全 文 ：·研究论文·
磁珠富集法分离半夏微卫星序列
张君毅１，２，郭巧生１
（１．南京农业大学 中药材研究所，江苏 南京 ２１００９５；
２．华侨大学 生物工程与技术系，福建 泉州 ３６２０２１）
［摘要］ 目的：利用磁珠富集法分离半夏微卫星序列，以开发半夏微卫星引物。方法：根据链亲和素磁珠和生物素特异
结合的特性，将微卫星探针５′端生物素化后与链亲和素磁珠特异结合，用磁珠和探针的结合物与两端连接已知序列人工接头
的半夏基因组ＤＮＡ酶切片段杂交，洗脱未杂交ＤＮＡ片断后，建立微卫星文库。以此为模板用人工接头序列为引物进行ＰＣＲ
扩增，产物直接克隆，经菌液ＰＣＲ筛选后测序分析。结果：得到１５条半夏微卫星序列，开发效率为９３７５％。结论：结果显示
这是一种快速而有效的微卫星开发方法。
［关键词］ 半夏；磁珠富集法；ＳＳＲ标记
［收稿日期］ ２００８０９０４
［基金项目］ 国家自然科学基金项目（３００７０９２２）；华侨大学科研基
金项目（０８ＢＳ１０３）
［通信作者］ 郭巧生，Ｔｅｌ：（０２５）８４３９５９８０，Ｅｍａｉｌ：ｇｑｓ＠ｎｊａｕ．ｅｄｕ．
ｃｎ
微卫星（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ），又称为简单序列重复
（ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，ＳＳＲ），短串联重复（ｓｈｏｒｔ
ｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔ，ＳＴＲ），是以少数几个核苷酸（一般２～
４个）为重复单位的串联重复 ＤＮＡ序列。这一分子
标记具有一些显著的特征：①均匀、随机、广泛地分
布于植物基因组，平均间隔约１５ｋｂ；②在同种植物
中ＳＳＲ序列的两侧顺序常较保守，其特异性引物扩
增具有良好的重复性和保真性；③大多数 ＳＳＲ存在
非转录区，重复序列变异频率高，因而在品种间具广
泛位点变异；④呈孟德尔式遗传，共显性，对个体鉴
定具特殊意义；⑤仅需微量植物组织，即便 ＤＮＡ降
解，也能有效地分析鉴定；⑥虽然开始筛选重复序列
和引物设计过程较慢，但只要引物确知，使用便极为
简单方便，结果也很稳定。基于上述特征，ＳＳＲ已成
为植物研究中应用最广也最为重要的分子标记之
一。目前，关于微卫星序列的开发方法有很多
种［１］，但磁珠富集法依然是近些年较为常用的方法
之一。
半夏Ｐｉｎｅｌｉａｔｅｒｎａｔａ（Ｔｈｕｎｂ．）Ｂｒｅｉｔ．为天南星
科半夏属植物，其干燥块茎是我国传统的大宗中药
材。近些年由于野生资源的匮乏，半夏市场出现供
不应求局面，且随着中药材 ＧＡＰ工作的深入开展，
半夏资源研究日益得到高度重视。运用 ＳＳＲ分子
标记技术对于半夏资源遗传多样性分析、药材的真
伪鉴别和品种鉴别具有重要意义。本研究改进了磁
珠富集法，使之可以快捷高效地开发半夏微卫星序
列。
１ 材料
１．１ 半夏 选取江苏省泰州市半夏（俗称泰半夏）
为实验材料，经南京农业大学中药材研究所郭巧生
教授鉴定均为天南星科植物半夏Ｐ．ｔｅｒｎａｔａ。
１．２ 试剂 克隆转化采用的菌株为大肠杆菌
ＤＨ５α。试验中ＰＣＲ扩增所用试剂购自宝生物工程
（大连）有限公司，引物合成与克隆的测序由上海英
俊生物技术有限公司完成，ｐＧＥＭＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒＳｙｓ
ｔｅｍＩ（Ｃａｔ．＃Ａ１３６０）购于Ｐｒｏｍｅｇａ公司。其他实验所
需试剂为市售分析纯试剂，配制方法参见文献［２］。
２ 方法
２．１ 基因组ＤＮＡ的提取 采取改良的ＣＴＡＢ法提
取半夏 ＤＮＡ，使用 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ核酸蛋白测定仪测定
基因组ＤＮＡ浓度和纯度，在１％琼脂糖凝胶电泳检
测，调整确定其工作质量浓度为２５ｍｇ·Ｌ－１。
２．２ 限制性内切酶酶切 用 ＦｂａＩ和 ＭｂｏＩ２种限
制性内切酶对基因组 ＤＮＡ进行复合酶切，３７℃水
浴１２ｈ。４０μＬ酶切反应体系中含２μＬＦｂａＩ（１２Ｕ
·μＬ－１），２μＬＭｂｏＩ（１０Ｕ·μＬ－１），２μｇＤＮＡ和４
