全 文 ：ＨＰＬＣ测定牛黄解毒丸中番泻苷 Ａ和番泻苷 Ｂ的含量
戴传云１，高晓燕２，汤波１，傅亚１，刘火安１
（１．重庆科技学院 生物系，重庆 ４０１３３１；２．北京中医药大学 中医药科技发展中心，北京 １０００２９）
［摘要］　目的：建立测定牛黄解毒丸中番泻苷Ａ和番泻苷Ｂ含量的方法。方法：ＡｇｉｌｅｎｔＺｏｒｂａｘＳＢＣ１８色谱柱（４６ｍｍ×
２５０ｍｍ，５μｍ），流动相乙腈００５％磷酸水，流速１ｍＬ·ｍｉｎ－１，检测波长２８０ｎｍ。结果：番泻苷 Ａ和番泻苷 Ｂ的分离度良好
（Ｒ＞１５），２条标准曲线在检测范围内均呈良好线性（ｒ＞０９９９９），番泻苷 Ａ和番泻苷 Ｂ的检测限均低于２４０ｎｇ、定量限均
低于６４０ｎｇ，高、中、低３个水平日内和日间精密度的ＲＳＤ均小于３２％，加样回收率分别高于为９３５％和９２６％。应用所建
立的方法测定了１０批购自不同地区的牛黄解毒丸中以上番泻苷Ａ和番泻苷Ｂ的含量，其结果差别较大。结论：本研究所建
立的牛黄解毒丸中番泻苷Ａ和番泻苷Ｂ同时定量的方法准确、可靠，可作为牛黄解毒丸中番泻苷Ａ与番泻苷Ｂ的含量测定方
法，为该药的全面质量评价提供参考。
［关键词］　ＨＰＬＣ；牛黄解毒丸；番泻苷Ａ；番泻苷Ｂ
［收稿日期］　２００９０３１０
［基金项目］　重庆教委科学基金项目（ＫＪ０８１４０１）
［通信作者］　戴传云，Ｅｍａｉｌ：ｃｙｄａｉ＠１２６．ｃｏｍ
　　牛黄解毒丸由人工牛黄、雄黄、大黄、黄芩等八
味中药组成，具有清热解毒的功效，用于火热内盛，
咽喉肿痛，牙龈肿痛，口舌生疮，目赤肿痛，２００５年
版《中国药典》在其含量测定项下规定了应用 ＨＰＬＣ
测定其中黄芩苷含量［１］，对大黄等其他药味的质量
没有进行控制。
大黄在牛黄解毒丸处方中用量较多，因此，有必
要建立其泻下作用的主要活性成分番泻苷 Ａ和番
泻苷Ｂ的含量测定方法［２］。应用ＨＰＬＣ测定大黄中
的番泻苷 Ａ和番泻苷 Ｂ的研究已有报道［３４］，但迄
今为止，复方中测定这２个指标成分含量的文献很
少见，牛黄解毒丸中的番泻苷Ａ和番泻苷Ｂ的含量
测定方法研究未见报道。本研究建立了牛黄解毒丸
中番泻苷Ａ和番泻苷Ｂ的含量测定方法，为全面评
价牛黄解毒丸质量提供参考。
１　材料
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００高效液相色谱仪，包括：四元泵、真
空脱气泵、自动进样器、柱温箱、ＤＡＤ二极管阵列检
测器、ＨＰ数据处理工作站。ＥｉｍａＤ７８２２４超声仪。
番泻苷Ａ（批号１１２６０７０１５２０４２２６）、番泻苷 Ｂ
（批号１１６５７５６２０９０５０９５）购自美国 Ｆｌｕｋａ公司，纯
度均大于９８％。色谱纯乙腈购自德国 Ｍｅｒｋ公司，
分析纯磷酸、甲醇均为北京化学试剂厂产品，水为乐
百氏纯净水，经重蒸后过滤使用。
牛黄解毒丸样品　本研究所用的牛黄解毒丸从
全国不同的地区收集，共１０批，见表１。
表１　牛黄解毒丸样品信息及其中番泻苷Ａ和
番泻苷Ｂ的质量分数
Ｎｏ． 产地 番泻苷Ａ／％ 番泻苷Ｂ／％
１ 重庆 ００３６ ００２６
２ 四川成都 ００２３ ００１８
３ 四川绵阳 ００１０ ０００９
４ 河北保定 － －
１１ 山西太原 ００７６ ０１０２
１２ 河南郑州 ００５２ ００６６
７ 安徽合肥 － －
８ 河北承德 ０００８ ０００９
９ 河北石家庄 ００６９ ００５８
１０ 河北保定 ００７１ ０１０５
　　注：未检出。
２　方法
２．１　色谱条件　色谱柱为 ＡｇｉｌｅｎｔＺｏｒｂａｘＳＢＣ１８
