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Arbuscular mycorrhizae in Paris polyphylla var.yunnanensis

滇重楼丛枝菌根的研究



全 文 :滇重楼丛枝菌根的研究
周浓1,夏从龙1,姜北1,白志川2,刘光明1,马晓匡1
(1.大理学院 药学院,云南 大理 671000;
2.西南大学 园艺园林学院,重庆 400716)
[摘要] 目的:研究滇重楼根部丛枝菌根真菌(AMF)侵染情况及根际土中 AMF孢子的种类与数量。方法:采用 Philips
和Hayman染色法挑选滇重楼丛枝菌根。同时,采用 Gendemann的湿筛倾析法获得 AMF孢子,进行形态学鉴定。结果:丛枝
菌根真菌能侵染滇重楼根系并形成典型的丛枝菌根(AM),侵染率在353% ~986%,且侵染强度较强。从滇重楼根际采集
的10个土样中共分离出24种AMF,Acaulospora属11种,Glomus属7种,Gigaspora属3种,Scutelospora属3种,分别是附柄无
梗囊霉、双网无梗囊霉、凹坑无梗囊霉、孔窝无梗囊霉、浅窝无梗囊霉、光壁无梗囊霉、柯氏无梗囊霉、多果无梗囊霉、波兰无梗
囊霉、瑞氏无梗囊霉、细凹无梗囊霉、白色球囊霉、双型球囊霉、沙荒球囊霉、草莓球囊霉、纯黄球囊霉、微丛球囊霉、凹坑球囊
霉、微白巨孢囊霉、珠状巨孢囊霉、分支巨孢囊霉、美丽盾巨孢囊霉、透明盾巨孢囊霉、吉尔莫盾巨孢囊霉。其中,双网无梗囊霉
是滇重楼的优势种。结论:AMF是滇重楼丰产栽培中的一种潜在应用价值的生物资源。
[关键词] 滇重楼;丛枝菌根真菌;丛枝菌根;双网无梗囊霉
[收稿日期] 20081124
[基金项目] 大理学院药物研究所科研项目(2008YY006)
[通信作者] 周浓,Tel:(0872)2257411,Email:erhaizn@126.com
  丛枝菌根真菌(arbuscularmycorhizalfungi,
AMF)是一类与植物共生的真菌,能够与绝大多数
的陆地植物结成共生体———丛枝菌根(arbuscular
mycorhizal,AM)[1]。AM的形成能促进植物对营养
元素的吸收和生长发育,提高植物的抗性,促进药用
植物有效成分的合成,在提高宿主植物的产量和质
量方面起重要作用[25]。
滇重楼为百合科植物云南重楼 Parispolyphyla
Smithvar.yunnanensis(Franch.)Hara的干燥根
茎[6],具有较强的生物活性(抗癌、抗生育、抗微生
物、镇痛、镇静、止血等),又是传统医学中一味功效
显著的中药材(消肿止血、清热解毒、凉肝定惊等),
应用较广[7]。在云南,重楼又是一些著名中成药,
如云南白药、宫血宁胶囊、楼莲胶囊、热毒清胶囊等
的主要原料之一,直接关系到云南省多个中成药产
品的生存与发展,每年仅云南省的用量就达数百吨,
市场需求量较大。由于长期掠夺式的采挖,缺乏保
护,资源日益减少,重楼的工业药用原料出现严重紧
缺,现已列为云南省 30种稀缺濒危天然药物之
一[8]。滇重楼的AM尚未见报道。本研究对滇重楼
根部是否有 AMF的侵染、侵染情况、AMF的种类、
组成、优势种等情况进行了研究,以期为将来通过接
种AMF来提高滇重楼的产量和质量,扩大人工栽培
区提供依据。
1 材料
1.1 仪器
DMBA300B生物显微镜(Motic),SMZ168体
视显微镜(Motic),显微图像采集与分析系统(Mot
ic),TDL40B台式离心机(上海安亭科学仪器厂),
W2018型恒温水浴锅(上海申生科技有限公司),
SZ93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器
厂),AE240天秤[梅特勒一托利多仪器(上海)有限
公司],350目标准检验筛(浙江上虞市肖金筛具
厂)。
1.2 试剂
氢氧化钾、过氧化氢溶液、浓盐酸、苯酚、乳酸、
甘油、锥虫蓝、聚乙烯醇、碘、水合氯醛、碘化钾、苯胺
蓝(水溶)、蔗糖、福尔马林、冰醋酸、无水乙醇均为
分析纯,水为2次蒸馏水。
1.3 样品
2008年7月在大理地区的10个不同的滇重楼
分布区进行多点采集,采集滇重楼根系及根际土,每
个采集点按随机法选取5株样,除去5cm厚的表层
土后,采集滇重楼根际5~20cm的滇重楼根系及根
际土,装入塑料袋内注明标签,密封带回。根样清水
洗净后剪成1cm长根段置于 FAA固定液中固定;
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土样风干后装入塑料袋中于4℃冰箱保存。
样品由大理学院药学院生药学教研室马晓匡教
授鉴定为百合科植物云南重楼 P.polyphylavar.
