全 文 ：金钱松内生真菌 ＪＪ１８杀螺作用实验研究
郭尚彬，陈 钧，王 妍，承 曦，祁红兵
（江苏大学 药学院，江苏 镇江 ２１２０１３）
［摘要］ 目的： 研究金钱松内生真菌ＪＪ１８的杀螺作用、活性部位及该菌株杀螺活性的传代稳定性，从而探
索其应用的可能性。方法：按照 ＷＨＯ的杀螺剂浸泡试验法观察不同处理下 ＪＪ１８发酵液杀螺效果。结果：ＪＪ１８菌
株发酵液的活性成分集中在胞外液，当胞外液浓度１０％时，７２ｈ杀螺率接近９０％，且发酵外液成盐后有良好的耐热
性，强光照下７ｄ内活性物质基本不改变，菌株传代稳定，杀螺活性成分集中在正丁醇萃取部位。结论：金钱松内生
真菌ＪＪ１８代谢产物的杀螺活性，有开发应用的可能性。
［关键词］ 钉螺；内生真菌；杀螺作用；金钱松；ＪＪ１８
［中图分类号］Ｒ２８５５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）０４０３８９０４
［收稿日期］ ２００７０８２３
［基金项目］ 江苏省２００４年度研究生创新计划项目（ｘｍ０４
５７）
［通讯作者］ 陈钧，Ｔｅｌ：（０５１１）８７８０１９６，Ｅｍａｉｌ：ｓｈｃｈｅｎ＠
ｕｊｓｅｄｕｃｎ
我国流行的血吸虫是日本血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ
ｊａｐｏｎｉｃｕｍＫａｔｓｕｒａｄｅ），钉螺（Ｏｎｃｏｍｅｌａｎｉａｈｕｐｅｎｓｉｓ
Ｇｒｅｄｌｅｒ）是日本血吸虫唯一的中间宿主［１］，消灭钉
螺是控制血吸虫病传播的关键［２］。植物［３，４］和化
学［５，６］灭螺药物是目前研究的主要方向。国内外许
多学者研究利用微生物的毒素或寄生来杀灭钉螺，
研究工作仍处于实验室研究阶段，被认为是生物灭
螺最有前景的一类［７］。放线菌（浅灰链霉菌 ２３０
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｏｌｕｓ２３０）［８］、紫红链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）［９］等）和细菌（凸形假单胞菌
（Ｐｓｕｄｏｍｏｍａｓｃｏｎｒｅｘａｃｈｅｓｔｅｒ）［１０］等）灭螺研究已有
报道，国内未见真菌灭螺研究报道。本研究室从金
钱松 Ｐｓｅｕｄｏｌａｒｉｘａｍａｂｉｌｉｓ分离得到的内生真菌
中［１１］，筛选出菌株ＪＪ１８（实验室编号）具有高效杀螺
活性［１２］。
作者从６个方面考察不同处理条件下菌株及其
发酵液的性质，旨在研究其应用的可能性，并为后续
纯化杀钉螺活性物质研究提供实验依据。
１ 材料和方法
１１ 仪器及试剂 高纯水机 ＲＯ－ＭＢ－１０Ｄ，杭州
永洁达膜分离设备厂；飞鸽离心机 ＴＤＬ－５－Ａ，上
海安亭科学仪器制造厂；ＳＰＸ－２５０Ｂ生化培养箱，
上海跃进集团；ＱＹＣ－２１１摇床，上海福玛试验设备
有限公司；ＮａＯＨ，石油醚，乙醚，醋酸乙酯，正丁醇，
聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（Ｔｗｅｅｎ８０），国药集
团化学试剂有限公司ＡＲ级；氯硝柳胺，江苏省血吸
虫病防治研究所提供。
１２ 供试生物材料 供试内生真菌 ＪＪ１８，由本院何
佳分离纯化，保存于江苏大学生药学研究室，经鉴定
为曲霉属（另文报道）。
供试钉螺：钉螺采自江苏省镇江市丹徒区江滩，
经江苏省血防所梁幼生教授鉴定为肋壳螺，系湖北
钉螺指名亚种Ｏｎｃｏｍｅｌａｎｉａｈｕｐｅｎｓｉｓｈｕｐｅｎｓｉｓ，将钉螺
洗净饲养１ｄ后，剔除死钉螺，挑选活力强的钉螺供
室内杀螺试验。
１３ 杀螺供试药液的制备 杀螺供试药液原液：使
用马铃薯葡萄糖液体培养基，基本配方为切块马铃
薯２０％、葡萄糖 ２％。上述培养基加入 １５％琼脂
为固体马铃薯葡萄糖培养基（ＰＤＡ）。每１０００ｍＬ
三角瓶内，入１００ｍＬ。将斜面保存的真菌于超净台
内切小块接种。２８℃，转速１２０ｒ·ｍｉｎ－１，发酵７ｄ，
发酵液在－７２℃与室温下反复冻融３次，经８层纱