μＬ１０×ＢｕｆｅｒＫ。酶切后反应体系 ８５℃水浴 １０
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ｍｉｎ灭活限制性内切酶。
２．３ 酶切产物与接头连接 将酶切产物与接头连
接，５０μＬ反应体系见中含５μＬ１０×Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ
Ｂｕｆｅｒ，２μＬ接头（００１ｍｍｏｌ·Ｌ－１），２μＬＴ４ＤＮＡ
Ｌｉｇａｓｅ，３５μＬ基因组酶切产物。接头由 ＯｌｉｇｏＡ（５′
ＴＣＣＡＴＴＣＧＧＣＡＴＣＧＣＡＧＡＣＡ）和 ＯｌｉｇｏＢ（５′ｐｈｏｓ
ＣＴＡＧＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＧＣＣＧＡＡＴＧＧ）组成。连接反应
１６℃过夜，取出加热至７０℃，保温１０ｍｉｎ，灭活连
接酶活性。
２．４ 连接产物 ＰＣＲ扩增 以 ＯｌｉｇｏＡ为引物对连
接产物进行抑制性 ＰＣＲ扩增，用２％琼脂糖凝胶电
泳检测扩增效果。１００μＬＰＣＲ扩增反应体系中含
１０μＬ１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｅｒ（Ｍｇ２＋ Ｆｒｅｅ），８μＬｄＮＴＰ
Ｍｉｘｔｕｒｅ（２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１），６μＬＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ·
Ｌ－１），８μＬＯｌｉｇｏＡ（００１ｍｍｏｌ·Ｌ－１），４μＬ连接产
物和０５μＬＴａＫａＲａＥｘＴａｑ（５Ｕ·μＬ－１）。反应程
序如下：７２℃延伸１ｍｉｎ；９４℃变性１０ｍｉｎ，６０℃复
性４５ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，ｌ个循环；９４℃预变性５
ｍｉｎ，９４℃，１ｍｉｎ；６０℃，１ｍｉｎ；７２℃，１ｍｉｎ；３５个循
环，７２℃延伸５ｍｉｎ。
２．５ 磁珠富集 ＳＳＲ ①扩增产物变性：将抑制性
ＰＣＲ扩增产物９４℃变性１０ｍｉｎ，迅速置于碎冰中快
速冷却备用，双链 ＤＮＡ变性为单链，以使目的片段
与探针杂交。②准备磁珠：取有活性的磁珠，用５００
μＬ０５×ＳＳＣＢｕｆｅｒ（１×ＴＥ ＋１００ｍｍｏｌ·Ｌ－１
ＮａＣｌ）洗涤３次，然后以１００μＬ０５×ＳＳＣＢｕｆｅｒ悬
浮磁珠。③磁珠与探针结合：在磁珠悬浮液中加入
１０μＬ探针（１μｍｏｌ·Ｌ－１），摇匀后室温放置 １０
ｍｉｎ。磁场中吸走上清，用３００μＬ０１×ＳＳＣ洗涤磁
珠４次，洗脱未结合的探针。探针为链亲和素标记
的（ＡＣ）１５（５′ＢｉｏｔｉｎＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡ
ＣＡＣＡＣＡＣＡＣ３′）。④杂交：将变性的扩增产物加入
上述磁珠与微卫星探针结合物中，６８℃杂交 １ｈ。
⑤洗脱：杂交结束后，将混合物置于室温冷却５ｍｉｎ，
在磁场中吸走上清液，用４００μＬ０１×ＳＳＣ洗涤磁
珠４次，洗脱未杂交上的 ＤＮＡ片断。最后加入１００
μＬｄｄＨ２Ｏ悬浮磁珠，溶解目的片断，得到磁珠探
针目的片段的复合体，放置４℃冰箱备用。
２．６ ＰＣＲ产物克隆与转化 吸取上述磁珠悬浮液
１μＬ作为模板，以 ＯｌｉｇｏＡ为引物进行 ＰＣＲ扩增。
利用ｐＧＥＭＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒＳｙｓｔｅｍＩ将ＰＣＲ扩增产物
转化到ＣａＣｌ２法制备的感受态大肠杆菌 ＤＨ５α中。
经培养挑取阳性克隆于含抗生素Ａｍｐ的ＬＢ液体培
养基中，震荡培养（３７℃，２００ｒ·ｍｉｎ－１）过夜。以引
物（ＡＣ）１０（５′ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡ３′）和通
用引物 ＳＰ６对阳性克隆菌液进行 ＰＣＲ扩增检测。
取５μＬＰＣＲ产物用２％琼脂糖凝胶电泳检测。选
取有ＰＣＲ产物的克隆进行测序 （测序反应由上海
