全 文 ：2016 年 7 月 第 18 卷 第 7 期 中国现代中药 Mod Chin Med Jul. 2016 Vol. 18 No. 7
·基础研究·
△ ［基金项目］ 湖北省教育厅 2010 年度高校产学研合作资助项目(C2010042)
* ［通信作者］ 吴和珍，教授，博士生导师，研究方向:中药品种、质量及其资源开发研究;E-mail:hezh_ wu@ 163. com
花粉形态数量化分析在忍冬属花类药材的
鉴别及分类中的应用
△
李群1，吴和珍1，2* ，田代志2，胡志刚1，3
(1. 湖北中医药大学 药学院，湖北 武汉 430065;
2. 湖北中医药大学 中药资源与中药复方省部共建教育部重点实验室，湖北 武汉 430065;
3. 中国中医科学院 中药研究所，北京 100700)
［摘要］ 目的:对忍冬属不同产地 12 个样本的花粉形态进行系统观察，以期在表观性状比较的基础上，为忍
冬属花类药材的鉴别及分类提供依据。方法:利用扫描电镜(SEM)观察花粉形态、表面纹理，测量花粉表面刺突的
大小和密度;利用光学显微镜测量花粉的大小，获得花粉形态特征数据，并用 SPSS20. 0 软件进行分析。结果:忍
冬属同种不同产地的花粉形态数量化特征大体相近，但种间的花粉特征均有一定差异。结论:将花粉形态数量化并
结合统计学分析可为忍冬属花类药材的鉴别和分类提供参考依据。
［关键词］ 忍冬属;花粉形态数量化;SPSS 20. 0 软件;扫描电镜;光学显微镜
Application of Numerical Taxonomy of Pollen Morphology in Pharmacognostic
Identification and Classification of Lonicera L.
LI Qun1，WU Hezhen1，2* ，TIAN Daizhi2，HU Zhigang1，3
(1. College of Pharmacy，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，China;
2. Key Laboratory of Ministry of education of Ｒesources of traditional Chinese medicine and Chinese herbal compound，
Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，China;
3. Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China)
［Abstract］ Objective:To make systemic morphological observation for 12 pollen samples of Lonicera L. from different
habitats and provide a reference for pharmacognostic identification and classification based on the character
comparisons. Methods:The scanning electron microscope (SEM)was applied to observe the morphological characteristics and
gauge the size and density of external spine while the pollen size was measured by means of optical microscope，and the data
were analyzed by SPSS 20. 0 software. Ｒesults:Numerical features of pollens of same species from different habitats were
broadly similar in contrast with interspecific differences. Conclusion:Application of Numerical Taxonomy of Pollen Morphology
combined with statistical analysis can provide a basis for pharmacognostic identification and classification of Lonicera.
［Keywords］ Lonicera L.; numerical taxonomy of pollen morphology; SPSS20. 0 software; scanning electron
microscope(SEM) ;optical microscope
doi:10． 13313 / j． issn． 1673-4890． 2016． 7． 012
金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬 Lonicera
japonica Thunb. 的干燥花蕾或带初开的花［1］，为临
床常用中药。市场上金银花的伪品较多，绝大部分
为山银花或同属其他植物的花蕾。传统鉴别方法主