（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ），预柱为 ＡｇｉｌｅｎｔＺｏｒｂａｘ
ＥｘｔｅｎｄＣ１８（４６ｍｍ×１０ｍｍ，５μｍ））。进样量１０
μＬ，检测波长２８０ｎｍ。流速１０ｍＬ·ｍｉｎ－１，柱温
４０℃，流动相乙腈００１％磷酸水（２３∶７７）。
２．２　对照品溶液的配制　分别称取番泻苷 Ａ２８
ｍｇ、番泻苷Ｂ２５ｍｇ，分别置于１０ｍＬ的量瓶中，用
７０％的甲醇定容至刻度，储存于４℃的冰箱中，作为
对照品贮备液，备用。
供试品溶液的制备　取丸剂，剪碎，混匀，取约
１ｇ，精密称定，置于具塞三角瓶中，精密加入７０％的
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甲醇５０ｍＬ，称重，超声提取１ｈ，放冷，用７０％的甲
醇补足损失的质量，过滤，将滤液蒸干，残渣用７０％
的甲醇定容于 ２ｍＬ的量瓶中，摇匀，过滤（０２２
μｍ），取续滤液作为供试品溶液。
３　结果
３．１　色谱条件的优化　为保证被定量化合物良好
的分离度和适当的保留时间，本研究对流动相中乙
腈与水的比例及磷酸的浓度、色谱柱的型号分别进
行了考察，选用 ００３％，００５％，０１％的磷酸溶液
为流动相，比较不同浓度的磷酸对被分离化合物的
分离度和峰形的影响，发现磷酸的浓度为０１％时，
番泻苷Ａ与番泻苷Ｂ的峰形较好，且与其他的相邻
峰能够完全分离，因此本研究确定磷酸为０１％；牛
黄解毒丸中化学成分复杂，为保证待测成分在具有
良好的分离度，本研究考察了３种不同型号的色谱
柱，ＡｇｉｌｅｎｔＺＯＲＢＡＸＳＢＣ１８（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５
μｍ），ＫｒｏｍａｓｉｌＣ１８（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）和 Ｄｉ
ａｍｏｎｓｉｌＴＭＣ１８（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ），研究发现
应用ＡｇｉｌｅｎｔＺＯＲＢＡＸＳＢＣ１８时待测成分的分离度
最好，因此本研究选择的色谱柱为 ＡｇｉｌｅｎｔＺＯＲＢＡＸ
ＳＢＣ１８。
应用所建立的方法，供试品溶液中的番泻苷 Ａ
与番泻苷 Ｂ得到了良好的分离，其典型色谱图如图
１所示，通过比较保留时间、紫外光谱和分别加入各
种对照品的方法鉴定样品溶液色谱图上番泻苷 Ａ
与番泻苷Ｂ的色谱峰。
Ａ．混合对照品；Ｂ．牛黄解毒供试品；１．番泻苷Ａ；２．番泻苷Ｂ。
图１　牛黄解毒丸对照品及供试品液相色谱图
３．２　提取条件的选择　为了使番泻苷 Ａ和番泻苷
Ｂ提取的比较完全，本研究对提取溶剂、提取方法和
提取时间分别进行了考察，通过比较２个待测成分
的色谱峰面积，确定最佳的提取条件为７０％的甲醇
溶液超声提取１ｈ。
３．３　标准曲线的建立　将番泻苷Ａ和番泻苷 Ｂ贮
备液分别稀释至６个不同质量浓度，得系列对照品
溶液，每个浓度进样２次，取其峰面积平均值为纵坐
标，浓度为横坐标，进行回归分析，所得回归方程见
表２。
表２　番泻苷Ａ与番泻苷Ｂ的回归曲线、检测限及定量限
化合物 回归方程
检测范围
／μｇ·ｍＬ－１
ｒ
检测限
／ｎｇ
定量限
／ｎｇ
番泻苷ＡＹ＝６１１Ｘ－０６４２６～２１６００９９９９ ２４８ ６９２
番泻苷ＢＹ＝７０４Ｘ－０７０２８～２９６００９９９９ ２４０ ６４０
３．４　检测限和定量限　检测限是指从背景干扰中
区分出被测定物的最低浓度，即信噪比为３时的样
品浓度，２个被测物的检测限与定量限见表２。