布过滤后，得细胞内外代谢产物混合物，作为杀螺供
试药液原液。
ＪＪ１８发酵液胞内及胞外产物杀螺供试药液：将
发酵液于５０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１５ｍｉｎ，取上清液作为
含ＪＪ１８发酵液中细胞外代谢产物供试药液。将菌
丝体用去氯离子水清洗数次后，在－７２℃与室温下
反复冻融３次，经８层纱布过滤后，滤液上清为含
ＪＪ１８发酵液中细胞内代谢产物供试药液。
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１４ 杀螺试验 取１０ｍＬ供试药液，用去氯离子水
定容至１００ｍＬ（除特殊指明，本研究药液浓度均为
１０％）。分别浸泡１０只钉螺，２４，４８，７２ｈ，另设１ｍｇ
·Ｌ－１氯硝柳胺水溶液和无氯清水对照。一定时间
后，弃出药液，用去离子水反复冲洗钉螺３次，复苏
时间为３ｄ，水测法和压碎法统计钉螺的死亡数量。
试验重复３次，取平均值作为实验结果。水测法是
将待测钉螺浸泡于去离子清水中，置于室温下１ｄ，
凡能爬壁或吸附于壁的皆为活螺。未吸附于壁的，
继用压碎法检测［１３］。
１５ 菌株的传代稳定性试验 采用 ＰＤＡ固体培养
基斜面，接种６～８ｄ后，取孢子传代，经３代、５代和
７代后，取菌株在马铃薯葡萄糖液体培养基下发酵，
将发酵胞外液原液成盐（用１０ｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＯＨ溶液
调至ｐＨ７，下同），进行杀螺试验。
１６ 发酵液活性物质热稳定性试验 取发酵胞外
液原液及其成盐液１０ｍＬ于烧杯内，用保鲜膜封住
杯口，置于水浴锅内，在４０，６０，８０，１００℃（在电炉下
煮沸）条件下，加热３０ｍｉｎ后，加去氯离子水定容至
１００ｍＬ，进行杀螺试验。
取发酵胞外液原液及其成盐液各１０ｍＬ于烧杯
内，封住杯口，置于水浴锅内，８０℃条件下，分别加
热３０，６０，９０，１２０，３００ｍｉｎ后，加去氯离子水定容至
１００ｍＬ，进行杀螺试验。
１７ 多糖、蛋白质对灭螺活性的影响 在发酵胞外
液成盐液中加入９５％乙醇，使其终浓度为７５％。放
置后可析出沉淀，以４０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，５５
℃旋转蒸发除去乙醇，取清液１０ｍＬ，加去氯离子水
定容至１００ｍＬ（胞外液成盐），进行杀螺试验。
１８ 发酵液光照稳定性试验 取发酵胞外液原液
及其成盐液１０ｍＬ于烧杯内，封住杯口，放置于 ２５
℃室内白天有阳光照射处（１０００～１５００ｌｘ），分别
放置１，３，６，９，１５ｄ，有混浊产生的即刻抽滤。加去
氯离子水定容至１００ｍＬ，进行杀螺试验。
１９ 活性部位筛选 采用五部位法［１４］，将调成中
性的发酵胞外液原液１００ｍＬ，如图１进行分离。有
机相在鼓风干燥箱内５０～６０℃蒸发除去溶剂，有
机相加水至５０ｍＬ，低于００３％山梨酸甲酯助溶，分
成５组，将剪成圆形的铝质罐装饮料的薄铝片盖在
烧杯内钉螺上，迫使钉螺接触药液。进行７２ｈ杀螺
试验（每组相当于含２０％发酵胞外液原液），取平均
值作为实验结果。
图１ 五部位系统分离方法
２ 结果
２１ ＪＪ１８发酵液胞内及胞外代谢产物灭螺活性比
较 杀螺活性比较试验结果见表１。
表１ 细胞内外代谢产物杀螺效果
样品
浸杀钉螺死亡率／％
２４ｈ ４８ｈ ７２ｈ
胞外液 １０ １３３ ８６３
胞外液成盐 ００ １３３ ８３３
胞内液 ００ ３３ ２３３
胞内液成盐 ００ ００ ００
原液 ６６ １６６ ８３３
原液成盐 ６６ １３３ ８００
去氯水 ００ ００ ００
氯硝柳胺 ９００ １０００ １０００
表１表明：灭螺的活性成分主要集中在细胞外
液，细胞内液所表现出来的活性在成盐后消失，提示
可能是微酸性环境将钉螺致死。原液的灭螺效果，
是细胞内外产物联合作用的结果。
２２ 菌株传代对杀螺活性的影响 见表２。
表２ 菌株传代稳定性杀螺试验
样品
