全 文 ：·研究论文·
香豆素类成分在球花石斛 Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍｔｈｙｒｓｉｆｌｏｒｕｍ
叶和根中的分布与动态变化
郑　艳１，２，徐珞珊１，王峥涛１，张超英３
（１．中国药科大学 中药学院，江苏 南京 ２１００３８；
２．安徽师范大学 生命科学学院／中药资源研究所，安徽 芜湖 ２４１０００；
３．南京师范大学 生命科学学院，江苏 南京 ２１００９７）
［摘要］　目的：探讨球花石斛Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍｔｈｙｒｓｉｆｌｏｒｕｍ不同生长发育时期叶和根中香豆素类（ｃｏｕｍａｒｉｎｓ）成分的分布与动
态变化，为充分利用药用石斛资源提供实验依据。方法：采集球花石斛营养生长期和生殖生长期的叶、根，利用激光共聚焦显
微技术观察、分析其所含香豆素类成分。结果：球花石斛的叶除叶脉近上、下表皮处的维管束纤维群外，其他部位均有香豆素
类成分的存在；球花石斛根的各部位均有香豆素类成分存在，尤其在皮层以内细胞的壁和壁内周。球花石斛叶、根的香豆素
类成分的相对含量在生殖生长中的盛花期均高于营养生长期；在生殖生长进入始果期二者均几无香豆素类成分分布。结论：
为充分利用药用植物，可从球花石斛的叶、根中提取香豆素类成分。
［关键词］　球花石斛；叶；根；香豆素；分布；动态变化；激光共聚焦显微技术
［收稿日期］　２００８０８０４
［基金项目］　国家自然科学基金项目（３０１７１１４４）；安徽省高校生物
环境与生态安全省级重点实验室专项
［通信作者］　王峥涛，Ｔｅｌ：（０２１）５１３２２５１９，Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｚｈｔ＠ｈｏｔ
ｍａｉｌ．ｃｏｍ
　　传统名贵中药石斛以茎入药，叶和根在药材采
收加工过程中废弃。历史上习惯使用的石斛类药材
可分为３类：金钗类（以金钗石斛为代表，富含生物
碱成分）、枫斗类（以铁皮石斛、霍山石斛为代表，富
含多糖成分）和黄草类（以球花石斛、流苏石斛等为
代表，富含联苄、菲、香豆素类成分）。球花石斛
ＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍｔｈｙｒｓｉｆｌｏｒｕｍＲｃｈｂ．ｆ．因野生资源相对丰
富、繁殖较容易、产量较高已成为石斛商品药材的主
要来源之一［１３］。ＷｒｉｇｌｅｙＴＣ从球花石斛叶中提取
了香豆素类成分［４］。本实验继利用激光共聚焦技
术（ｌａｓｅｒｓｃａｎｎｉｎｇｃｏｎｆｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＬＳＣＭ）研究
营养生长期香豆素类成分在球花石斛茎及根中的定
位和相对定量之后［５６］，初次观察并分析了不同生长
发育时期该成分在球花石斛非药用部位———叶和根
中的分布与动态变化，旨在为合理并充分利用球花
石斛提供科学依据。
１　材料和方法
球花石斛 Ｄ．ｔｈｙｒｓｉｆｌｏｒｕｍ采自云南省思茅地
区，经作者鉴定学名后栽种于中国药科大学药用植
物园以便随时取材。凭证标本存放中国药科大学中
药标本馆。
为获得较好的重复性和显微特征较明显的最适
部位，在对茎基部、中部和顶部的叶片及同一叶片的
基部、中部和顶部的叶片进行解剖学观察后，最终确
定选取球花石斛不同生长发育阶段（营养生长期和
生殖生长期的盛花期、始果期）的新鲜成熟叶中部
作为叶实验研究材料；同时选取进入生殖生长盛花
期和始果期的球花石斛新鲜根成熟区制备根样。
样品制备、研究采用的激光共聚焦系统、实验条
件等均与营养生长期球花石斛茎和根中香豆素类成
分的定位与相对定量研究中的一致［５６］。
选取开花期、开花后期的球花石斛新鲜根成熟
区（约距根尖１０～２０ｃｍ）；同时选取新鲜球花石斛
成熟叶片的中部，切成宽约０２～０５ｍｍ的长条
（长度视具体叶片而定，但均应包括叶缘和主脉部
分）。以上材料经－２０℃下包埋、ＬｅｉｃａＣＭ１９００型
冰冻切片机切片（切片厚度３５～５０μｍ）、粘片后供
激光共聚焦试验观察用。共聚焦试验时随机选取
１０～３０个视野拍照并记录荧光平均强度及荧光总
强度数值（单位：像素荧光强度 ｐｉｘｅｌｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）。数
据分析使用ＴｉｍｅＣｏｕｒｓｅ（ＫｉｎｅｔｉｃＩｍａｇｉｎｇＳｏｆｔｗａｒｅｆｏｒ
