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Application of SPSS orthogonal design in tissue culture of Anoectochilus roxburghii

SPSS正交设计在福建金线莲组织培养中的应用



全 文 :SPSS正交设计在福建金线莲组织培养中的应用
张福生,郭顺星
(中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所,北京 100193)
[摘要] 目的:研究植物激素对福建金线莲茎尖与茎段生长及分化的影响。方法:选用福建金线莲的茎尖与茎段为材
料,采用SPSS正交设计研究6苄基腺嘌呤(6BA)、萘乙酸(NAA)对茎尖的叶片数、茎节数、侧枝数、株高,茎段的侧枝数、茎节
数等的影响,并用SPSS进行数据处理。结果与结论:首次报道了 NAA对福建金线莲的促生长作用在低质量浓度(<1mg·
L-1)和高质量浓度(>1mg·L-1)时各不相同。MS+NAA05mg·L-1+6BA1mg·L-1最适宜福建金线莲茎尖的生长;
MS+NAA1mg·L-1+6BA2mg·L-1最适宜茎尖与茎段芽分化及侧枝形成。NAA与6BA的不同浓度水平组合,对福建金
线莲茎尖与茎段生长及分化的影响不同,两激素间存在着较强的交互效应。
[关键词] SPSS;福建金线莲;组织培养;正交设计;植物激素
[收稿日期] 20090113
[通信作者] 郭顺星,Tel:(010)62829619,Email:sxguo2006@ya
hoo.com.cn
  福建金线莲 Anoectochilusroxburghi(Wal.)
Lindl.为兰科Orchidaceae开唇兰属珍稀濒危药用植
物的全草。其生态分布比较特殊,适应性较窄,生于
常绿阔叶林下或竹林下枯枝落叶阴湿处,一般呈稀
疏、零星分布,很少成片密生。金线莲主要分布于中
国南部福建等省,日本、斯里兰卡、印度和尼泊尔等
国也有零星分布[1]。由于疗效确切,金线莲有“药
王”、“金草”之美誉;该草药味甘微苦,性平微寒,具
有清热凉血、降血压、解毒、止痛、镇咳等功效,多用
于治疗支气管炎、肾炎、糖尿病、风湿性关节炎、小儿
急惊风、毒蛇咬伤等;近年来研究发现金线莲治疗高
血压、糖尿病、高血脂等也有很好的疗效[2]。另外,
金线莲株型小巧美观,叶形优美,叶脉金黄色呈网状
排列,也是观赏价值极高的观叶珍品,因此金线莲具
有广阔的开发与利用前景[3]。由于该类植物种子
不具胚乳,发芽困难,自然条件下只有被真菌侵染种
子才能萌发,目前利用种子的有性繁殖未取得突破
性进展[4]。金线莲对生态条件要求较为严格,适应
性较差,且天然蕴藏量极为稀少,再加上野外虫蛇鸟
兽喜食和人们的过度采挖,造成其野生资源的极度
匮乏和价格的居高不下。
近年来国内先后开展了金线莲的组织培养、人
工栽培,金线莲内生真菌的分离、内生真菌与其菌根
的相互作用及作用机制等方面的研究[37]。有文献
报道了6苄基腺嘌呤(6benzyladenine,6BA)、萘乙
酸(naphthaleneaceticacid,NAA)不同浓度组合在滇
越金线莲A.chapaensis生长及分化中的作用[8]。但
纵观前人的研究成果多是对NAA及6BA的激素效
应进行单独分析与描述,无法准确了解 NAA与
6BA两者激素效应的交互作用。因此本研究用
SPSS软件设计了NAA与6BA2因素多浓度水平的
正交试验,研究不同处理对福建金线莲茎尖与茎段
生长及分化的影响,从中筛选出适宜的培养基,为福
建金线莲的快速繁殖提供理论和技术上的帮助。
1 材料与方法
1.1 材料
福建金线莲无菌苗,经中国医学科学院药用植
物所郭顺星研究员鉴定为福建金线莲 A.rox
burghi,由本实验室提供。
1.2 培养基及培养方法
选用 MS基本培养基,以 3%蔗糖为碳源,用
1%琼脂固化,pH58,附加不同浓度水平的植物激
素。分装后,在121℃湿热灭菌20min。材料接种
后放在培养室内培养,温度(23±2)℃,光照强度
1500~2000lx,光照时间 12h·d-1。用 SPSS
(130)软件对NAA与6BA2因素多个浓度水平进
行正交设计,见表1[910]。
1.3 茎尖和茎段的获得
将4月龄的福建金线莲无菌苗剪成茎尖与茎段
(茎尖含2片叶及2个茎节,茎段含1个茎节),再
把茎尖与茎段分别垂直接种于各组培养基中,每瓶
接种3个茎尖或茎段,每个处理茎尖与茎段各10
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   表1 SPSS正交设计结果 (n=10)
培养基

NAA/mg·L-1

6BA/mg·L-1
I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7
