全 文 ：蟾毒灵血浆蛋白结合率的测定
刘颖，陈志强，陶蓓蕾，冯年平，赵继会
（上海中医药大学 中药学院，上海 ２０１２０３）
［摘要］ 目的：建立血浆中蟾毒灵浓度的分析方法，测定蟾毒灵血浆蛋白结合率。方法：采用平衡透析法测定蟾毒灵血
浆蛋白结合率，利用ＨＰＬＣ测定血浆中蟾毒灵浓度，测定并比较大鼠和人血浆中蟾毒灵的血浆蛋白结合率。结果：在０１～１０
ｍｇ·Ｌ－１，药物浓度对血浆蛋白结合率无显著影响，蟾毒灵与大鼠和人的血浆蛋白结合率存在显著性差异，蟾毒灵与人血浆蛋
白结合率高于与大鼠血浆蛋白结合率。结论：蟾毒灵与血浆蛋白具有较强的结合。
［关键词］ 蟾毒灵；血浆蛋白结合率；平衡透析法
［收稿日期］ ２００９０５１０
［基金项目］ 上海市教委重点学科建设项目（Ｊ５０３０２）；上海市教委
优秀青年教师科研专项基金项目（ｓｚｙ０６０２２）
［通信作者］ 冯年平，Ｔｅｌ：（０２１）５１３２２１９８，Ｆａｘ：（０２１）５１３２２１９７，
Ｅｍａｉｌ：ｎｐｆｅｎｇ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
蟾毒灵（ｂｕｆａｌｉｎ）是从中华大蟾蜍 Ｂｕｆｏｇａｒｇａｒｉ
ｚａｎｓＣａｎｔｏｒ或黑框蟾蜍ＢｍｅｌａｎｏｓｔｉｃｔｕｓＳｃｈｎｅｉｄｅｒ皮
肤腺体及耳后腺体的分泌物中提取分离出的一种有
效成分，具有较强的抗肿瘤作用，作用机制涉及诱导
细胞凋亡、分化、抑制肿瘤的血管生成等［１３］。药物
血浆蛋白结合率是药物体内重要参数之一，不仅影
响药物代谢动力学，还密切关系到药物的药理作用
强度、作用机制等。蟾毒灵的大鼠在体肠吸收研究
表明蟾毒灵在小肠吸收较好［４］，但关于蟾毒灵的血
浆蛋白结合率未见文献报道，为此，本研究采用平衡
透析法测定了蟾毒灵的血浆蛋白结合率，为其进一
步研究提供依据。
１ 材料与仪器
蟾毒灵原料（江西本草天工科技有限公司，含
量＞９８％）；蟾毒灵对照品（Ｓｉｇｍａ公司）；甲醇（色谱
纯，上海安谱科学仪器有限公司）；水为纯化水；其
余试剂均为分析纯；正常人血浆由上海浦东新区血
站提供。
Ａｎｇｉｌｅｎｔ１２００高效液相色谱仪；ＡｇｉｌｅｎｔＧ１３１４Ａ
紫外检测器；ＢＰ２１０Ｓ电子天平（德国 Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）；
ＰＨＳ３Ｓ型ｐＨ计（上海精密科学仪器有限公司）；
ＤＫＢ５０１Ａ型超级恒温水槽（上海精宏实验设备有
限公司）；ＸＷ８０旋涡混合器（上海医科大学仪器
厂）；ＴＧＬ１６Ｂ离心机（上海安亭科学仪器厂）；透析
袋（截留相对分子质量１２０００～１４０００，上海源聚生
物科技有限公司）。
ＳＤ大鼠，２００±２０ｇ，清洁级，雄性，上海中医药
大学实验动物中心提供，合格证号 ＳＣＸＫ（沪）２００３
０００２。
２ 方法与结果
２．１ 溶液的配制
空白透析液的配制：每１０００ｍＬ内含磷酸氢二
钾１４１１ｇ，磷酸二氢钾２５９ｇ，氯化钠１９９ｇ（ｐＨ
７４）。蟾毒灵标准溶液的配制：精密称取蟾毒灵对
照品５０ｍｇ，于１０ｍＬ量瓶中，用甲醇溶解并稀释
至刻度，摇匀，得蟾毒灵贮备液（０５ｇ·Ｌ－１），于４
℃冰箱保存。分别用蒸馏水稀释配制成２５，６２５，
２５，５０，１００，１５０，２５０ｍｇ·Ｌ－１标准系列溶液 Ａ；用空
白透析液配制成１２５，２５，５，１２５，２０，２５ｍｇ·Ｌ－１
标准系列溶液Ｂ。
