全 文 ：外翻肠囊法快速发现吴茱萸汤吸收成分群的研究
龚慕辛!*! 王雅?! 宋亚芳*! 王智民*!! 张启伟*! 王维皓*! 朱晶晶*
,首都医科大学 中医药学院!北京 $$$#7% *,中国中医科学院 中药研究所!北京$$ %$$#
$摘要%!目的&建立快速发现吴茱萸汤主要吸收成分的外翻肠囊模型法$为选择吴茱萸汤质量控制指标提供参考) 方
法&采用大鼠外翻肠囊模型$收集 ) 种浓度的吴茱萸汤给药后不同时间的肠囊液样品$用YE`<检测样品中的吴茱萸碱!Md.QN4
B/N1M$Ud&吴茱萸次碱!CT@BM-BCAN1M$>T&吴茱萸内酯!SN/.1N1$ N`&人参皂苷 >
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$vc4 & ND4C?B/1.ONQM$:CO,&姜辣素!#4DN1DMC.S$#4FN$计
算累计吸收量$同时比较吴茱萸汤样品与吸收成分间比例) 结果&除 >T 未检出外$其余 % 种成分均可进入肠囊$但高浓度汤 中Ud在空肠和回肠段中未检出$中浓度仅在空肠的 $/N1后检出$而低浓度则在 #$/N1后的时间点均检出) 不同浓度吴茱 萸汤吸收趋于稳定后的成分间比例与原汤中各成分间比例不同) 结论&肠囊对药物成分吸收有选择性$空肠与回肠相比可更
多&更快地给出吸收成分信息$选择外翻肠囊法 7$ k$/N1的样品检测吴茱萸汤吸收成分比较适宜)$关键词%!吴茱萸汤*外翻肠囊模型*YE`<*吸收成分检测
$稿件编号%!*$$7*%$$%$基金项目%!国家/十一五0支撑计划项目!* $$#G3:$(G$)**$$ %
年中医药行业科技专项项目!* $$%$%$$ %$*$$%$% $$7 $通信作者%!!!王智民$RMS=HB6#!$$ (&$&*($U4/BNS# W?/+*)
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!!长期以来$如何科学地选择中药复方质量控制 指标一直是困扰质量工作者的一个难题) 近年基于 /复方成分群 % 吸收成分群r药效成分群0的假说$
许多学者将注意力集中到中药血清药物化学研究$从血清中分离&鉴定中药口服后的移行成分$研究其
与传统疗效的相关性$揭示中药物质基础和作用形 式$进而选择质控指标) 但这种方法存在如下困难#
中药口服吸收量小$易受到体内各种物质的干扰而 难以检出*药物复杂的体内过程使检测出的成分包 括原形成分&代谢产物和生理活性物质$后 * 类成分
的可靠指认需要对照品$难以获得$需要精密大型仪
器$测试费用高) 因此$笔者尝试采用外翻肠囊法进
行吴茱萸汤吸收的研究$并将其与体内实验进行比 较$以图建立一种快速&简便的复方吸收成分群发现
和确认的方法$为中药复方质量控制选取指标提供 参考 !材料 U!仪器 Y884G数字式超级恒温水浴锅!成都市生科仪 器有限责任公司*自制麦氏浴槽*混合气瓶!7j L *$j*
*GE_I型电子分析天平!8BC@.CNTO公
司*XB@MCO*#74*77# 高效液相色谱系统$U/A.+MC 工作站$含四元梯度泵&自动进样器!XB@MCO公司*
E>U88L>UIF38 G`LX:;F3RL>氮吹
仪$;34 氮`气4空气一体机!北京中兴汇利科技发 展有限公司*8L>[3``-M1@CNPTDMO8R4* 高速冷冻 离心机!美国 8.CdBS公司*J^ 4$$U型超声波清洗 器!昆山市超声仪器有限公司 U!动物 XNO@BC大鼠$雄性$体重!*7$ p*$D$由北京维
通利华实验动物有限公司提供) 合格证号 8!京4 $$4$$ $#$以标准颗粒饲料饲养)
U&!药品与试剂
氯化钾&氯化钠&碳酸氢钠&磷酸二氢钠&葡萄
糖&氯化镁&氯化钙均购自北京化学试剂公司$为分 析纯) 乙腈!色谱纯$HNO?MC公司&甲醇!色谱纯$RMQNB公司&蒸馏水!本所自制&纯净水!杭州娃哈 哈集团有限公司) Ud!批号$($*4*$ $$$>T !批号 $($4*$$ $&$ N`!批号 $($$4*$$&$&$> !批号$%$&4*$$)($ >D

