全 文 ：近红外光谱法测定连翘中连翘酯苷含量
王星，白雁，陈志红，龚海燕，张威
（河南中医学院，河南 郑州 ４５０００８）
［摘要］ 目的：利用近红外光谱法快速测定连翘药材中连翘酯苷含量。方法：利用 ＨＰＬＣ测定样品中连翘酯苷的含量，
运用偏最小二乘（ＰＬＳ）法建立其含量与ＮＩＲ光谱之间的多元校正模型，对未知样品进行含量预测。结果：建立的定量模型准
确性好，内部交叉验证均方差（ＲＭＳＥＣＶ）、内部交叉验证决定系数分别为０２２１，０９６９。经外部验证，ＮＩＲ预测值与 ＨＰＬＣ测
定值之间的相关系数为０９６１，预测均方差（ＲＭＳＥＰ）为０１８。结论：近红外光谱法对连翘中连翘酯苷含量预测结果较好，能
满足制药中检测的精度要求，为中药生产过程的在线、无损定量分析提供了依据。
［关键词］ 近红外光谱法；连翘；连翘酯苷
［收稿日期］ ２００９０１２５
［基金项目］ 河南省重大公益科研项目（０８１１００９１２５００）；河南省杰
出人才计划（０８４２００５１００１７）
［通信作者］ 白雁，Ｔｅｌ：（０３７１）６５９６２９６７，Ｅｍａｉｌ：ｗｈｉｔｅ＿ｙａｎ＠ｈｏｔ
ｍａｉｌ．ｃｏｍ
［作者简介］ 王星，助教。Ｅｍａｉｌ：ｋｉｎｇｓｔａｒ１０１６＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
连翘为木犀科植物连翘 Ｆｏｒｓｙｔｈｉａｓｕｓｐｅｎｓａ
（Ｔｈｕｎｂ．）Ｖａｈｌ的干燥果实，具有清热解毒，消肿散
结等功效［１］，是常用的一味中药。现代药理学研究
表明，连翘中含有的主成分连翘酯苷（ｆｏｒｓｙｔｈｏｓｉｄｅ
Ａ）具有极强的抗菌［２］及抗病毒［３］活性，为其特征性
有效成分之一。目前关于连翘中连翘酯苷的含量测
定方法有薄层扫描法［４］、高效液相色谱法［５］，但这
些方法分析耗时长，在制药过程中难以满足原药材
的快速测定以及在线检测的要求。
近红外 （ｎｅａｒｉｎｆｒａｒｅｄ，ＮＩＲ）光谱分析技术因
分析速度快、对样品无损害、无化学污染等显著优
点，近年来被广泛用于中药分类、活性成分测定
等［６８］。本研究采用近红外漫反射光谱技术，建立
了连翘中连翘酯苷的定量分析模型，对其进行了快
速分析，并就其在制药过程控制中的应用进行了探
讨。
１ 仪器与试药
美国ＴｈｅｒｍｏＮｉｃｏｌｅｔ公司生产的Ｎｉｃｏｌｅｔ６７００型
傅立叶变换近红外光谱仪，配有积分球、样品旋转
台、样品杯、ＯＭＮＩＣ光谱采集软件和 ＴＱ７２分析软
件；美国 Ｄｉｏｎｅｘ公司生产的 ＤＩＯＮＥＸＰ６８０型高效
液相色谱仪；上海天平仪器厂生产的 ＦＡ２００４Ａ型
１／１万天平，瑞士 ＭＥＴＴＬＥＲ公司生产的 ＡＥ２４０型
１／１０万天平。连翘酯苷对照品（安徽芜湖甙尔塔医
药科技有限公司提供，纯度＞９８％）；样品为２００６年
８月至２００８年８月期间采购于河南、山西、陕西、河
北、湖北、山东等野生的青翘与老翘药材共８５份，见
表１，由河南中医学院中药鉴定教研室主任陈随清
教授做生药学鉴定；甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸为分
析纯，水为双蒸水。
２ 方法
２．１ 连翘中连翘酯苷的ＨＰＬＣ分析［９］
２．１．１ 供试品的制备 取连翘药材粉末０１ｇ于
２５ｍＬ量瓶中，加入体积分数５０％甲醇溶液２０ｍＬ，
超声１ｈ后定容，摇匀，过滤，取滤液进样。