２．２ 分析方法的建立
２．２．１ 色谱条件 ＤｉａｍｏｎｓｉｌＣ１８色谱柱（４６ｍｍ×
２５０ｍｍ，５μｍ）；流动相甲醇水（７０∶３０）；流速 １０
ｍＬ·ｍｉｎ－１；柱温 ３０℃；检测波长 ３００ｎｍ；进样量
２０μＬ。
２．２．２ 透析液样品的预处理 精密取血浆样品
（透析内液）或透析外液样品０５ｍＬ，涡旋混匀后加
入乙醚醋酸乙酯（４∶１）２ｍＬ，涡旋３ｍｉｎ，于３０００ｒ
·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，将上层有机相转移至离心管
中，室温下氮气吹干，加入甲醇水（７０∶３０）１００μＬ，
超声１ｍｉｎ，涡旋１０ｓ，于１３０００ｒ·ｍｉｎ－１离心 １０
ｍｉｎ，取上清液２０μＬ进样。
２．２．３ 方法学验证 分别取空白血浆、空白透析液
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及含蟾毒灵的血浆样品或透析液样品，按照２２２
项下方法处理，在２２１色谱条件下测定，色谱图如
图１所示。空白血浆、空白透析液在此条件下对蟾
毒灵的测定无干扰。
ⅠＡ．空白大鼠血浆；ⅠＢ．空白大鼠血浆＋蟾毒灵；ⅠＣ．透析内液大鼠血浆样品；ⅡＡ．空白人血浆；ⅡＢ．空白人血浆＋蟾毒灵；
ⅡＣ．透析内液人血浆样品；ⅢＡ．空白透析液；Ⅲ Ｂ．空白透析液＋蟾毒灵；Ⅲ Ｃ．透析外液样品；１蟾毒灵。
图１ 蟾毒灵色谱图
透析内液：分别取空白大鼠血浆０５ｍＬ，加入
蟾毒灵标准系列溶液 Ａ２０μＬ，配制成蟾毒灵质量
浓度为０１，０２５，１０，２０，４０，６０，１０ｍｇ·Ｌ－１的
血浆标准溶液，按照２２２项下方法操作，进样，测
定。以蟾毒灵的峰面积（Ｙ）对血浆中蟾毒灵浓度
（Ｃ）作线性回归，得蟾毒灵的标准曲线方程为 Ｙ＝
４５０５８Ｃ＋６６５２６，ｒ＝０９９９１（ｎ＝６）。线性范围
０１～１０ｍｇ·Ｌ－１。定量限为 ０１ｍｇ·Ｌ－１。高、
中、低３种质量浓度（０２５，４，１０ｍｇ·Ｌ－１）的样品
方法回收率为９４３％ ～１０４０％（ｎ＝５），提取回收
率分别为：（８０５±４４）％，（８２６±６１）％，
（７９８±８５）％。日内精密度 ＲＳＤ均小于 ６％、日
间精密度ＲＳＤ均小于９％（ｎ＝６）。
透析外液：分别取空白透析液０５ｍＬ，加入蟾
毒灵标准系列溶液 Ｂ２０μＬ，配制成蟾毒灵质量浓
度为００５，０１，０２，０５，０８，１０ｍｇ·Ｌ－１的透析标
准溶液，按照２２２项下方法操作，进样，测定。以
蟾毒灵的峰面积（Ｙ）对血浆中蟾毒灵浓度（Ｃ）作线
性回归，得蟾毒灵的标准曲线方程为 Ｙ＝３７４９Ｃ＋
１２６８３，ｒ＝０９９９２（ｎ＝６）。线性范围００５～１０
ｍｇ·Ｌ－１。定量限为００５ｍｇ·Ｌ－１。高、中、低３种
质量浓度（０１，０５，１０ｍｇ·Ｌ－１）的方法回收率为
９７３％ ～１０１８％（ｎ＝５），提取回收率分别为：
（７２３±５１）％，（７５０±４４）％ ，（８１８±７２）％。
日内精密度ＲＳＤ均小于５％、日间精密度ＲＳＤ均小
于１０％（ｎ＝６）。
２．３ 蟾毒灵血浆蛋白结合率的测定
２．３．１ 实验方法 平衡透析法：实验前先将透析
袋预处理后在空白透析液中室温浸泡２４ｈ。取一端
扎紧的透析袋，除去袋内外水份，精密吸取１ｍＬ空
白血浆加至透析袋中，扎紧袋口，悬浮于盛有２０ｍＬ
含药透析液的蓝盖试剂瓶中，调整透析袋位置，透析