!批号 $%$)4
* $$)**$>M!批号 $%&4*$$ *%$均购自中国药 品生物制品检定所*异鼠李素4)4<4芸香糖苷!:CO$纯
度

7(j&姜辣素!#4FN$纯度 7(j自制) U_!吴茱萸汤样品的制备 吴茱萸购自湖南九汇现代中药有限公司$批号
为广西 $$($)$鉴定为 F8#,%. 06!.*.0$. !VTOO, .77). 第 ) 卷第 期 *$$ 年 # 月
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[.Sg)$:OOTM! VT1M$ * $$GM1@?,的果实$样品保存在本实验室$编号为 X_a4 $%$7*人参购自吉林集安$大枣购自河南新郑$样品 保存在本实验室$编号分别为 >84$($)$I_4$%$7*生 姜购自北京) 以上饮片经北京中医药大学张贵君教 授鉴定$符合中国药典(!*$$ 年各药项下规定)
按照人一日口服处方剂量取 $倍量的饮片$浸泡
)$/N1$煎煮 * 次$每次加水$ 倍量$合并水煎液$
加 7j乙醇至含醇量 %$j$$k& h静置 *& ?) 抽 滤$#$h以下减压回收乙醇$干燥$测定了样品中 ( 种代表性成分的含量) U$!台氏液的配制
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$g* D溶于$$/` 蒸馏水中密闭冷藏*临 用前在不断搅拌下将后者与前者均匀混合$加入葡
萄糖 g$D即得) !方法与结果 U!色谱方法 UU!色谱条件 JC./BONS4< ( 柱 !&g# //m*$
//$/$甲醇4乙腈4水梯度洗脱!$k*$ /N1$i #i()**$ k* /N1$i#i() ki7i($** k) /N1$i7i($ k&i*i%*) k& /N1$&i*i% k&i)*i #&*) k& /N1$&i*i% k&i)*i#&*& k /N1$&i )*i#&) 柱温 )$ h$检测波长 *$) 1/$流速 /`. /N1 e ) UU!专属性试验!比较空白台氏液&混合对照品 溶液&吴茱萸汤台氏液&吴茱萸汤各缺味阴性台氏液 的色谱行为$在建立的色谱条件下$( 种对照品峰形 良好$各峰均完全分离$结果见图 k)) 空白台氏 液&各阴性对照液和吴茱萸汤中其他成分对其无干 扰$说明方法专属性较好)
UU&!标准曲线的制备!取各对照品$用甲醇配制 成不同浓度的混合对照品溶液$取 $$混`合对照 品溶液$加入$$

台`氏液$振荡混合后$用氮气吹
干$加$$`甲醇$超声 )$/N1$) $$$ C./N1e离 心 /N1$移取上清液$用 $g** /针头滤器滤过$ 进样 $ )` 各对照品质量浓度为 :CO!7$&g$$
)$g$$g$$)g$ $$g($ /D.` e $>D !)($7)$ #*g$)%g$ *g$$ *g$/D.` e$>M! )($7)$
#*g$)%g$*g $$*g$ /D.` e $> !7)$$ *))$%$(g$*7g$$&g /D.` e$ N`!%% $$7)$7#g)$ &(g$*&g$*g$ /D.` e $#4FN!)(7$7%g)$&(g#$ !! ,:CO**,>D *),>M*&,>\*,`N*#g#4FN*%,Ud*(,>T!图 *$) 同) 图 !吴茱萸汤样品中 ( 种成分检测专属性YE`<图 B, /N1*\,)$ /N1*-g& /N1*Qg#$ /N1*M,7$ /N1* P,*$ /N1*D,$ /N1*?,($ /N1!图 ) 同) 图 *!高浓度吴茱萸汤样品在空肠的经时吸收YE`<图 图 )!高浓度吴茱萸汤提取物在回肠的经时吸收YE`<图 *&g)$*g*$)g$ /D.` e $Ud!)&*$7g*$&g#$ **g($g&$ g%$ /D.` e $>T ! &#$ *))$ #$ (g$*7g$&g /D.` e ) 记录色谱图和峰面积$ .$$ &.
第 ) 卷第 期
* $$年 # 月 !!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! ! [.Sg)$ :OOTM! VT1M$ *$$
以峰面积!4对质量!