要依靠形态分类学和解剖学特征进行药材的真伪鉴
别，然而对于忍冬属同属多种花类药材，其表面特
征极其相似，且同种药材因产地不同也会发生变异，
使该方法的应用存在局限性。
花粉在遗传学上具有较强的保守性和稳定性，
不同植物的花粉形态独特、表面纹理细微特殊，常
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被用作植物分类和药材鉴别的重要依据。尤其随着
扫描电镜的出现和推广，借助花粉形态研究植物分
类和药材鉴别的报道日益增多。张元明［2］利用花粉
形态结合统计分析研究中国柽柳科 4 属 27 种植物，
验证传统分类的可靠性;早期朱雅东等［3］用光学显
微和扫描电镜对忍冬属 19 种药用金银花的花粉形态
进行研究。但迄今为止，未见采用花粉形态数量化-
聚类分析方法鉴别忍冬属的花类药材并为分类提供
依据的报道。
本文以忍冬属 12 个样本为代表，运用扫描电
镜、光学显微镜对其花粉形态特征进行观察比较，
并进行统计学分析，探讨数量化-聚类分析模式在忍
冬属花类药材的鉴别及分类中的应用。
1 仪器与材料
1. 1 仪器
Model UB100i Series生物显微镜(重庆澳浦光电
技术 有 限 公 司) ，JEOL JFC-1600 AUTO FINE
COATEＲ 离子溅镀机(日本电子株式会社) ，JEOL
JSM-6510LV扫描电子显微镜(日本电子株式会社)。
1. 2 材料
12 个样本由中国医学科学院药用植物研究所提
供，由研究所陈士林团队做过 DNA Barcoding 鉴别研
究［4］，见表 1。
表 1 忍冬属 12 个样本材料来源
编号 样本 种名 药材名 采集地
1 JYH57 忍冬 L. japonica 金银花 江苏东海
2 JYH62 忍冬 L. japonica 金银花 山东平邑
3 JYH63 忍冬 L. japonica 金银花 山东平邑
4 HZM06 灰毡毛忍冬 L. macranthoides 山银花 贵州六盘水
5 HZM30 灰毡毛忍冬 L. macranthoides 山银花 贵州安顺
6 HZM31 灰毡毛忍冬 L. macranthoides 山银花 贵州安顺
7 HN02 华南忍冬 L. confusa 山银花 广西桂林
8 HHM02 黄褐毛忍冬 L. fulvotomentosa 山银花 贵州六枝特区
9 HHM04 黄褐毛忍冬 L. fulvotomentosa 山银花 贵州六枝特区
10 XZM07 细毡毛忍冬 L. similis 重庆开县
11 XZM11 细毡毛忍冬 L. similis 重庆城口县
12 XZM15 细毡毛忍冬 L. similis 四川南江
2 方法
2. 1 光学显微法测定花粉大小
每个样本取 2 ～ 3 个花药在载玻片上用镊子轻轻
碾碎，水合氯醛透化装片，Model UB100i Series生物
显微镜下观察。随机各选取 30 粒花粉，显微测微尺
测量其极轴长(P)和赤道宽(E)。P × E 表征花粉大
小，P /E表征花粉形状。
2. 2 扫描电镜法观察花粉表面特征
将用于扫描电镜观察的花蕾置于干燥器中干燥，
轻轻将干燥花粉均匀涂于粘有双面胶带的铝金属样
品台上，用 JEOL JFC-1600 AUTO FINE COATEＲ 喷
金后，在 JEOL JSM-6510LV 型扫描电子显微镜下观
察花粉的形状、萌发孔、表面纹理等特征，并摄像。
随机选取摄像清晰且是正面的 10 粒花粉，分别测花
粉边缘直立的刺突的长度(L)和正面刺突的基部直
径(Dia) ，每粒测 2 个数据;随机选取 20 粒花粉，
在放大 1500 倍情况下，每粒测荧屏上每(3 × 3)cm2
表面 ［即花粉粒表面中部每(15 × 15)μm2) ］所分
布的刺突数，衡量花粉表面刺突的密度(D)。
2. 3 数据分析
将极轴长(P)、赤道宽(E)、P /E、刺突的长
度(L)、刺突的基部直径(Dia)、刺突的密度(D)
作为观察指标进行统计学分析。但由于有的变量之
间存在相互关联，用 SPSS 20. 0 软件先对这些指标
进行主成分分析，组合出互不关联的综合指标，然
后对综合指标聚类分析，按计算结果画出聚类分
析图。
3 结果与分析
3. 1 扫描电镜观察结果
12 个样本的花粉形状很相似，近扁球形至近球
形;极面观均近似三角形，赤道面观椭圆或近圆形;
萌发孔 3 个，均为椭圆形;表面具刺状突起。但花
粉粒的大小(极轴长、赤道面宽) ，表面刺突的长
短、粗细、疏密都存在差异，观察结果见表 2。花
粉的极面、赤道面、表面刺突、萌发孔的电镜扫描
图见图 1。
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表 2 忍冬属 12 个样本的花粉形态特征数据表
编号 样本
花粉 刺突
P × E /μm2 64. 54(57. 50 ～ 75. 00) P /E L /μm Dia /μm D
1 JYH57 (54. 25 ～ 65. 50)60. 89 × 64. 54(57. 50 ～ 75. 00) 0. 94 (1. 00 ～ 1. 52)1. 18 (0. 50 ～ 1. 50)0. 91 (15 ～ 34)21. 3
2 JYH62 (51. 25 ～ 68. 75)58. 81 × 61. 48(52. 50 ～ 71. 25) 0. 96 (1. 00 ～ 1. 75)1. 34 (0. 55 ～ 1. 50)0. 93 (17 ～ 31)20. 3