1 1(01) 1(05) 300 322 089 377 100 200 194
2 1 2(10) 289 289 100 410 100 200 200
3 1 3(20) 163 200 113 250 060 120 183
4 1 4(40) 256 289 322 253 115 185 259
5 2(05) 1 313 338 150 392 067 133 206
6 2 2 425 375 075 446 100 200 188
7 2 3 300 280 120 368 060 120 190
8 2 4 300 322 100 432 090 170 195
9 3(10) 1 367 389 100 402 090 180 195
10 3 2 250 250 090 296 150 225 217
11 3 3 178 244 244 295 158 250 295
12 3 4 240 210 240 288 130 180 285
13 4(20) 1 356 344 094 361 000 000 152
14 4 2 370 380 100 395 064 145 181
15 4 3 280 220 120 309 086 150 200
16 4 4 292 283 133 355 100 217 220
17 5(40) 1 325 300 063 380 030 060 144
18 5 2 322 211 078 310 013 025 147
19 5 3 360 330 130 340 031 062 174
20 5 4 260 293 093 356 000 000 158
瓶。60d后观察以下指标:I1.茎尖平均叶片数(含
原叶片数);I2.茎尖平均茎节数(含原茎节数);I3.
茎尖平均侧枝数(1cm以上的芽为侧枝);I4.茎尖
平均株高(cm);I5.茎段平均侧枝数(1cm以上的芽
为侧枝);I6.茎段平均茎节数(含原茎节数);I7.繁
殖倍数。
2 结果与分析
2.1 福建金线莲组培苗的生长特性
组织培养中的福建金线莲茎尖与茎段的生长及
分化需要较长的时间,一般要在半月以上才能用肉
眼观察出变化。茎尖的茎节部早期长出乳白色的小
芽,外被有浓密的长白色绒毛状根,茎顶尖叶片逐渐
长大。茎段的茎节部刚长出的小芽色黄白,随着培
养时间的延长逐渐转为绿色,后期茎节逐渐变长,其
上有新的小叶片与小芽长出。在整个培养过程中偶
然可见到部分茎段的茎节处有新的绿色膨大如圆团
状的愈伤组织产生,这与文献[3]报道的不同,较少
见到有通过愈伤组织而分化出来的新芽。
2.2 系统聚类及相关性分析
为了考察7个观察指标间是否存在相关性,以
及在20组培养基中寻求对福建金线莲茎尖与茎段
生长及分化促进最显著的NAA与6BA浓度组合时
能否将聚为一类的指标综合考虑,或者是否可以用
有代表性的一个指标来替代一组指标,又分别对表
1数据进行了系统聚类和相关性分析,见图1。从图
1中可以直观地看出 I1~I7可以简单的聚为2大
类,I5,I6,I3,I7为一类,I1,I2,I4为一类。
图1 NAA与6BA不同浓度水平组合对福建金线莲
茎尖与茎段生长及分化影响的系统聚类
I1与I2,I4呈显著的负相关(P<001),与 I3,
I7呈显著的负相关(P<005);I2,I4呈显著的正相
关(P<001);I3,I4呈显著的正相关(P<001);
I5,I3呈显著的正相关(P<005);I6和 I5,I7呈显
著的正相关(P<001);I7与 I3,I5呈显著正相关
(P<001),与I2,I4无相关性,见表2。
茎尖的高度会随着其叶片数与茎节数的增多而
增高,说明 NAA对茎尖的叶片数、茎节数和株高有
着相同的促生长作用。繁殖倍数随着茎尖与茎段的
侧枝数的增多而增多,且茎段侧枝数增加的同时也
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   表2 NAA与6BA不同浓度水平组合对福建金线莲茎尖与茎段生长及分化影响的相关性(n=10)
Index I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7
I1   07812) -04821) 07342) -0371 -0239 -05281)
I2 07812)   -0282 07712) -0178 -0022 -0305
I3 -04821) -0282   -05772) 04971) 0366 08342)
I4 07342) 07712) -05772)   -0183 0002 -0411
I5 -0371 -0178 04971) -0183   09582) 08502)
I6 -0239 -0022 0366 0002 09582)   07422)