yunnanensis的干燥根茎。
2 方法
2.1 菌根侵染分级及计算公式
2.1.1 菌根侵染分级标准 采用 Philips和 Hay
man的染色方法[9],进行根样的染色,在显微镜下观
察菌根形态,并统计菌根侵染根段数,计算菌根菌侵
染率。1级 侵染的营养根数占0~5%;2级 6% ~
25%;3级 26% ~50%;4级 51% ~75%;5级
76%~100%。
2.1.2 菌根侵染率计算公式 每个样品在显微镜
下镜检100个1cm长的根段,观察其中的AM真菌
结构,并用网格交叉法计算根系菌根侵染率[10]。
侵染率=侵染根的根段数/被检查的根段总数×100%。
2.1.3 菌根侵染强度标准(一般取5~6个视野记
数) “+”表示弱,根内真菌丛枝及孢囊较少,零星
分布;“”表示中,根内真菌丛枝及孢囊较多,分布
均匀;“”表示强,根内真菌丛枝及孢囊密布,连接
成片。
2.2 AMF的分离、鉴定与统计
采用Gendemann[11]的湿筛倾析法进行 AMF孢
子的分离。将从滇重楼根际土壤中分离的 AMF孢
子在MOTIC显微镜下检查孢子的形态特征,把孢
子分别放在蒸馏水、乳酸、棉蓝酚、聚乙烯醇乳
酸甘油(PVLG)、聚乙烯醇乳酸酚(PVL)、Melzer's
试剂中观察,鉴定到种[1215]。并统计孢子总数及出
  
现频率。
3 结果与分析
3.1 自然条件下滇重楼的菌根侵染情况
通过染色研究发现,在10个不同立地条件采集
的样品,采集时间2008年7月,均有菌根侵染,且全
部属于AM类型。AMF侵染宿主滇重楼的根系并
形成典型的 AM。AMF在宿主根系外蔓延生长,形
成外生菌丝,根外孢子偶见;同时,菌丝在宿主皮层
细胞间延伸生长,形成内生菌丝,并分支进入细胞内
发育成丛枝结构,在细胞内和细胞间形成多种形状
的泡囊(图1)。结果表明不论在自然环境,还是人
工栽培条件下,滇重楼确有AM存在,侵染率一般为
353%~986%,且侵染强度较强(表1)。
A.根外菌丝(Eh);B.根内菌丝(Th)及泡囊(V);
C.丛枝(A);D.双网无梗囊霉。
图1 滇重楼的AMF侵染(×400)
表1 不同立地条件下滇重楼丛枝菌根侵染情况
No. 采集地点
海拔
/m
栽培方式
采集数
/株
侵染率
/%
侵染级数 侵染强度
1 宾川县宾居镇乌龙坝村 2573 野生 5 636 4 
2 鹤庆县黄坪镇水槽村 1761 野生 5 895 5 
3 大理市喜州镇花甸坝药材场 2980 野生 5 964 5 
4 云龙县漕涧镇固东平村1组1号 2350 家种 5 575 4 
5 大理市喜州镇花甸坝药材场 2925 家种 5 378 3 +
6 大理市下关镇大理学院校园 2040 家种 5 353 3 +
7 云龙县漕涧镇固东平村1组2号 2421 家种 5 986 5 
8 宾川县鸡足山镇风景管理区 2063 野生 5 458 3 +
9 云龙县漕涧镇固东平村1组3号 2253 家种 5 903 5 
10 云龙县漕涧镇固东平村2组 2447 家种 5 917 5 
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3.2 菌根菌种类及其组成
在10个土壤样品中共分离出24种 AMF,分别
是附柄无梗囊霉、双网无梗囊霉、凹坑无梗囊霉、孔
窝无梗囊霉、浅窝无梗囊霉、光壁无梗囊霉、柯氏无
梗囊霉、多果无梗囊霉、波兰无梗囊霉、瑞氏无梗囊
霉、细凹无梗囊霉、白色球囊霉、双型球囊霉、沙荒球
囊霉、草莓球囊霉、纯黄球囊霉、微丛球囊霉、凹坑球
囊霉、微白巨孢囊霉、珠状巨孢囊霉、分支巨孢囊霉、
美丽盾巨孢囊霉、透明盾巨孢囊霉、吉尔莫盾巨孢囊
霉(表2)。其中,无梗囊霉属 Acaulospora11种,球
囊霉属 Glomus7种,分别占分离出菌根菌的
458%,292%,是滇重楼根系重要的菌根菌种群。
此外,巨孢囊霉属 Gigaspora3种,盾巨孢囊霉属
Scutelospora3种,均占分离出菌根菌的125%。可
以看出,滇重楼能与 AMF形成 AM,而且 AMF的种
类丰富,有些种类的数量较多,是某些样点的优势种
(表3)。因此,AMF也是滇重楼丰产栽培中的一种
潜在应用价值的生物资源。
3.3 不同采集地点的菌根菌组成
将不同采集地点的土样中所拥有的 AMF分别
归类,可以看出,不同条件下,滇重楼根际土中的菌
根菌的种类和数量有所不同(表3)。
表2 滇重楼菌根菌名录
No. 中文名 学名
1 附柄无梗囊霉 Acaulosporaappendicola
2 双网无梗囊霉 A.brieticulata
3 凹坑无梗囊霉 A.excavata
4 孔窝无梗囊霉 A.foveata
5 浅窝无梗囊霉 A.lacunosa
6 光壁无梗囊霉 A.laevis
7 柯氏无梗囊霉 A.koskei
8 多果无梗囊霉 A.myriocarpa
9 波兰无梗囊霉 A.polonica
10 瑞氏无梗囊霉 A.rehmi