２．１．２ 色谱条件 ＤｉｋｍａＤｉａｍｏｎｓｉｌＣ１８分析柱（４６
ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；流动相为乙腈水磷酸
（１７∶８３∶０２）；检测波长 ３３２ｎｍ；流速 １ｍＬ·
ｍｉｎ－１；柱温３０℃；进样量１０μＬ，理论塔板数以
连翘酯苷计不低于３０００，连翘酯苷色谱峰与相邻
色谱峰的分离度不小于１５，连翘酯苷纯品及连翘
样品色谱图见图１。
２．１．３ 线性关系的考察 精密称取连翘酯苷对照
品１９１４ｍｇ置５０ｍＬ量瓶中，甲醇定容，得０３８２８
ｇ·Ｌ－１的连翘酯苷对照品溶液，并依次稀释成
０１９１４，００９５７，００６３８，００４７９，００３８３ｇ·Ｌ－１
的溶液，各进样１０μＬ，以实际进样量（μｇ）为横坐
标，色谱峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方
程为Ｙ＝２１２２５Ｘ－３０３０５，ｒ＝０９９９９。线性范围
０３８３～１９１４μｇ。
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表１ 连翘产地及品种
Ｎｏ． 产地 品种 Ｎｏ． 产地 品种 Ｎｏ． 产地 品种
１ 河南新安 青翘 ３０ 河南内乡 青翘 ５９ 陕西镇安 青翘
２ 河南渑池 青翘 ３１ 河南内乡 青翘 ６０ 陕西商洛 老翘
３ 河南渑池 青翘 ３２ 河南卢氏 青翘 ６１ 陕西黄龙 老翘
４ 河南陕县 老翘 ３３ 山西运城 老翘 ６２ 陕西洛南 老翘
５ 河南灵宝 青翘 ３４ 山西运城 青翘 ６３ 山西平陆 老翘
６ 河南卢氏 青翘 ３５ 湖北郧县 老翘 ６４ 山西闻喜 青翘
７ 河南卢氏 青翘 ３６ 湖北郧县 青翘 ６５ 山西闻喜 老翘
８ 河南洛宁 青翘 ３７ 湖北郧县 老翘 ６６ 山西闻喜 老翘
９ 河南卢氏 青翘 ３８ 湖北郧县 青翘 ６７ 山西闻喜 青翘
１０ 河南陕县 青翘 ３９ 湖北郧县 青翘 ６８ 山西闻喜 老翘
１１ 河南栾川 青翘 ４０ 陕西商南 青翘 ６９ 山西垣曲 老翘
１２ 河南栾川 青翘 ４１ 陕西商南 青翘 ７０ 山西绛县 青翘
１３ 河南栾川 老翘 ４２ 陕西商南 青翘 ７１ 山西绛县 老翘
１４ 河南栾川 青翘 ４３ 陕西商南 老翘 ７２ 山西沁水 老翘
１５ 河南栾川 老翘 ４４ 陕西丹凤 青翘 ７３ 山西陵川 老翘
１６ 河南栾川 青翘 ４５ 陕西丹凤 青翘 ７４ 山西壶关 青翘
１７ 河南栾川 老翘 ４６ 陕西丹凤 青翘 ７５ 山西壶关 青翘
１８ 河南嵩县 青翘 ４７ 陕西洛南 青翘 ７６ 山西壶关 老翘
１９ 河南嵩县 青翘 ４８ 陕西洛南 老翘 ７７ 山西平顺 老翘
２０ 河南嵩县 老翘 ４９ 陕西商州 青翘 ７８ 山西平顺 老翘
２１ 河南嵩县 青翘 ５０ 陕西山阳 老翘 ７９ 河北井陉 老翘
２２ 河南嵩县 青翘 ５１ 陕西安康 青翘 ８０ 河北井陉 青翘
２３ 河南栾川 青翘 ５２ 陕西黄龙 老翘 ８１ 河北井陉 老翘
２４ 河南栾川 青翘 ５３ 陕西铜川 青翘 ８２ 山东泰安 青翘
２５ 河南栾川 老翘 ５４ 陕西大理 老翘 ８３ 河南陕县 青翘
２６ 河南西峡 青翘 ５５ 陕西洛南 青翘 ８４ 河南陕县 青翘
２７ 河南西峡 青翘 ５６ 陕西洛川 老翘 ８５ 河南陕县 青翘
２８ 河南内乡 青翘 ５７ 山西运城 老翘
２９ 河南内乡 青翘 ５８ 陕西黄龙 老翘