D$进行线性回归$计算标
准曲线回归方程和相关系数) 结果为 Ud9f
%g##) m$( Jlg$& m$&$0f$g777 7$线性范围
$g$% $k)g&* D*>T 9f#g%* m$
7
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0f$g777 ($线性范围 $g& k&g# D* N`9f 7g%7 m$
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$&$0f$g777 7$线性范围 $g$* $k)g( D*>M 9fg&(# m$
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围 $g$* $k)g( D*> 9f*g7 m$
(
Je
g$#( m$
&
$0f$g777 #$线性范围$g& k7g)$D) UU_!准确度试验!分别取高&中&低不同浓度的 混合对照品溶液$各浓度每批测定 个样品$每个样 品测定 次$代入随行标准曲线计算浓度$按公式 >Uf! B e 4 e m$$j!4为理论值$B
e
为 次测定
平均值$计算相对误差) 结果均小于 7j$符合生
物样品分析要求)
UU$!精密度试验!按 UU& 项下方法$分别取
高&中&低不同浓度的混合对照品溶液$在 Q 内测 定 次$计算日内精密度) 每一浓度连续测定 Q$计算日间精密度) 结果均小于或等于 )g$j$符合 生物样品分析要求) UU)!稳定性试验!按 UU& 项下方法$分别取
高&中&低不同浓度的混合对照品溶液$置于棕色安 捷伦液相小瓶中的聚丙烯内插管中$在室温存放 ($#$*& ?$在e*$ h存放 %* ?后进行测定$平行操作 ) 次$进行测定$计算平均值$与零时测定值进行比
较) 试验结果显示混合对照品溶液在室温存放 ($#$*& ?$不同时间 ) 次平均值与零时测定值相差在 j以内) 在 e*$ h存放 %* ? 之内稳定性较好$) 次平均值与新制样品测定值相差在 j以内$符合
生物样品分析要求)
UU%!萃取回收率试验!按照 UU& 项下制备标
准曲线用的高&中&低 ) 个浓度对照品的制备方法$每一浓度制备 个样品$每个样品测定 次) 将 )
个浓度对应的未经处理的对照品甲醇溶液直接测
定$计算萃取回收率 Gf 4 : 4 5 m$$j!4 : 为处理过的 样品峰面积均值$4
:
为未处理过的相应浓度样品峰
面积均值 ) 结果在 %&gj k7&g&j$>8I在 g&j k&g%j$符合生物样品分析要求)
U!大鼠外翻肠囊模型实验方法
UU!模型的制作与取样!将实验前禁食 * ? 的
大鼠称重后$断颈椎处死$沿腹中线和腹白线分别剪
开皮肤与肌肉) 考察的肠段区间均为 $-/$自胃
幽门以下 $-/开始向下量取$ -/为空肠段$从 回盲瓣以上 -/开始向上取$ -/为回肠段) 将
剪下的肠管放入 $h台氏液中冲洗$至无肠内容物
为止) 将自制硅胶套管软端插入肠管用丝线结扎$小心将肠道翻转) 用$ h台氏液冲洗内表面$将另 一端用丝线结扎成囊状) 将肠管放入盛有$ /` )%
h恒温台氏液的麦氏浴管中$开始供混合气体) 在 肠管中注入 *g k)g$ /` 台氏液平衡 /N1$然后将 台氏液换成不同浓度!代表大&中&小 ) 个给药剂 量的含药台氏液$分别在 $)$$&$# $$7$$ *($/N1取样 *$`同时补充等体积的 )% h
台氏液) 样品放入干净的 UE管中$e*$ h直立保
存待用) 实验结束后将肠管纵向剖开$自然摊于滤 纸上测量长度和宽度$记录吸收面积4)
UU!供试品溶液的制备 临用前用台氏液将吴
茱萸汤样品溶化制成 ) 个浓度的混悬液 $$/` 混 悬液中含生药量分别为 7g($&g7$*g& D) 将上述时 间点样品用氮气吹干$加$$

甲`醇$超声 )$ /N1$离心 )$ $$C./N1e$ /N1$移取上清液$氮气吹干$ 加$$

甲`醇$超声 /N1$用 $g** /针头滤器滤 过$进样 *$分`析$代入标准曲线计算浓度)
UU&!统计方法 药物累计吸收量按 Tf$g* m ) m H平衡 H样 l$g*
&
)e
!f