英俊生物技术有限公司完成），片断大小在 ２５０～
５００ｂｐ克隆以ＳＰ６引物进行测序，在５００～１０００ｂｐ
以Ｔ７引物测序。
２．７ 测序结果分析 用 ＶｅｃＳｃｒｅｅｎ软件去除载体
序列，避免载体序列污染。使用 ＣｌｕｓｔａｌＸ１８１软件
对所有结果进行多重序列比对分析，去除重复的序
列。用ＳＳＲＨｕｎｔｅｒ软件结合人工搜寻对测序结果
进行序列的ＳＳＲ搜索。搜索ＳＳＲ的长度为１２ｂｐ以
上的 ＳＳＲ核苷酸。另外使用 Ｃｅｎｓｏｒ软件和 Ｒｅｐｅａｔ
Ｍａｓｋｅｒ软件也可用于重复序列的寻找和注释。使
用ＢＬＡＳＴＸ软件预测序列的功能。使用Ｓｅｑｕｉｎ７０
向ＧｅｎＢａｎｋ提交序列，Ｐｒｉｍｅｒｐｒｉｍｅｒ５０设计引物。
３ 结果与分析
３．１ ＤＮＡ酶切产物与接头连接后ＰＣＲ扩增 以泰
半夏基因组ＤＮＡ为底物进行 ＦｂａＩ和 ＭｂｏＩ双酶切。
取酶切产物与接头进行连接，ＰＣＲ产物为一片清晰明
亮可见的片段，大部分片断集中在大约１００～１０００ｂｐ
（图１），说明基因组酶切充分，酶解产物与接头的连
接是成功的。通过抑制性ＰＣＲ，让两端连接上接头的
序列的的双酶切产物得以扩增。
图１ 连接后ＰＣＲ扩增（Ａ）及吸附后ＰＣＲ扩增（Ｂ）
３．２ 磁珠吸附后ＰＣＲ扩增 磁珠吸附后的悬浮液
即为ＳＳＲ文库，以此为模板进行抑制性 ＰＣＲ扩增，
获得目的片断，扩增片断大部分集中在 ２５０～７００
ｂｐ，便于克隆和测序。
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３．３ 菌液ＰＣＲ扩增检测 菌液ＰＣＲ扩增检测常出
现以下几种情况（图２）：①泳道没有条带，其原因可
能是因为 ＰＣＲ产物没转进质粒，克隆为假阳性，也
可能是由于克隆中没有包含重复序列造成的，如泳
道２０；②泳道中有２条或２条以上的条带，可能是
克隆序列中含有至少２段的重复序列的缘故，如泳
道１４；③泳道中只有１个条带且清晰明亮，说明是
克隆序列中仅含１段重复序列。
１～２７．阳性克隆；Ｍ．ｍａｒｋｅｒ。
图２ 菌液ＰＣＲ扩增
３．４ 序列整理分析 从６０个克隆里筛选１６个克
隆进行测序，分析发现有１５个克隆含有重复序列。
所有克隆经 ＣｌｕｓｔａｌＸ分析没有发现相同的克隆结
果。使用ＢＬＡＳＴＸ软件对所有结果进行比对分析，
将含有微卫星的克隆提交 Ｇｅｎｂａｎｋ，分别为
ＥＦ５１３０９５， ＥＦ５１３０９６， ＥＦ５１３０９７， ＥＦ５１３０９８，
ＥＦ５１３０９９， ＥＦ５１３１００， ＥＦ５１３１０１， ＥＦ５１３１０２，
ＥＦ５１３１０３， ＥＦ５１３１０４， ＥＦ５１３１０５， ＥＦ５１３１０６，
ＥＦ５１３１０７，ＥＦ５１３１０８，ＥＦ５１３１０９。并对其中部分序
列设计引物（表１）。
表１ 半夏微卫星位点分析及其引物序列
登录号 序列（５′３′） Ｔｍ／℃ 重复基元 大小／ｂｐ
ＥＦ５１３０９６ ＧＴＧＣＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＴＡＣＣＣＧＧＣＴＣＡＣＴＣＧＧＣＧＡＡＣＡＴ ５２８ （ＣＡ）７ ３７１
ＥＦ５１３０９７ ＡＡＣＣＣＧＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＧＡＡＡＴＣＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＡＡＴＣ ４９７ （ＡＣ）１９ ２９７
ＥＦ５１３０９８ ＴＧＧＧＴＡＣＡＧＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＧＧＧＡＡＴ ４９６ （ＡＣ）７…（ＡＣ）６ ２０６
ＥＦ５１３１００ ＣＧＣＣＴＡＣＴＴＣＣＡＣＣＣＴＣＣＡＴＴＣＧＧＣＡＴＣＧＣＡＧＡＣＡＧＡ ５２３ （ＡＣ）１３ ３５５
ＥＦ５１３１０１ ＣＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＣＡＧＡＣＡＧＡＧＧＧＣＡＣＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧＡＧ ５４６ （ＣＡ）８…（ＡＣ）５ ２６９