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ＭＲＣ１０２４ＵＶＣｏｎｆｏｃａｌＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ），Ｃｏｎｆｏｃａｌ
ＡｓｓｉｓｔａｎｔＴＭ数据及图像处理软件。所记录数据经
正态性、方差齐性检验后进行方差分析（ＡＮＯＶＡ），
并使用 Ｔｕｋｅｙ＇ｓ检验作多重比较，绘制柱状图。
２　结果
２．１　球花石斛叶中香豆素类成分的定位
２．１．１　营养生长期　叶近叶缘处的上、下表皮细胞
外切向壁和细胞腔，大叶脉的细胞壁和小叶脉除韧
皮部外的细胞壁，叶肉细胞壁、角隅及壁周缘的细胞
腔荧光较强烈。各部位自发荧光的范围为０～２５５
像素荧光强度；各自发荧光的峰值位置基本接近
（在１０～２０像素荧光强度）（图１）。叶缘和叶脉自
发荧光强度的平均值分别为５４７３～６７５５（叶缘），
１５８９～１２４（叶脉）；不同部位自发荧光强度的总强
度值分别为叶缘（１４３５～１７７１）ｅ＋０６，叶脉
（４１６５～３２５１）ｅ＋０６。
１～６．激光共聚焦显微镜下照片，其中５，６带透射效果；１ａ～６ａ．相应荧光强度；１，４，６．示叶主脉；
２，３，５．示叶缘；１，２营养生长期；３，４盛花期；５，６始果期；ｕｅｐ．上表皮；ｌｅｐ．下表皮；Ｍｅ．叶肉；ＶＢ．维管束。
图１　球花石斛不同生长发育阶段叶中香豆素类成分的分布与相对定量
２．１．２　盛花期　除叶脉靠近上、下表皮的维管束纤
维群无荧光外，叶其他部分（包括叶肉细胞腔）荧光
强烈。各部位自发荧光的范围０～２５５；各自发荧光
的峰值位置在３０像素荧光强度之间（图１）。叶自
发荧光强度的平均值为１７３５５～１８０９２；自发荧光
强度的总强度值为（４５５０～４７４３）ｅ＋０７。
２．１．３　始果期　香豆素类成分相对稀少，仅叶缘、
大维管束细胞壁上有微弱荧光。各部位自发荧光
的范围０～５５；各自发荧光几无峰（图１）。此时期
叶的叶脉自发荧光强度的平均值为 ０９２～０１３，
自发荧光强度的总强度值为（３３０５～２４０６）ｅ＋
０５；叶缘自发荧光强度的平均值为０１３～１６１，自
发荧光强度的总强度值为 （３３７３～ ４２１７）
ｅ＋０５。
２．２　盛花期、始果期球花石斛根中香豆素类成分的
分布
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２．２．１　盛花期　根的皮层薄壁细胞及细胞腔、内皮
层细胞、木质部与韧皮部的细胞壁及壁内周、髓部细
胞壁及壁周围荧光强烈，香豆素类成分主要分布在
以上部位。各部位自发荧光的范围稳定在０～２５５
像素荧光强度。自发荧光的峰值位置从１０至５０，
６０像素荧光强度不等（图２）。
１～３．激光共聚焦显微镜下照片（３带透射效果）；１ａ～３ａ．示相应的荧光强度；Ｖｅ．根被；Ｅｘ．外皮层；Ｃｏ．皮层；Ｅｎ．内皮层；Ｖ．维管；Ｐｉ．髓。
图２　盛花期与始果期球花石斛根中香豆素成分的定位与相对定量
根内皮层以内部位的自发荧光强度平均值为１５０～
２１０；根髓部为１５０～１５５。相应部位的自发荧光强
度的总强度值分别为（１０２１～５３９６）ｅ＋０７，
（２８９０～３９９４）ｅ＋０７。
２．２．２　始果期　各部位荧光均微弱，即使使用透射
效果加以强化也难见荧光；虽然近内皮层处稍强些，
但自发荧光强度的最大平均值也仅有０３０像素荧
光强度。各部位的自发荧光基本稳定在０～２０像素
荧光强度；自发荧光近无峰（图２）。各部位的自发
荧光强度平均值分别为 ００５～００９（根被、外皮
层），００９～０３０（近内皮层处），００５～０１１（内皮
层以内）。相应部位的自发荧光强度的总强度值分
别为（１３１３～２４４０）ｅ＋０４，（２３８４～７９３７）ｅ＋
０４，（１３３７～３００６）ｅ＋０４。
３　结论与讨论
在不同生长发育阶段，球花石斛叶、根中香豆素
类成分存在的部位较稳定：在叶中，除叶脉靠近上、
下表皮处的维管束纤维群外，其他部位均有香豆素
类成分的存在；香豆素类成分主要分布在根的各部
位、尤其皮层以内细胞的壁和壁内周。但香豆素成
分的相对含量存在明显不同：生殖生长中的盛花期
高于营养生长期，在生殖生长进入始果期几无香豆
素分布。
结合以往的研究结果［６］，在营养生长期，香豆素
类成分比较均匀地分布球花石斛根中的各个部位，根
自发荧光强度的平均值为２９０６±１５１８；盛花期根中
香豆素类成分含量达到最高，其自发荧光强度的平均