Ａ．对照品；Ｂ．样品；１．连翘酯苷。
图１ 连翘药材ＨＰＬＣ图
２．１．４ 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液１０
μＬ，连续进样５次，测定峰面积，其ＲＳＤ０９４％。
２．１．５ 重复性试验 分别称取同一批样品５份，每
份０１ｇ，按照２．１．１项下制备方法分别制备供试品
溶液，分别精密吸取以上供试品溶液１０μＬ进样，测
定连翘酯苷含量，并计算连翘酯苷含量的 ＲＳＤ
０９５％。
２．１．６ 稳定性试验 精密吸取２．１．１项下制备好
的供试品溶液１０μＬ，分别在０，２，４，６，８，１２ｈ进样，
结果连翘酯苷峰面积的 ＲＳＤ０８７％。说明供试品
溶液中连翘酯苷在１２ｈ内稳定性良好。
２．１．７ 加样回收率试验 取已知含量的样品６份，
精密称定，分别加入一定含量的连翘酯苷，按以上方
法进行提取和测定连翘酯苷的含量，计算加样回收
率，结果见表 ２，连翘酯苷平均回收率为 ９８２％，
ＲＳＤ１６％。
２．１．８ 样品测定 分别精密称取样品０１ｇ，按照
２．１．１项下方法制备成供试品溶液，精密吸取供试
品溶液１０μＬ进样，测定各样品中连翘酯苷的含量，
结果见表３。
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表２ 连翘酯苷加样回收率
称样量
／ｇ
样品中量
／ｍｇ
加入量
／ｍｇ
测得量
／ｍｇ
回收率
／％
平均值
／％
ＲＳＤ
／％
００５３８ ０４７３ ０３８５ ０８５１ ９８２
００５２０ ０４５８ ０３８５ ０８３８ ９８７
００５２６ ０４６３ ０３８５ ０８４６ ９９５
９８２ １６
００５４１ ０４７６ ０３８５ ０８４５ ９５８
００５３２ ０４６８ ０３８５ ０８４２ ９７１
００５２７ ０４６４ ０３８５ ０８４８ ９９７
表３ 样品中连翘酯苷质量分数 ％
Ｎｏ．质量分数 Ｎｏ．质量分数 Ｎｏ．质量分数 Ｎｏ．质量分数
１ ２２６ ２３ １６２ ４５ ２８８ ６７ １５３
２ ２３０ ２４ ２５０ ４６ １８０ ６８ ０８８
３ ０８９ ２５ ０８８ ４７ ２１３ ６９ １４９
４ １９１ ２６ ２８４ ４８ ０７０ ７０ ３７９
５ ２０５ ２７ ２８４ ４９ １２９ ７１ １２３
６ ２４７ ２８ ３００ ５０ ０６８ ７２ １２３
７ １９５ ２９ １３５ ５１ １８９ ７３ １０２
８ ２１８ ３０ ２９８ ５２ １５２ ７４ １９５
９ ２００ ３１ ２１６ ５３ １２５ ７５ ３１８
１０ １９６ ３２ ３２５ ５４ ０７６ ７６ ０９９
１１ ２１５ ３３ ０７９ ５５ １７４ ７７ １１５
１２ ２２８ ３４ ３９６ ５６ １０５ ７８ １２２
１３ １３２ ３５ ０６７ ５７ １５９ ７９ １７５
１４ １７２ ３６ １８２ ５８ ０５５ ８０ ２８７
１５ １５４ ３７ １０８ ５９ １２６ ８１ ０９０
１６ ３５２ ３８ １６７ ６０ ０９３ ８２ １４７
１７ ０８８ ３９ １１５ ６１ ０６９ ８３ ３５５
１８ １８６ ４０ ２２７ ６２ ０７２ ８４ ３６５
１９ ３４４ ４１ １９８ ６３ ０８２ ８５ ３２６
２０ ０９０ ４２ １８７ ６４ ３１７
２１ ２９８ ４３ １３８ ６５ １７１
２２ ３６０ ４４ ３２３ ６６ １３７
２．２ 近红外光谱法分析