ＥＦ５１３１０２ ＧＧＣＴＴＧＣＴＣＧＡＣＡＡＡＣＡＴＧＣＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＣＣＴＣＣＡ ５２０ （ＣＡ）６…（ＣＡ）９ ２７４
ＥＦ５１３１０３ ＡＣＡＴＡＡＧＣＡＡＴＣＧＣＡＡＡＣＴＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＴＣＡＴＡＡＡＣ ５１４ （ＡＣ）６…（ＡＣ）６ ２６８
ＥＦ５１３１０６ ＴＡＣＡＴＣＣＡＣＣＣＴＣＣＡＣＴＴＴＴＣＴＧＴＣＧＧＧＣＡＣＴＴＴＡＴ ５０４ （ＡＣ）９…（ＣＡ）６ ２１６
ＥＦ５１３１０７ ＧＡＧＣＧＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＴＧＧＧＡＧＡＴＴＧＴＴＣＧＡＧＣＧＴＧ ５１０ （ＡＣ）６…（ＣＡ）６ ３８４
ＥＦ５１３１０８ ＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＣＣＴＣＣＡＣＴＡＴＡＴＧＴＣＧＧＧＣＡＣＴＣＴＡＴ ５０２ （ＡＣ）７…（ＡＣ）５ ２０８
４ 讨论
在预试验中采用 ＢａｍＨＩ和 ＨｉｎｄⅢ ２种限制性
内切酶对半夏基因组进行酶切，并以４条寡核苷酸
分别合成２条接头引物 Ｉ和 Ｉ。其中引物 Ｉ接头对
应ＢａｍＨＩ酶切位点，引物 Ｉ对应 ＨｉｎｄⅢ位点。使
用双引物进行 ＰＣＲ扩增。通过测序结果发现接头
引物之间很容易自行连接，严重影响试验结果。分
析其原因，在接头与酶切产物连接时，接头的量远大
于酶切产物的量，而且后续步骤没有去除多余的接
头，由此影响ＰＣＲ扩增［３］。
本试验采用ＭｂｏＩ和ＦｂａＩ２种限制性内切酶双
酶切，接头引物ＩＩ由ＯｌｉｇｏＡ和ＯｌｉｇｏＢ合成，并使用
ＯｌｉｇｏＡ单引物扩增。以生物素标记（ＡＣ）１５为探针，
提高杂交温度至６８℃，延长杂交时间至１ｈ，并充分
洗脱非特异片断。除此之外，以引物（ＡＣ）１０代替通
用Ｔ７，检测筛选目的克隆片断。测序结果显示，１６
个克隆中有 １５个含有重复序列，开发效率到达
９３７５％。同采用传统法制备微卫星标记相比［４］，本
法获得的微卫星标记不仅数量多，而且效率高。采
用该方法最大的不足之处是不能确保每个微卫星序
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列之侧翼序列的有效分离，在获得的１８个微卫星序
列中，有 ２个微卫星序列 ＥＦ５１３０９９，ＥＦ５１３０９５８因
侧翼序列太短而无法设计 ＰＣＲ引物。根据引物设
计 原 则， ＥＦ５１３０９５０， ＥＦ５１３０９５１， ＥＦ５１３０９８，
ＥＦ５１３０９５６没有得到合适引物。
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ＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｏｍｉｃｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅｉｎＰｉｎｅｌｉａｔｅｒｎａｔａｂｙ
ｍａｇｎｅｓｐｈｅｒｅ
ＺＨＡＮＧＪｕｎｙｉ１，２，ＧＵＯＱｉａｏｓｈｅｎｇ１
（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎａｌＭａｔｅｒｉａｌｓ，ＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００９５，Ｃｈｉｎａ；
２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨｕａｑｉａｏＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｑｕａｎｚｈｏｕ３６２０２１，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｄｅｖｅｌｏｐｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅｐｒｉｍｅｒｓｗｉｔｈｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｏｍｉｃｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅｉｎＰｉｎｅｌｉａｔｅｒｎａ