I7 -05281) -0305 08342) -0411 08502) 07422)  
  注:1)P<005,2)P<001(表3,5同)。
伴随着茎尖侧枝数的增加,反映出6BA对茎尖与
茎段的芽分化及侧枝形成均有相同的促进效应。图
1的系统聚类也验证了以上结果的正确性。
结合图1与表2,可以将I1,I2与I4等指标综合
考虑,用I1代表以上3个指标来反映不同浓度水平
下NAA对茎尖生长的促进效果;将I5,I6,I3,I7等指
标综合考虑,用I5代表上述4个指标来反映不同浓
度水平下6BA对茎尖与茎段分化的促进作用。
2.3 NAA与6BA最佳浓度水平组合的选定
2.3.1 NAA与6BA不同浓度水平组合对福建金
线莲茎尖平均叶片数的影响 不同浓度水平 NAA
间I1值的配对比较,以找到 NAA有最大激素效应
的浓度范围,见表3。结果显示 A2,A4,A5的 I1值
大于A1,A3;A2,A4,A5与 A1,A3间有显著性差异
(P<005),A2与 A4,A5间无显著性差异,A1与
A3间无显著性差异。说明 A2,A4,A5效果较好,
A1,A3效果较差。
表3 A因素配对比较
(I)A (J)A 均数差(IJ) 标准误
1 2 -08311) 0264
  3 -0076 0269
  4 -07031) 0259
  5 -06831) 0264
2 1 08311) 0264
  3 07551) 0264
  4 0128 0254
  5 0148 0259
3 1 0076 0269
  2 -07551) 0264
  4 -06271) 0259
  5 -06071) 0264
4 1 07031) 0259
  2 -0129 0254
  3 06271) 0259
  5 0020 0254
5 1 06831) 0264
  2 -0148 0259
  3 06071) 0264
  4 -0020 0254
  对不同浓度水平的 NAA与6BA组合时 I1值
的比较,见表4。旨在找到一组最适合福建金线莲
茎尖生长的浓度水平组合。表4中,A2,B2组合时
I1值最大,表明此时NAA的促生长效应最明显。
表4 NAA与6BA不同浓度水平组合的配对比较
(A×B)
A B 均数 标准误
1 1 3000 0291
  2 2890 0291
  3 1667 0291
  4 2557 0291
2 1 3223 0291
  2 4220 0291
  3 3085 0252
  4 3000 0291
3 1 3640 0291
  2 2500 0291
  3 1777 0291
  4 2500 0291
4 1 3480 0252
  2 3720 0291
  3 2777 0291
  4 2958 0252
5 1 3333 0291
  2 3220 0291
  3 3583 0291
  4 2835 0252
表3和表4的结果最终表明,最适合福建金线
莲茎尖生长的为 MS+NAA05mg·L-1+6BA1
mg·L-1。
2.3.2 NAA与6BA不同浓度水平组合对福建金
线莲茎段平均侧枝数的影响 不同浓度水平6BA
间I5值的配对比较,见表5。结果发现,B2,B3,B4
的I5值大于 B1组;B1与 B3,B4间有显著性差异
(P<005),B2与 B1,B3,B4间无显著性差异,B3,
B4无显著性差异。可见,B3,B4效果较好,B2效果
一般,而B1效果较差。
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表5 B因素配对比较
(I)B (J)B 均数差(IJ) 标准误
1 2 -0249 0125
  3 -02491) 0122
  4 -03171) 0125
2 1 0249 0125
  3 0000 0120
  4 -0068 0123
3 1 02491) 0122
  2 0000 0120
  4 -0069 0120
4 1 03171) 0125
  2 0068 0123
  3 0069 0120
  对NAA与6BA不同浓度水平组合时 I5值的
比较,见表6。结果显示,A3与B2,B3,B4三者组合
时I5值较大,说明这3个组合对福建金线莲茎尖与
茎段的分化均有较明显的促进作用。表6中,A3与
B3组合时I5值最大,表明此时6BA的促分化效应
最明显。
表6 NAA与6BA不同浓度水平组合的配对比较
(A×B)
A B 均数 标准误
1 1 1000 0201
  2 1000 0201
  3 0613 0201
  4 1165 0174
2 1 0670 0201
  2 1000 0201
  3 0613 0201
  4 0917 0201
3 1 0917 0201
  2 1557 0201