２．２．１ ＮＩＲ光谱的采集 将收集到的８５份样品晒
干后粉碎，过２４目筛，取约５ｇ粉末放人石英样品
杯中，混合均匀，以空气为参比，按下述实验条件进
行扫描：测样方式为积分球漫反射，分辨率为 ８
ｃｍ－１，光谱采集范围４０００～１２０００ｃｍ－１，扫描次数
３２次，温度（２０±０３）℃，相对湿度３５％。８５份连
翘样品的近红外光谱叠加见图２。
２．２．２ 校正集和验证集样品的选择 从收集到的
８５份样品中，根据其连翘酯苷的 ＨＰＬＣ分析结果，
选取６８个有代表性的样品组成校正集（也称训练
集），用于建立校正模型；剩余１７个样品为验证集，
对模型进行外部验证。校正集和验证集样品连翘酯
图２ ８５份连翘样品的ＮＩＲ光谱叠图
苷分布范围见表４。
表４ 校正集与验证集样品中连翘酯苷分布范围表 ％
项目 样品数 最小值 最大值 平均值 标准偏差
校正集组成 ６８ ０５５％ ３９６％ １８７％ ０９０％
验证集组成 １７ ０６８％ ３６０％ １８２％ ０８９％
２．２．３ 校正模型的建立 运用ＴＱ７２定量分析软
件中偏最小二乘法（ＰＬＳ）建立校正模型，并用验证
集样品进行外部验证。
３ 结果与讨论
３．１ 光谱预处理
在建立模型前，首先对样品的原始吸收光谱进
行预处理，以消除噪音和基线漂移等对定标结果的
影响。使用不同方法处理后模型的 Ｒ２和 ＲＭＳＥＣＶ
的比较，Ｒ２为校正集内部交叉验证决定系数，其值越
接近１说明模型预测越准确；ＲＭＳＥＣＶ为校正集内
部交叉验证均方差，其值越小说明模型的预测精度
越高，见表 ５。经比较，以一阶导数法处理效果最
好，该法可以很好地消除样品由于颜色差别引起的
光谱基线偏移和漂移［１０］，强化谱带特征。
表５ ＰＬＳ建模预处理对ＲＭＳＥＣＶ和Ｒ２的影响
光谱预处理方法 Ｒ２ ＲＭＳＥＣＶ
ＭＳＣ ０９０９ ０３７２
ＳＮＶ ０８４６ ０４７６
ＦｉｒｓｔＤｅｒｉｖａｔｉｖｅ ０９６９ ０２２１
ＳｅｃｏｎｄＤｅｒｉｖａｔｉｖｅ ０９３８ ０３０９
ＭＳＣ＋ＦｉｒｓｔＤｅｒｉｖａｔｉｖｅ ０９６４ ０２３７
ＳＮＶ＋ＦｉｒｓｔＤｅｒｉｖａｔｉｖｅ ０９６５ ０２３４
３．２ 校正模型的建立
运用ＰＬＳ法将６８份校正集样品的 ＮＩＲ图谱与
其ＨＰＬＣ测定值进行关联，建立校正模型，图３为６８
份校正集样品交互验证得到的ＮＩＲ预测值与 ＨＰＬＣ
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测定值的相关图，可以看出，校正集样品均匀地分布
在回归线的两侧。经内部交叉验证得 ＲＭＳＥＣＶ＝
０２２１，Ｒ２＝０９６９。图４为校正集ＲＭＳＥＣＶ与Ｒａｎｋ
（主成分数）之间的相关图。其中，前９个主成分能
够代表原始光谱９８％以上的信息，且使ＲＭＳＥＣＶ最
小，因此确定最佳主成分数为９。
图３ 校正集ＮＩＲ预测值与ＨＰＬＣ测定值之间的相关图
图４ 校正集ＲＭＳＥＣＶ与Ｒａｎｋ之间的相关图
３．３ 模型的验证
将１７份验证集样品的 ＮＩＲ图谱输入校正模
型，预测其连翘酯苷的含量，并与其ＨＰＬＣ测定值进
行比较，计算得模型预测均方差（ＲＭＳＥＰ）为０１８。
经统计学检验，ＮＩＲ预测值与 ＨＰＬＣ测定值的
相关系数为０９６１。成对ｔ检验结果显示，ｔ＝２１２，
Ｐ＞００５，即２种方法的分析结果差异无统计学意
义，该模型通过验证，可以准确预测其覆盖范围的连
翘药材连翘酯苷含量。
３．４ 精密度考察