浸杀钉螺死亡率／％
２４ｈ ４８ｈ ７２ｈ
３代 ６６ １３３ ８６７
５代 ６６ １６７ ８３３
７代 １００ １３３ ８３３
去氯离子水 ００ ００ ００
氯硝柳胺 ９６７ １０００ １０００
表２表明：ＪＪ１８在实验室条件下其灭螺活性可
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以稳定的传代，显示了应用前景。
２３ 发酵液活性物质耐热性试验结果 见图１～
４。
图２ 温度对发酵液杀螺活性的影响
图３ 时间对发酵液杀螺活性的影响（８０℃）
图４ 光照对发酵液稳定性的影响
图２及图３表明：发酵胞外液原液呈酸性，其热
稳定性明显低于中性成盐状态。发酵胞外液成盐
后，８０℃加热３００ｍｉｎ，其灭螺活性仍非常稳定。图
４表明：发酵胞外液原液及其成盐液遇光后，灭螺活
性均呈下降趋势，但是在 ７ｄ之内，活力下降不显
著，具备实际应用的要求，比杀钉螺抗菌素“５３０”［１５］
等有优势。同时，提示ＪＪ１８菌株灭螺活性成分在自
然条件下可以降解，对环境友好。
２４ 多糖、蛋白质对灭螺活性影响试验结果 见表
３。
表３ 多糖、蛋白质对灭螺活性影响结果
样品
浸杀钉螺死亡率／％
２４ｈ ４８ｈ ７２ｈ
胞外液成盐 １００ １００ ８６７
胞外液成盐 １００ １３３ ８３３
去氯离子水 ００ ００ ００
氯硝柳胺 ９６７ １０００ １０００
表３表明：除去多糖、蛋白质后，没有影响到杀
螺效果。这排除了发酵液中可能存在的酸性多糖、
有毒多肽等对钉螺的致死效应。
２６ 活性部位筛选结果 见表４。
表４ ＪＪ１８发酵液不同部位提取物灭螺活性
样品 ７２ｈ浸杀钉螺的死亡率／％
石油醚有机相 ８０
乙醚有机相 １００
醋酸乙酯有机相 ５８０
正丁醇有机相 １０００
水层 ５６０
去氯离子水 ００
氯硝柳胺 １０００
低于００３％Ｔｗｅｅｎ８０ ００
表４表明：正丁醇部位效果最好，醋酸乙酯部
位、水层次之，石油醚、乙醚部位基本无活性。提示
灭螺活性成分是中等极性化合物，为分离纯化活性
成分研究工作提供了实验依据，相关研究正在进行。
３ 结论
ＪＪ１８号菌株发酵液胞外液具有明显抑螺、杀螺
效果，１０％浓度发酵液胞外液 ７２ｈ杀螺率接近
９０％；ＪＪ１８号菌株发酵液胞外液光照条件下在７ｄ
之内灭螺活性无明显下降，成盐后可以长时间耐受
高温；灭螺活性成分存在于胞外液正丁醇提取部位，
活性显著；ＪＪ１８菌株灭螺活性经７代传代试验，未见
任何改变。
ＪＪ１８发酵液中的灭螺活性成分、灭螺机制、对
人、畜和其它非靶动物的安全性及其对生态环境有
无负面影响，待进一步研究。
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ＪＪ１８ｆｒｏｍＰｓｅｕｄｏｌａｒｉｘａｍａｂｉｌｉｓ
ＧＵＯＳｈａｎｇｂｉｎ，ＣＨＥＮＪｕｎ，ＷＡＮＧＹａｎ，ＣＨＥＮＧＸｉ，ＱＩＨｏｎｇｂｉｎｇ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＪｉａｎｇｓｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｊｉａｎｇ２１２０１３，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｒｅｓｅａｒｃｈｍｏｌｕｓｃｉｃｉｄａｌｅｆｅｃｔａｃｔｉｖｉｔｙ、ａｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓａｎｄｓｔａｂｌｅｐａｓｓａｇｅｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｅＪＪ１８ｆｒｏｍ
ＰｓｅｕｄｏｌａｒｉｘａｍａｂｉｌｉｓａｎｄｅｘａｍｉｎｅｔｈｅｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙｆｏｒｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄ：Ｍｏｌｕｓｃｉｃｉｄａｌｅｆｅｃｔｔｅｓｔｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏ
ｔｈｅｉｍｍｅｒｓｉｏｎｔｅｓｔｍｅｔｈｏｄｓｕｇｇｅｓｔｅｄｂｙＷＨＯＲｅｓｕｌｔ：ＩｍｍｅｒｓｉｏｎｔｅｓｔｗｉｔｈＪＪ１８ｂｒｏｔｈｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅａｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｅｌ
ｌｕｌａｒｍｏｉｅｔｙｏｆｔｈｅｂｒｏｔｈａｎｄｔｈａｔ１０％ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｌｕｔｉｏｎｃｏｕｌｄｋｉｌｎｅａｒｌｙ９０％ ｓｎａｉｌｉｍｍｅｒｓｅｄａｆｔｅｒ７２ｈ，ｔｈｅｓａｌｉｆｉｅｄｂｒｏｔｈｈａｓｆａ
ｖｏｕｒａｂｌｅｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｙａｎｄｐｈｏｔｏｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＪＪ１８ｈａｓｓｔａｂｌｅｐａｓｓａｇｅａｎｄｉｔｓａｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｉｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｏｆ
ｎｂｕｔａｎｏｌＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｅＪＪ１８ｈａｓａｃｔｉｖｉｔｙｆｏｒｍｏｌｕｓｃｉｃｉｄａｌｅｆｅｃｔａｎｄｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｏｒａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｏｎｃｏｍｅｌａｎｉａｈｕｐｅｎｓｉｓ；ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ；ｍｏｌｕｓｃｉｃｉｄａｌｅｆｅｃｔ；Ｐｓｅｕｄｏｌａｒｉｘａｍａｂｉｌｉｓ；ＪＪ１８
［责任编辑 鲍 雷］
［收稿日期］ ２００６０４１０
［通讯作者］ 丁霞，Ｔｅｌ：（０２５）８４３９６６９７，Ｅｍａｉｌ：ｊｓｎｎｎｘｄ４０５＠
ｙａｈｏｏｃｏｍｃｎ
山茱萸中５羟甲基糠醛的分离鉴定及生物活性研究
丁 霞１，王明艳２，余宗亮２，胡 魏２，蔡宝昌２
（１．南京农业大学 应化系，江苏 南京 ２１００９５；
２．南京中医药大学，江苏 南京 ２１００２９）
［摘要］ 目的：探讨山茱萸炮制后补肝益肾作用增强的物质基础及５羟甲基糠醛（５ＨＭＦ）的生物活性。方
法：结合药理实验与化学研究筛选出活性部位，并从炮制品二氯甲烷活性部位中分离鉴定出主要单体成分，并进行
体内和体外药理试验，研究其生物活性。结果：单体化学成分为５羟甲基糠醛，它对小鼠ＣＣｌ４肝损伤模型和血管内
皮细胞具有保护作用，抗氧化作用是其保护作用的机制之一。结论：５羟甲基糠醛是山茱萸炮制品中的活性成分，
是补肝益肾作用的物质基础之一。
［关键词］ 山茱萸；５羟甲基糠醛；分离鉴定；生物活性
［中图分类号］Ｒ２８４．１；Ｒ２８５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）０４０３９２０５
山茱萸为山茱萸科植物山茱萸Ｃｏｒｎｕｓｏｆｉｃｉｎａｌｉｓ
Ｓｉｅｂ．ｅｔＺｕｃｃ的干燥成熟果肉，其临床常用的饮片有
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第３３卷第４期
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