3 JYH63 (55. 00 ～ 65. 00)59. 78 × 63. 90(57. 50 ～ 69. 25) 0. 94 (1. 00 ～ 1. 75)1. 37 (0. 50 ～ 1. 30)0. 93 (11 ～ 24)18. 2
4 HZM06 (58. 50 ～ 75. 00)65. 40 × 70. 17(65. 00 ～ 81. 25) 0. 93 (1. 05 ～ 2. 19)1. 53 (0. 50 ～ 1. 43)0. 94 (12 ～ 21)17. 5
5 HZM30 (55. 00 ～ 69. 00)61. 63 × 68. 13(60. 00 ～ 77. 50) 0. 90 (1. 00 ～ 1. 59)1. 32 (0. 50 ～ 1. 55)0. 94 (14 ～ 26)18. 3
6 HZM31 (52. 50 ～ 69. 25)60. 75 × 67. 12(61. 25 ～ 77. 50) 0. 91 (0. 92 ～ 1. 75)1. 36 (0. 50 ～ 1. 40)0. 97 (17 ～ 26)21. 8
7 HN 02 (62. 50 ～ 87. 50)76. 63 × 78. 37(67. 50 ～ 85. 00) 0. 98 (1. 00 ～ 2. 29)1. 40 (0. 75 ～ 1. 50)1. 05 (10. 5 ～ 20)14. 2
8 HHM02 (50. 00 ～ 60. 00)56. 34 × 59. 94(52. 50 ～ 65. 00) 0. 94 (0. 75 ～ 1. 75)1. 26 (0. 50 ～ 1. 25)0. 91 (18 ～ 27)22. 4
9 HHM04 (47. 50 ～ 60. 00)55. 72 × 60. 31(55. 00 ～ 65. 00) 0. 92 (0. 95 ～ 1. 67)1. 27 (0. 55 ～ 1. 37)0. 97 (17 ～ 27)22. 0
10 XZM07 (62. 50 ～ 78. 75)69. 39 × 77. 50(63. 75 ～ 83. 75) 0. 90 (0. 90 ～ 1. 47)1. 27 (0. 50 ～ 1. 30)0. 97 (13 ～ 22)17. 6
11 XZM11 (50. 00 ～ 65. 00)56. 82 × 63. 88(60. 00 ～ 70. 00) 0. 89 (0. 95 ～ 1. 67)1. 29 (0. 55 ～ 1. 64)0. 95 (17. 5 ～ 28)23. 1
12 XZM15 (63. 00 ～ 85. 50)74. 49 × 80. 98(68. 75 ～ 92. 50) 0. 92 (0. 81 ～ 1. 74)1. 29 (0. 50 ～ 1. 50)1. 00 (12 ～ 19. 5)15. 5
图 1 忍冬属 12 个样本的花粉电镜扫描图
3. 2 数据分析
3. 2. 1 数据标准化处理和主成分分析 主成分分析
是一种降维或者将多个指标转化为几个综合指标的
多元数理统计方法［5-6］。实验选择的指标之间往往
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互有影响，需要将这些指标进行主成分分析，选出
几个互不关联的综合性指标来反映原来的指标的信
息;由于各指标具有不同的量纲，因此在主成分分
析前先将数据标准化，使数据具有可比性。表 2 中
的数据标准化后如表 3 所示，主成分分析内容见表
4 ～ 6。
表 3 忍冬属 12 个样本 6 个花粉形态特征指标数据标准化结果
编号 ZP ZE ZP /E ZL ZDia ZD
1 － 0. 309 1 － 0. 478 5 0. 474 8 － 1. 631 8 － 1. 149 4 0. 676 7
2 － 0. 606 2 － 0. 898 4 1. 234 4 0. 189 8 － 0. 647 8 0. 329 7
3 － 0. 467 6 － 0. 566 3 0. 474 8 0. 531 3 － 0. 647 8 － 0. 399 1
4 0. 335 1 0. 294 1 0. 095 0 2. 352 9 － 0. 397 1 － 0. 642 0
5 － 0. 203 4 0. 014 2 － 1. 044 5 － 0. 038 0 － 0. 397 1 － 0. 364 4
6 － 0. 329 1 － 0. 124 4 － 0. 664 7 0. 417 4 0. 355 3 0. 850 2
7 1. 939 0 1. 419 4 1. 994 1 0. 872 8 2. 361 5 － 1. 787 1
8 － 0. 959 0 － 1. 109 7 0. 474 8 － 0. 721 0 － 1. 149 4 1. 058 4
9 － 1. 047 5 － 1. 058 9 － 0. 284 9 － 0. 607 2 0. 355 3 0. 919 6
10 0. 904 9 1. 300 0 － 1. 044 5 － 0. 607 1 0. 355 3 － 0. 607 3
11 － 0. 890 4 － 0. 569 0 － 1. 424 3 － 0. 379 5 － 0. 146 3 1. 301 3