11 细凹无梗囊霉 A.scrobiculata
12 白色球囊霉 Glomusalbidum
13 双型球囊霉 G.ambisporum
14 沙荒球囊霉 G.deserticola
15 草莓球囊霉 G.fragarioides
16 纯黄球囊霉 G.luteum
17 微丛球囊霉 G.microaggregatum
18 凹坑球囊霉 G.multiforum
19 微白巨孢囊霉 Gigasporaalbida
20 珠状巨孢囊霉 G.margarita
21 分支巨孢囊霉 G.ramisporophora
22 美丽盾巨孢囊霉 Scutelosporacalospora
23 透明盾巨孢囊霉 S.pelucida
24 吉尔莫盾巨孢囊霉 S.gilmorei
表3 不同采集地点的AMF组成
采集地点
序号
菌根菌序号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
1 - + - - - - - - - - - - - - - + - - - - - - - -
2 - + - - - - - + - - - - + + - - - - - - - - - - 
3 - + - + - - - - - + + - - - - - - - - - - - - - 
4 - + + - + - - - - - + - - - - - - - + + + + - + 
5 - + + - - + - - - - - - - - - - - - - - - - - - 
6 - + - - - - - - + - - - - - - - + + - - - - - - 
7 + + + + + - - - - - - - - - + - - - + - - - - - 
8 - + - - + - - - - - + - - - - - - - - - - - - - 
9 - + - - - - + - - - - + - - + - - - - + - - - - 
10 - + - + - - - - - - - - - - - - - - - + + - + - 
  注:“+”表示“有”;“-”表示“无”;优势种为2号菌根菌双网无梗囊霉。
  从表3可以看出,云龙县漕涧镇固东平村1组
1号所采集的土样中 AMF的种类最多,共有9种,
占分离AMF总数的375%;云龙县漕涧镇固东平
村1组 2号次之,计有 7种,占分离 AMF总数的
292%;宾川县宾居镇乌龙坝村最少,只有2种,占
分离AMF总数的83%。其中,双网无梗囊霉在所
有土样中均有出现,而且是优势种(图1)。其次是
凹坑无梗囊霉、孔窝无梗囊霉、浅窝无梗囊霉、细凹
无梗囊霉、珠状巨孢囊霉出现了3次,因此,无梗囊
霉属是滇重楼常见及优势种群。草莓球囊霉、微白
巨孢囊霉、分支巨孢囊霉出现了 2次,附柄无梗囊
霉、光壁无梗囊霉、柯氏无梗囊霉、多果无梗囊霉、波
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兰无梗囊霉、瑞氏无梗囊霉、白色球囊霉、双型球囊
霉、沙荒球囊霉、纯黄球囊霉、微丛球囊霉、凹坑球囊
霉、美丽盾巨孢囊霉、透明盾巨孢囊霉、吉尔莫盾巨
孢囊霉只出现了1次。
4 讨论
菌根的实验显示,滇重楼不论在自然环境还是
人工移植栽培均可与AMF形成典型的菌根,故滇重
楼也是一类菌根营养型植物。因此,通过人工接种
AMF在提高滇重楼繁殖率、人工移植栽培成活率等
方面具有非常广阔的应用前景。
滇重楼的菌根类型属 AM,已知滇重楼 AMF
24种,隶属4个属,包括无梗囊霉属、球囊霉属、
巨孢囊霉、盾巨孢囊霉。其中,无梗囊霉属、球囊
霉属分别为11种、7种,是滇重楼菌根菌中的最
大种群,也是滇重楼常见及优势种群。双网无梗囊
霉在采集的样品均有出现,而且是优势种,该菌种
是我国滇重楼上的重要菌根菌种,也是大理地区重
要的资源菌种之一。
本研究中,土壤中AMF孢子种类以及总数在天
然条件和人工栽培2种不同生长环境下有差异。同
一条件下(50g土样)筛选孢子的种类及数量,云龙
县漕涧镇固东平村1组1号、2号采集的土样中明
显多于宾川县宾居镇乌龙坝村野生的土样;即使是
采集同一地点的云龙县漕涧镇固东平村1组1号、2
号、3号样品,也有明显差异。造成这种情况的原
因,可能是由于滇重楼生长环境的土壤条件不同而
导致野生滇重楼AMF丰度不如家种滇重楼高,云龙
县漕涧镇等家种滇重楼栽培区的土壤类型为紫色
土、土壤质地为砂土或轻壤土,利于 AMF的侵染和
扩展、生长和发育,而宾川县宾居镇乌龙坝村等野生
滇重楼分布区的土壤类型为黄壤、土壤质地为黏土,
不利于AMF的侵染和扩展、生长和发育。土壤条件
是影响菌根真菌的重要因子之一,不同土壤类型和
土壤质地中AMF种类和数量分布有差异,主要是由
于其影响 AMF的侵染和扩展、生长和发育等所
致[16]。另外也有研究表明[17],许多生态因子对