%
计算 ) T为药物各时间的累积
吸收量$) 为各时间点取样的实际检测浓度$H平衡为
平衡前肠管中加入的台氏液体积$H样为每次取样的 体积) U&!外翻肠囊实验 U&U!不同浓度吴茱萸汤样品中 % 种成分在空肠 和回肠段转运情况!样品中各成分在大鼠空肠&回 肠段由黏膜侧向浆膜侧转运结果发现#:CO$>D

$>M$
>
$N`$#4FN# 种成分在不同浓度均可进入肠囊$且 浓度在检测的线性范围内*Ud高浓度时在空肠和回 肠段中未检出$中浓度仅在空肠的 $/N1 后检出$
而低浓度却在 #$/N1 后的时间点均检出*>T 因各 .$&.
第 ) 卷第 期
* $$年 # 月 !!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! ! [.Sg)$ :OOTM! VT1M$ *$$
浓度中的浓度太低$不在检测的线性范围内) 除中 浓度组 >M外$其他各成分在各浓度吸收入空肠的
时间均早于或等于回肠)
U&U!不同浓度吴茱萸汤样品中 % 种成分在空肠
和回肠累积吸收量比较!比较不同浓度下不同肠段
各成分的累积吸收量) 发现高浓度时$:CO$>M在回
肠段累积吸收量高于空肠$而 > 在空肠累积吸收 量高于回肠!>o$g$) 中浓度时$>M在回肠累积
吸收量高于空肠$而 >D$>
则相反!>o$g$)
低浓度时$>M$ N`$#4FN$Ud在回肠的累积吸收量高于
空肠$而:CO$>D

$> 在空肠的累积吸收量高于回肠 !>o$g $$见表 ) 表 !不同浓度吴茱萸汤样品中 % 种成分在不同肠段累积吸收量! # ?p&$)f) 化合物 高 中 低 空肠 回肠 空肠 回肠 空肠 回肠 :CO ((g$ p&g)$ )g# p#g)* ))g p)g( )(g( pg7$ g) p*g) $g& p$g( >D &#g* p7g( *g& p7g& &$g(% pg# g# p*g$$ *%g7
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p$g) #4FN *g) p*g&( &)g$
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pg&7

Ud e e &g* p)g* e g& p$g(# *(g) pg( !!注#空肠与回肠相比$>o$g$)
U&U&!不同浓度吴茱萸汤样品中 % 种成分在空肠
和回肠的累积吸收比例!高浓度时$空肠中各个成 分累积进入量比例在 7$ /N1 后趋于稳定$回肠则在$ /N1后趋于稳定*中浓度时$空肠中各个成分累 积进入量比例在 7$ /N1 后趋于稳定$回肠则在 *$
/N1后趋于稳定*低浓度时$空肠中各个成分累积进 入量比例在 7$ /N1 后趋于稳定$回肠则在$ /N1
后趋于稳定)
各浓度吸收趋于稳定后的成分间比例与相应浓
度吴茱萸汤中各成分间的比例不同) 高浓度空肠段
差异显著的是 >
$Ud$>T$回肠段是 :CO$>M$>$
Ud$>T*中浓度空肠段差异显著的是 >D$>M$>$
Ud$>T$回肠段是 >D