取同一份样品粉末５ｇ，重复５次扫描其ＮＩＲ图
谱，输入ＮＩＲ分析模型计算其含量，其ＲＳＤ１４％。
３．５ 重复性考察
分别取同一样品５份，各５ｇ，分别扫描其 ＮＩＲ
图谱，输入 ＮＩＲ分析模型计算其含量，计算结果
ＲＳＤ为１６％。
４ 结论
建立一个优秀的 ＮＩＲ定量分析模型，收集足够
多有代表性的样品是非常关键的，因此，本实验所选
用的８５份连翘药材来自全国各地的不同产区，连翘
酯苷含量范围为 ０５５％ ～３９６％，且分布均匀，具
有一定的代表性。
由于ＮＩＲ分析技术是一个二级分析方法，其预
测准确度取决于建立模型时所用测定组分方法的准
确度，因此，本研究对ＨＰＬＣ进行了详细的方法学考
察，并对每份样品重复测定 ２次，相对偏差小于
１５％，以２次含量测定结果平均值做为样品中连翘
酯苷的含量，确保所建ＮＩＲ分析模型的准确度。
为确保模型的可用性，本研究选用的外部验证
样品数为１７个，这些样品的连翘酯苷含量覆盖了校
正集样品范围的９５％以上，其平均值与标准偏差均
与校正集相近，且分布均匀，具有一定的代表性，并
对分析结果进行统计学检验，结果令人满意。
样品粒度的差异会影响入射光与样品相互作用
的环境，影响漫反射的光谱特性［１１］，因此本实验所
用的校正集与验证集样品均在同一条件干燥，并过
２４目筛。每份样品平行扫描３次，取平均光谱，以
尽量减少上述因素引起的误差。
本研究利用 ＮＩＲ分析方法测定连翘药材中连
翘酯苷含量，计算结果准确，符合生产中检测的精度
要求，且与ＨＰＬＣ相比，该法具有快速、无损、不消耗
试剂、原位分析等特点，适用于大批量连翘药材中连
翘酯苷的快速测定，在制药过程质量控制中具有潜
在的应用前景。
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０２２１ａｎｄｔｈｅｃｏｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔｓｏｆｔｈｅｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎｍｏｄｅｌｗａｓ０９６９．Ｅｘｔｅｒｎａｌｖａｌｉｄａｔｉｏｎｗｉｔｈｅｘｔｅｒｎａｌｖａｌｉｄａｔｉｏｎｓａｍｐｌｅｓｐｒｏｖｅｄ
ｔｈａｔｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔｏｆｔｈｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄｖａｌｕｅａｎｄｔｈｅＨＰＬＣｖａｌｕｅｗａｓ０９６１ａｎｄｔｈｅＲＭＳＥＰｗａｓ０１８．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＮＩＲＳｃａｎｂｅ
ｕｓｅｄｉｎｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｆｏｒｓｙｔｈｏｓｉｄｅＡ，ｗｈｉｃｈｓｅｔｓｕｐｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｄｕｃｔｌｉｎｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆｆｒｕｃｔｕｓｆｏｒｓｙｔｈｉａｅ．
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