以内,
关键词3~8个,注明作者姓名、职称、单位、具体通讯地址、邮政编码、电子信箱等。(4)论文请寄打印稿并网络发送电子版,请在
信封上注明“丹东会议征文”,邮件以“作者姓名+丹东会议征文”命名。请用word文档以附件的形式发送,收到必复,若无回复,
请与编辑部联系。(5)每篇论文共收审稿费、版面费380元,稿件请自留底稿,恕不退稿。投稿时请同时寄出审稿费及版面费,截
止日期:2009年5月30日。
三、其他事宜:稿件经审稿录用后将在国家级中文核心期刊《中华中医药杂志》(原《中国医药学报》)2009年增刊上刊出。
参加大会学术交流者,由中华中医药学会颁发论文证书和国家Ⅰ类继续教育学分。如有意参会,请自备因私护照。
四、联系方式:北京市朝阳区和平街北口樱花路甲4号《中华中医药杂志》社(收);邮编:100029;电话:01064216650;E
mail:64216650@163.com。
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