  3 1583 0174
  4 1333 0201
4 1 -535×10-17 0201
  2 0583 0174
  3 0933 0174
  4 1000 0201
5 1 0333 0201
  2 0110 0201
  3 0313 0174
  4 -371×10-15 0201
  表5和表6结果表明,最适合福建金线莲茎尖
与茎段的芽分化及侧枝形成的是MS+NAA1mg·
L-1+6BA2mg·L-1。
3 讨论
本实验结果表明,在01~4mg·L-1,NAA对福
建金线莲茎尖的生长均有不同程度的促进。NAA在
01~05mg·L-1时,促生长作用随着质量浓度的增
高而加大;在05~1mg·L-1时,促生长作用则随着
质量浓度的增高而受到抑制;在1~4mg·L-1时,促
生长作用又会随着质量浓度的增高而加大。可见
NAA在低质量浓度(<1mg·L-1)及高质量(>1mg
·L-1)时对福建金线莲所表现出来的激素效应是不
同的,这在金线莲以往的研究中未曾报道过。当6
BA达到4mg·L-1时其促分化的效果依然显著,说
明福建金线莲对6BA具有较高的耐受力,这与文献
[3]报道的相同。6BA在05~4mg·L-1时,其促分
化作用随着质量浓度的增高而加大。此外,NAA05
mg·L-1与6BA2mg·L-1组合时对福建金线莲茎
尖的促生长作用最显著;NAA1mg·L-1与6BA2
mg·L-1组合时对福建金线莲茎尖与茎段的芽分化
及侧枝形成的促进效果最显著。由此可见,NAA与
6BA的激素效应间存在着明显的交互作用,会因为
主效应的不同而表现出较大的差异。
今后,在用MS培养基对福建金线莲进行组织
培养时,应根据茎尖与茎段部位的不同而选择不同
浓度水平的NAA与6BA组合,如此才能达到最佳
的培养效果。
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ApplicationofSPSSorthogonaldesignintissuecultureof
Anoectochilusroxburghi
ZHANGFusheng,GUOShunxing
(InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalColege,
Beijing100193,China)
[Abstract] Objective:TostudytheefectofthediferentconstitutionsofplanthormoneonthedevelopmentofAnoectochilus
roxburghi.Method:A.roxburghiwereharvestedafterhavingbeenculturedfor60days.Anorthogonaldesignwasusedtostudythe
efectofNAAand6BAontheleafnumber,eustipenumber,lateralbranchnumberofthestemtipandstemsection,andtheheightof
thestemtips.AlofthedatawereprocessedbySPSS.ResultandConclusion:ItisreportedforthefirsttimethatNAAcouldmake
diferentdevelopmentofA.roxburghiatlowconcentration(<1mg·L-1)andhighconcentration(>1mg·L-1).Theoptimum
constitutionofMSmediumwasNAA0.5mg·L-1+6BA1mg·L-1forthegrowthofthestemtipofA.roxburghi,andNAA1mg
·L-1+6BA2mg·L-1forthediferentiationofbudandtheformationoflateralbranchofthestemsection.Thediferentconcentra
tionsofNAAand6BAhaddiferentefectsonthegrowthanddiferentiationofthestemtipandthestemsectionofA.roxburghi.
[Keywords] SPSS;Anoectochilusroxburghi;tissueculture;orthogonaldesign;planthormone
[责任编辑 吕冬梅]
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第34卷第20期
2009年10月
                           
Vol.34,Issue 20
 October,2009