袋内外液面应保持同一水平，并避免贴瓶壁，密封瓶
口，置于３７℃ 恒温水浴中放置２４ｈ（在考察平衡时
间对血浆蛋白结合率的影响实验中，按照指定时间
放置）。透析结束时，吸取透析外液，加入等量３％
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三氯醋酸溶液检查是否有血浆蛋白漏出，若有白色
絮状物析出，则该样品作废［５］。无血浆蛋白漏出
者，分别取透析袋内外样品并测定药物浓度，血浆蛋
白结合率的计算公式如下［６］，其中，Ｄｔ为透析袋内血
浆药物浓度，Ｄｆ为透析外液药物浓度。
血浆蛋白结合率＝
（Ｄｔ－Ｄｆ）
Ｄｔ
×１００％
２．３．２ 透析膜物理吸附的考察 参照文献［７］方
法，考察透析膜对药物的物理吸附作用。结果为透
析平衡后低、中、高３种质量浓度（０１，０５，１０ｍｇ
·Ｌ－１）的样品透析膜吸附率（透析膜吸附的药物量
占总药物量的百分比）分别为（３３８±１５５）％，
（２８５±１６１）％，（２９２±１３８）％，表明存在微量
吸附作用，并且吸附作用不受浓度的影响，但对测定
结果无显著影响，因此，透析膜对药物的物理吸附作
用可忽略不计。
２．３．３ 平衡时间的考察 取空白透析液１ｍＬ加至
透析袋中，扎紧袋口，分别置于 ２０ｍＬ蟾毒灵为
０１，０５，１０ｍｇ·Ｌ－１透析液中（ｎ＝３），按照２３１
方法操作，分别于 ８，１２，２４，３２ｈ结束实验，按照
２２２项下方法操作，分别测定透析袋内外的蟾毒
灵浓度，计算血浆蛋白结合率。结果如图２所示。
结果表明：蟾毒灵透析达到平衡时间约为２４ｈ。
图２ 蟾毒灵在不同时间下的血浆蛋白结合率
（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
２．３．４ 不同因素对药物血浆蛋白结合率的影响
药物浓度：精密吸取空白血浆１ｍＬ加至透析袋中，
扎紧袋口，分别置于２０ｍＬ含蟾毒灵０１，０５，１０
ｍｇ·Ｌ－１透析液中（ｎ＝３），按照２３１方法操作，分
别测定透析袋内外的蟾毒灵浓度，计算血浆蛋白结
合率。低、中、高３种浓度样品血浆蛋白结合率分别
为：（９０８±１７）％，（９００±０８）％，（８９１±
０７）％。经统计分析，结果无显著性差异，表明在
该浓度范围内浓度因素对大鼠血浆蛋白结合率无显
著性影响。
血浆种类：人血浆作为透析内液（ｐＨ７４），按
照２２３项下透析内液的处理方法，将空白大鼠血
浆替换为正常人血浆，其余方法相同，制备的标准曲
线方程Ｙ＝６８０６１Ｃ－１４８５１，ｒ＝０９９９６（ｎ＝６）。
线性范围０１～１０μｇ· ｍＬ－１。定量限为０１ｍｇ·
Ｌ－１。高、中、低 ３种质量浓度（０２５，４，１０ｍｇ·
Ｌ－１）的样品方法回收率为 ９４３％ ～１０４０％
（ｎ＝５），提取回收率分别为 （８０５±４４）％，
（８２６±６１）％，（７９８±８５）％。日内精密度 ＲＳＤ
均小于９％、日间精密度 ＲＳＤ均小于１１％（ｎ＝６）。
考察在低、中、高３种质量浓度下（０１，０５，１０ｍｇ
·Ｌ－１）蟾毒灵与人血浆蛋白结合率，结果分别为
（９８５±０８）％，（９７２±０７）％，（９７４±１４）％。
经过ｔ检验分析，无显著性差异，表明在０１～１０
ｍｇ·Ｌ－１，浓度因素对人血浆蛋白结合率无显著性
影响。
经过ｔ检验分析比较蟾毒灵与大鼠和人的血浆
蛋白结合率，结果存在显著性差异（Ｐ＜００５），表明
不同种属之间的血浆蛋白结合率是不同的，蟾毒灵与