值为１６８９４±３６０８；当进入始果期，根各部位的香豆
素类成分的含量最低，自发荧光的平均值仅为０１１±
００７，即使在透射效果下也很难清晰看到荧光。在营
养生长期和生殖生长的盛花期，球花石斛根的各部
位、尤其是皮层以内细胞的壁和壁内周有香豆素类成
分的分布，且以盛花期含量最高。
叶中香豆素类成分的分布与相对含量情况与根
的类似，也以盛花期最高、始果期最低，香豆素类成
分主要存在于球花石斛叶的上、下表皮切向壁、叶脉
细胞壁及叶肉细胞腔及细胞角隅处。不同的生长发
育时期叶中香豆素类成分含量的自发荧光强度平均
值不同：营养生长期为５５３９±３７９０，略高于已报
道的同期茎（石斛的药用部位）、根中的成分含量
值［５６］；盛花期叶中该类成分自发荧光强度的平均值
为２１６８２０±３０６４，含量为３个生长发育期（营养
生长期、花盛期、始果期）之最；始果期叶中香豆素
类成分含量最低，自发荧光的平均值仅为 ０５９±
０５７。
石斛历来以茎入药，非药用部位叶、根（尤其
根）废弃。球花石斛叶与根中不仅有香豆素类成分
分布，而且其相对含量（尤其叶）大多接近甚至有时
还高于茎中的含量［７］。在石斛药材资源紧缺的今
天，可考虑在药材采收加工过程中从废弃的球花石
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斛叶、根中提取香豆素类成分。
激光共聚焦显微技术（ＬＳＣＭ）萌芽于 ２０世纪
６０年代，但在生物、医药、化学等领域中得到真正的
应用却是在１９８７年之后。该技术能将荧光图像与
定量图形结合起来显示荧光在形态结构上的准确定
位，避免了因荧光强度的人为划分带来的主观性而
使荧光强度的真实性受到影响。对于那些不具自发
荧光的有效成分，激光共聚焦显微镜可利用荧光染
料（不同的结构可采用各自特异性的荧光染料或探
针，有些荧光染料甚至可以对活细胞进行非创伤性
的染色），在形态和功能２个方面为各学科的研究
提供了崭新技术手段。随着共聚焦技术的发展，在
对固定的死细胞与组织切片显色的静态观察的基础
上，对活的有生命组织进行动态观察，由单纯的形态
定位转为结构与功能的结合研究［８］。作为一种较
先进的促进中药质量标准研究水平提高的可行研究
方法，球花石斛叶和根中香豆素类成分的定位研究
　　
是一次有益的尝试。
［参考文献］
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［２］　张光浓，张朝凤，王峥涛，等．球花石斛化学成分的研究［Ｊ］．中
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［８］　郑　艳，徐珞珊，王峥涛．组织化学在药用植物研究中的应用
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Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｏｆｃｏｕｍａｒｉｎｓｉｎｌｅａｆａｎｄｒｏｏｔ
ｏｆＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍｔｈｙｒｓｉｆｌｏｒｕｍ
ＺＨＥＮＧＹａｎ１，２，ＸＵＬｕｏｓｈａｎ１，ＷＡＮＧＺｈｅｎｇｔａｏ１，ＺＨＡＮＧＣｈａｏｙｉｎｇ３
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＣｈｉｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００３８，Ｃｈｉｎａ；
２．ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ＆ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，ＡｎｈｕｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈｕ２４１０００，Ｃｈｉｎａ；
３．ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＮａｎｊｉｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００９７，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｏｆｃｏｕｍａｒｉｎｓｉｎｔｈｅｌｅａｆａｎｄｒｏｏｔｏｆＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍｔｈｙｒｓｉｆｌｏ
ｒｕｍａｔｄｉｆｅｒｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｓｔａｇｅｓ，ａｎｄｐｒｏｖｉｄｅａｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒｕｔｉｌｉｚｉｎｇｔｈｅｍｅｄｉｃｉｎａｌｐｌａｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｔｈｅｌｅａｆａｎｄ
ｒｏｏｔｍａｔｅｒｉａｌｓｗｅｒｅｃｏｌｅｃｔｅｄａｔｖｅｇｅｔａｔｉｖｅａｎｄｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｓｔａｇｅ．Ｂｙａｐｐｌｙｉｎｇｌａｓｅｒｓｃａｎｎｉｎｇｃｏｎｆｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｒｅｌａｔｉｖｅｑｕａｎｔｉｔｙｏｆ
ｃｏｕｍａｒｉｎｓｏｆｅａｃｈｓａｍｐｌｅｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄａｎｄａｎａｌｙｚｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔ：ＣｏｕｍａｒｉｎｓｌｏｃａｔｅｄｉｎＤ．ｔｈｙｒｓｉｆｌｏｒｕｍｌｅａｆｅｘｃｅｐｔｆｉｂｅｒｓｉｎｖａｓｃｕｌａｒｂｕｎ
ｄｌｅｓｗｈｉｃｈｗｅｒｅｃｌｏｓｅｔｏｔｈｅｕｐｐｅｒｏｒｌｏｗｅｒｅｐｉｄｅｒｍｉｓ．ＣｏｕｍａｒｉｎｓｗｅｒｅｆｏｕｎｄｉｎＤ．ｔｈｙｒｓｉｆｌｏｒｕｍｒｏｏｔｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｔｄｉｆｅｒｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔａｌｓｔａｇｅｓａｎｄｗａｌｓｏｆｃｅｌｓｗｉｔｈｉｎｃｏｒｔｅｘｗｅｒｅｅｓｐｅｃｉａｌａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｐｌａｃｅｓｆｏｒｔｈｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．Ｒｅｌａｔｉｖｅｑｕａｎｔｉｔｙｏｆｃｏｕｍａ
ｒｉｎｓｗａｓｃｈａｎｇｅｄｏｂｖｉｏｕｓｌｙｗｈｅｎｐｌａｎｔｗａｓｇｒｏｗｉｎｇ．Ｔｈｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｒｅａｃｈｅｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｌｅｖｅｌｄｕｒｉｎｇｐｒｏｆｕｓｅｆｌｏｗｅｒｉｎｇｐｅｒｉｏｄｗｈｅｒｅａｓ
ｔｈｅｒｅｗｅｒｅｌｅｓｓｃｏｕｍａｒｉｎｓａｔｖｅｇｅｔａｔｉｖｅｐｅｒｉｏｄａｎｄｌｉｔｌｅｄｕｒｉｎｇｉｎｉｔｉａｌｆｒｕｉｔｐｅｒｉｏｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｕｔｉｌｉｚｅＤ．ｔｈｙｒｓｉｆｌｏｒｕｍｒｅａ
ｓｏｎａｂｌｙａｎｄｔｈｏｒｏｕｇｈｌｙ，ｃｏｕｍａｒｉｎｓｓｈｏｕｌｄｂｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｐｌａｎｔｌｅａｆａｎｄｒｏｏｔ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍｔｈｙｒｓｉｆｌｏｒｕｍ；ｌｅａｆ；ｒｏｏｔ；ｃｏｕｍａｒｉｎ；ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ；ｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅ；ＬＳＣＭ（ｌａｓｅｒｓｃａｎｎｉｎｇｃｏｎｆｏｃａｌ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）
［责任编辑　吕冬梅］
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