12 1. 633 4 1. 777 6 － 0. 284 9 － 0. 379 5 1. 107 6 － 1. 336 0
表 4 6 个主成分的特征值以及贡献率
主成分 特征值 贡献率(%) 累计贡献率(%)
1 3. 651 60. 86 60. 86
2 1. 123 18. 71 79. 57
3 0. 769 12. 82 92. 39
4 0. 381 6. 36 98. 75
5 0. 074 1. 23 99. 98
6 0. 001 0. 02 100
由表 4 可知前 3 个主成分的累积贡献率达到
92. 394%，能充分反映原始数据的信息，故选取前 3
个主成分分析。
表 5 主成分载荷矩阵
指标
主成分
1 2 3
ZP 0. 972 － 0. 136 0. 108
ZE 0. 919 － 0. 354 － 0. 029
ZP /E 0. 320 0. 789 0. 523
ZL 0. 438 0. 570 － 0. 691
ZDia 0. 827 － 0. 154 0. 082
ZD － 0. 940 － 0. 088 0. 012
表 6 主成分得分
编号
主成分
1 2 3
1 － 1. 51 － 0. 21 1. 45
2 － 0. 93 1. 47 0. 48
3 － 0. 39 1. 02 － 0. 24
4 1. 01 1. 31 － 1. 81
5 － 0. 27 － 0. 69 － 0. 66
6 － 0. 51 － 0. 31 － 0. 72
7 4. 10 1. 04 0. 89
8 － 2. 13 0. 54 0. 68
9 － 1. 53 － 0. 18 0. 26
10 1. 22 － 1. 66 － 0. 05
11 － 1. 76 － 1. 05 － 0. 64
12 2. 69 － 1. 27 0. 36
3. 2. 2 聚类分析 采用表 6 中主成分得分代替原始指
标对样本进行聚类分析，从而达到降维和综合指标
的作用。聚类分析结果见图 2。
从图 2 看出，在聚类重新标定距离(rescaled
distance cluster combine，ＲDCC)约为 3 时，样本 5、
6 聚成一类 A，样本 2、3 聚为一类 B，样本 8、9 聚
为一类 C，样本 10、12 聚为一类 D，样本 7 自成一
类 E，大致与 DNA Barcoding 结果相符，但仍存在个
别差异。如:在 DNA Barcoding 鉴定中被归于 B 类
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图 2 12 个样本聚类分析结果
的样本 1 在 ＲDCC 为 3 以下时归为 C 类，但其花粉
粒大小却与归于 C 类的样本 8、9 相差悬殊，在
ＲDCC约为 5 时 B类、C类又可聚为同一类，可能揭
示原植物种间遗传距离相近;按 DNA鉴定结果，样
本 4 与样本 5、6 同种，样本 11 与样本 10、12 同
种，与此处聚类分析结果不符，但观察花的外观形
态可知，样本 4 和样本 11 与各自同种的其他样本的
花在外观上就明显不同，聚类结果支持了外观上的
差异，结合各自的产区，揭示种内花粉的这种形态
上的差异可能与不同生态环境下的变异或营养状况
有关。
基于外观上的比较分析，花粉特征聚类分析结
果总体上支持形态学和遗传学分类的结果，可用于
忍冬属花类药材的鉴别及分类。
4 讨论
我国忍冬属植物资源非常丰富，野生和栽培品
种繁多［7］。在长期演化过程中，植物器官的形态很
多产生了变异，使植物的鉴别、分类产生困难。但
花粉在长期进化过程中基因相对保守，受环境影响
较小［8］，形态特征较稳定，因此可为植物的起源、
演化、分类和鉴定提供依据［9-10］。
本文研究结果表明，不同产地的忍冬属花粉形
态特征很相近，体现忍冬属植物的共同特征;但不
同种或同种不同产地的植株的花粉大小、表面刺突
长短、疏密等存在一定差异，将这些差异特征数量
化分类，分类结果与形态学、遗传学分类结果大体
一致，一定程度上既反映了种内花粉的共性，又可
体现种间的差异性，对于鉴别不同种药材具有重要
的价值。对于不断进化、不断变异的忍冬属植物来
说，数量化分类的方法虽然未能完全地确定其分类
学地位，但该种分类方法必将在今后自然科学分类
和药材的鉴定中得到完善和发展。
《中华人民共和国药典》(《中国药典》)2005 版
将金银花和山银花分成 2 种药材收载，金银花仅来
源于忍冬科植物忍冬一个品种，山银花来源于灰毡
毛忍冬、红腺忍冬、华南忍冬［11］， 《中国药典》
2010 版山银花品种又新收载黄褐毛忍冬［1］28，而且
还有增加趋势。本研究中，样本 1 与样本 2、3，样
本 4 与样本 5、6 分别被遗传学鉴定为同一个种，但
由于产区不同，同种的花粉形态地域差异性明显，
引发了一个关于地区药材分类的思考:能否依据这
种地域性差异将某物种从传统分类中划分出来，归
入他类或自成一类;《中国药典》上收载的金银花、
山银花的来源是否要有地区上的限定;样本 11 所代
表的一类细毡毛忍冬的花能否被新收入作山银花的
品种，这类问题都有待进一步研究。
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(收稿日期 2015-11-03)
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