人血浆蛋白结合率要高于与大鼠的血浆蛋白结合率。
３ 讨论
目前，国内外研究药物血浆蛋白结合率测定方
法包括平衡透析法、超滤法、超速离心法、透析法、光
谱法等［８９］，其中，平衡透析法是测定血浆蛋白结合
率的经典方法，较为常用，该法的优点是可以在平衡
状态下测定透析袋内外药物的浓度，根据公式计算
即可知药物的血浆蛋白结合率，操作方法简单［１０］。
采用平衡透析法测定药物的血浆蛋白结合率时，透
析膜的截留相对分子质量大小对实验结果将产生一
定的影响。血浆中参与与药物结合的蛋白有：白蛋
白（相对分子质量６５０００）、酸性糖蛋白（相对分子质
量４４０００），脂蛋白（相对分子质量 ２０万～３４０万），
其中前两者是最重要的与药物结合的蛋白组分。合
适的透析袋应该既能确保药物分子能够及时释放、
对药物的物理吸附低，又要确保血浆中的成分及内
源性物质在透析的过程中能较稳定存在于透析袋
内，避免大量进入透析外液，尽可能地接近体内环
境，同时保持恒定的环境温度、ｐＨ、离子强度，在此
基础上体外测得的数据才能最大限度地反映体内情
况。本实验中采用截留相对分子质量为１２０００～１４
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０００的透析膜进行实验，由 ＨＰＬＣ图可知，与空白透
析液的样品相比，透析外液的样品图谱基线较平稳，
无明显杂质峰，表明血浆中并无大量内源性物质从
透析袋中渗出。此外，透析袋对药物的吸附微量，不
影响测定结果，表明采用该型号的透析膜以平衡透
析法测定蟾毒灵的血浆蛋白结合率是可行的。
本实验根据相关参考文献设定了用于血浆蛋白
结合实验的蟾毒灵浓度范围［１１１２］。本实验结果表
明，蟾毒灵与人血浆蛋白结合率约为９７％ ，属于高
血浆蛋白结合，且在实验浓度内蛋白结合率与透析
液中药物浓度无关。由血中游离药物的作用机制可
知，高结合率药物只有少部分游离药物作为活性药
物分子参与体内药物处置，继而发生药理效应，在体
内受病理因素或其他因素影响若药物血浆蛋白结合
率发生变化时，可能对药物的药理作用产生影响，如
存在竞争结合蛋白位点的物质将药物置换后，游离
型的药物浓度增加，易导致毒性反应。因此，在其应
用时应注意病理因素及与其他药物合用时对血浆蛋
白结合率的影响。值得注意的是药理效应的变化除
了受药物血浆蛋白结合的影响之外，还与药物与蛋
白的结合性质、治疗浓度范围、内在清除率、分布容
积、药动药效平衡时间、给药方式等都有关系［１８］。
所以，在合理分析药物血浆蛋白结合对药效或毒性
的影响时，同时也要考虑其他影响因素。蟾毒灵的
体内行为有待于进一步研究。
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Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｌａｓｍａｐｒｏｔｅｉｎｂｉｎｄｉｎｇｒａｔｅｏｆｂｕｆａｌｉｎ
ＬＩＵＹｉｎｇ，ＣＨＥＮＺｈｉｑｉａｎｇ，ＴＡＯＢｅｉｌｅｉ，ＦＥＮＧＮｉａｎｐｉｎｇ，ＺＨＡＯＪｉｈｕｉ
（ＳｈａｎｇｈａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０１２０３，Ｃｈｉｎａ）
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