３．５　精密度和准确度　精密度的评价是通过测定
各对照品的日内、日间精密度来实现的，各对照品分
别选取高、中、低３个不同浓度，日内精密度的做法
是在同一天内每个浓度重复测定６次，而日间精密
度则是在连续的３ｄ内每天每个浓度重复测定２次
来完成的，通过计算相对标准偏差（ＲＳＤ）来评价方
法的精密度。结果表明，番泻苷 Ａ的日内、日间精
密度分别小于２０％和２５％；番泻苷Ｂ的日内、日
间精密度分别小于２４％和３２％。根据各被测物
的峰面积及其标准曲线计算所得的浓度与其标定浓
度之差作为评价准确度的指标。
３．６　重复性试验　精密称取１号牛黄解毒丸３份，
每份１ｇ，按照前面所描述的样品溶液制备及分析方
法进行测定，番泻苷Ａ与番泻苷Ｂ含量的ＲＳＤ分别
为２８％和２１％。
３．７　稳定性试验　取供试品溶液，分别于２，４，６，
９，１２ｈ进行测定，番泻苷Ａ与番泻苷Ｂ含量的ＲＳＤ
分别小于３２和３０％，表明样品在室温下放置１２
ｈ内稳定。
３．８　回收率试验　精密称取１号牛黄解毒丸９份，
每份０５ｇ，分别加入高、中、低３个浓度的番泻苷Ａ
与番泻苷 Ｂ对照品混合液，每个浓度３份，按照前
面所描述的样品溶液制备及分析方法进行测定，结
果见表３。
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表３　被测化合物的加样回收率
化合物
样品量
／μｇ
加入量
／μｇ
测得量／
μｇ
回收率
／％
ＲＳＤ
／％
番泻苷Ａ ８０６ ４０８ １１９４ ９５２ ３０
　 　 ６５３ １４３４ ９６１ ３８
　 　 １２４３ １９６８ ９３５ ３３
番泻苷Ｂ ６８２ ３６９ １０７０ ９２６ ２２
　 　 ６１８ １３０９ ９３２ ３４
　 　 ９８５ １８４４ ９５３ ３７
３．９　样品的测定　本文共测定了１０批牛黄解毒丸
样品，结果见表１。
４　讨论
本研究考察了应用ＥＬＳＤ测定番泻苷Ａ和番泻
苷Ｂ的含量，虽然其峰形和ＵＶ法相比差别不大，但
基线漂移较为严重，因此选择 ＵＶ进行检测；利用
ＤＡＤ检测器考察了不同波长下番泻苷 Ａ和番泻苷
Ｂ的峰形及峰面积，发现检测波长为２８０ｎｍ时，番
泻苷Ａ和番泻苷Ｂ的紫外吸收较强，因此，选择２８０
ｎｍ作为含量测定波长。
　　从１０批牛黄解毒丸中番泻苷Ａ及番泻苷 Ｂ的
含量测定结果可以看出，采自不同地区的样品中番
泻苷Ａ及番泻苷Ｂ含量差别较大，有的样品甚至检
测不出来，说明番泻苷Ａ及番泻苷Ｂ的含量只能作
为评价牛黄解毒丸中大黄的参考。大黄中蒽醌衍生
物被认为是泻下作用的活性成分，包括游离蒽醌及
其苷、蒽酚和蒽酮类及其苷，如何对牛黄解毒丸中其
它活性成分进行含量测定，以及由此作为牛黄解毒
丸质量评价的依据有待于进一步研究。
［参考文献］
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［２］　周孜．单味大黄在消化系统疾病中的应用及作用原理［Ｊ］．中
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ｐｈｙａｎｄｃａｐｉｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］．ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＡ，２００７，
１１４５：１８３．
［责任编辑　鲍　雷］
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