ｔａｂｙｍａｇｎｅｓｐｈｅｒｅ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｂｙｔａｋｉｎｇａｄｖａｎｔａｇｅｏｆｔｈｅｈｉｇｈｂｉｎｄｉｎｇａｆｉｎｉｔｙｏｆｂｉｏｔｉｎｔｏｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅｐｒｏｂｅｏｆｔｈｅ５＇ｅｎｄ
ｂｉｏｔｉｎｗａｓｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｍａｇｎｅｓｐｈｅｒｅｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃｐａｒｔｉｃｌｅｓ，ａｎｄｔｈｅｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｗｅｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄｗｉｔｈｔｈｅｄｉｇｅｓｔｅｄＰ．ｔｅｒｎａｔａ
ＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓｉｎｗｈｉｃｈｂｏｔｈｅｎｄｓｏｆｔｈｅｍｃｏｎｎｅｃｔｅｄｗｉｔｈｓｐｅｃｉａｌａｄａｐｔｏｒ，ｔｈｅｏｔｈｅｒＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓｗｅｒｅｅｌｕｔｅｄｏｕｔ．Ｔｈｅｍｉｃｒｏｓａｔｅｌ
ｌｉｔｅｌｉｂｒａｒｙｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．ＴｈｅｃｒｏｓｓｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｓｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｔｈｅｔｅｍｐｌａｔｅｔｏｃｏｎｄｕｃｔＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅａｄａｐｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ａｓｐｒｉｍｅｒｓ，ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｄｉｒｅｃｔｌｙ，ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｉｑｕｉｄＰＣＲ，ａｎｄＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｗａｓｃａｒｉｅｄｏｕｔ．
Ｒｅｓｕｌｔ：ＦｉｆｔｅｅｎｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅｓｏｆＰ．ｔｅｒｎａｔａｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｅｆｉｃｉｅｎｃｙｗａｓ９３．７５％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ
ｔｈａｔｍａｇｎｅｓｐｈｅｒｅｉｓａｆａｓｔａｎｄｅｆｉｃｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄｔｏｄｅｖｅｌｏｐｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｐｉｎｅｌｉａｔｅｒｎａｔａ；ｍａｇｎｅｓｐｈｅｒｅ；ＳＳＲｍａｒｋｅｒ
［责任编辑 吕冬梅］
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