AMF的侵染、孢子形成和种类分布也有着较大的影
响,尤其是气候环境、海拔、土壤类型和土壤理化性
质的影响作用最大。大理地区滇重楼根部自然与人
工栽培条件下 AMF孢子的种类及数量存在差异的
原因有待于进一步深入研究。
本研究仅在滇重楼分布区的局部地域采样,仅
反应调查结果,不能完整反映出滇重楼AMF的组成
及优势种等。所分离出的菌根菌尚未进行有关回接
试验,各菌种对滇重楼的侵染、促生效果及应用前
景,特别是优势种双网无梗囊霉在滇重楼上的应用
前景,还有待进一步研究。在今后的研究试验中,将
对滇重楼进行人工接种对比试验,进行滇重楼的主
要药用成分重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ等指标的测定,
为无公害滇重楼的丰产栽培提供理论依据。
[致谢] 云龙县漕涧镇固东平村药农李旺桉在采集样
品过程中提供帮助。
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ArbuscularmycorrhizaeinParispolyphylavar.yunnanensis
ZHOUNong1,XIAConglong1,JIANGBei1,BAIZhichuan2,LIUGuangming1,MAXiaokuang1
(1.ColegeofPharmacyDaliUniversity,Dali671000,China;
2.ColegeofHorticultureandLandscapeArchitectureSouthwestUniversity,Chongqing400716,China)
[Abstract] Objective:Tostudytheinfectionsituationofarbuscularmycorhizalfungi,aswelasthemycorhizalstructuresof
Parispolyphylavar.yunnanensis,andthemaintypesandquantitiesofAMFsporesinrhizospheresoil.Method:Thearbuscularmy
corhizalofP.polyphylavar.yunnanensisweredetectedbyPhilipsandHaymanstaining.Atthesametime,someAMFsporeswere
accessedbyGendemann'sWetscreeningmethodandidentifiedbytheirmorphologicalcharacteristics.Result:Arbuscularmycorhizal
fungicouldinfecttherootsofP.polyphylavar.yunnanensisandformedarbuscularmycorhizal.Infectionratewasfrom35.3% to
98.6%,indicatingthatinfectionstrengthwasstrong.From10soilsamplescolectedinYunnan,11Acaulosporspecies,7Glomus
species,3Gigasporaspeciesand3Scutelosporaspecieswereisolatedandidentified,includingAcaulosporaappendicola,A.brieticula
ta,A.excavata,A.foveata,A.lacunosa,A.laevis,A.koskei,A.myriocarpa,A.polonica,A.rehmi,A.scrobiculata,Glomusal
bidum,G.ambisporum,G.deserticola,G.fragarioides,G.luteum,G.microaggregatum,G.multiforum,Gigasporaalbida,G.mar
garita,G.ramisporophora,Scutelosporacalospora,S.pelucidaandS.gilmorei.Amongthem,Acaulosporabrieticulatawasadvan
tagespecies.Conclusion:AMFmaybeapotentbiologicalresourcewhichcanstimulatethegrowthofP.polyphylavar.yunnanensis.
[Keywords] Parispolyphylavar.yunnanensis;arbuscularmycorhizalfungi;arbuscularmycorhizal;Acaulosporabrieticulata
[责任编辑 吕冬梅]
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