$>M$>
$Ud$>T*低浓度空肠
段和回肠段差异最显著的是 :CO$>D$>M$>$Ud$>T$而 N`与 #4FN则各浓度吸收比例与样品中比例
相比均未见显著差异)
&!小结与讨论
&U!建立YE`<4][同时测定吴茱萸汤样品中 ( 种
成分含量
该方法选用乙腈4水4甲醇 ) 种流动相$并控制 柱温$未加酸碱和缓冲盐得到良好的分离度$通过 ) /N1后加大甲醇用量$改善峰形) 为照顾不同类
成分的检测$选择了 *$) 1/作为检测波长$考虑到 >T在此波长响应值小$含量很少时不易检测出峰$故采用 )I检测方式) &U!建立肠囊吸收液样品处理方法 本实验初期将 e*$ h保存的各时间点样品取
出$室温融化后离心$直接过滤进样$发现 #4FN很难 检测出$其他成分含量也较低$给定量带来困难$并
且样品容易污染色谱柱) 经摸索$采用氮气吹干样 品$甲醇进行样品浓缩$浓缩至$`过滤进样$较好解决了上述问题) &U&!不同药味阴性样品与吴茱萸汤样品比较 在人参阴性样品中发现 Ud$>T 的含量比其他
样品降低很多$推测人参中皂苷类成分具有降低表 面张力的作用$对成分的溶出有促进作用$前人研 究+,发现$配伍人参可增强君药吴茱萸的镇痛作
用$同时又提高吴茱萸毒性$可能与促进这些成分的
溶出有关)
&U_!不同成分向肠囊转运规律分析
N`和 #4FN两者在不同浓度情况下均能很快进
入肠囊$显示优于其他成分的吸收特性) 在本实验 条件下$未能检测出>T 吸收进入肠囊$有关原因值 得探讨) 而Ud高浓度时在空肠和回肠中也未检测 到$中浓度时仅在空肠的 $/N1 后检测到$而低浓
度时在 #$/N1 后在空肠和回肠均检测到$说明 Ud
在高浓度吸收进入肠囊比较困难$是否因为肠黏膜 上存在介导药物外排的转运蛋白导致此结果$有待
.*$&. 第 ) 卷第 期 *$$年 # 月 !!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! ! [.Sg)$ :OOTM!
VT1M$*$$进一步探讨) &U$!不同肠段对药物吸收规律分析
除中浓度 >M外$其余成分进入空肠的时间要 等于或早于回肠$可能与空肠富血管$黏膜环状皱襞 多$利于药物吸收有关) 但当实验进行到 ) ? 时$除 了高低浓度的> 和低浓度的 :CO$>D

外$不同浓度 回肠中各成分的累积吸收量均高于空肠$此现象与
通常情况下药物在空肠吸收好于回肠的理论不符)
推测原因$可能是随着离体时间延长$肠黏膜与肠壁
组织的结构发生改变$活性丧失$此时仅以肠壁组织
为吸收屏障$而空肠组织坚韧$肠壁比回肠厚$因此 进入回肠的成分量大) 提醒实验中应注意检测肠段 的功能$尽可能保持其活性$实验时间不宜过长) &U)!复方中药物外翻肠囊吸收比例与原比例关系 各浓度样品吸收趋于稳定后的成分间比例与相 应浓度吴茱萸汤中各成分间比例不同$说明肠囊对
药物成分吸收有选择性$不是简单的/半透膜0被动 吸收过程) &U%!检测吸收成分的时间点 从各成分在肠囊液中被检出时间看$多数成分
在空肠出现时间早于回肠$空肠与回肠相比可更多& 更快地给出吸收成分信息) 从吸收各成分比例达到 稳定看$空肠段各浓度在 7$/N1 达到稳态$回肠段
则多在 $/N1 达到稳态$综合考虑$选择 7$ k$/N1做为检测点比较适宜) &U`!外翻肠囊模型在药物吸收研究中的应用与 改进 外翻肠囊模型由 XNSO.1 和 XNO/B1 于 7& 年 创建$几经改进而成) 该模型的优点是$操作简单& 快捷&成本低&重复性好+)4&, ) 不足之处在于肠管缺 乏血液循环和神经控制$体外时间过长后肠黏膜功
能形态容易发生变化) 在实验过程中需不断小量通
入 7jL
*
kj*
$以保持肠管在实验期间肠黏膜 的活性) 吴茱萸汤样品中 ( 个可检测的主要成分 :CO$
>D

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$N`$#4FN$Ud$>T$前 % 种成分可在肠囊 吸收液中检出$不同成分在相同部位吸收的时间&难
易的差异较大*同一成分在不同部位和在相同部位
不同浓度的吸收的时间&难易亦存在差异) 此外不
同浓度&不同肠段吸收成分间比例与原方也有很大
不同$说明外翻肠囊对中药复方成分的选择性吸收 能够给出比较重要的参考信息$为确定/哪些成分
可能吸收入血0提供借鉴)
&U#!体内外模型实验结果的比较
与吴茱萸汤给药后大鼠门静脉取血后血浆 <`4
98检测结果相比$首先就所考察的成分来讲$吸收
种类相同$均为 % 种*其次 N`$#4FN$>D 的吸收速度 在体内外实验中均较快) 但也存在一定差别#中浓 度下成分入血时间比进入空肠要早约 )$ /N1$分析 原因一是 <`498 检测灵敏度高于 YE`<$二是体内
方法肠道血液供应循环充足$有利于吸收*三是有些 成分体内外实验吸收快慢和难易存在差别$如 Ud
体外实验不易进入肠囊$体内则较容易吸收) 上述结果说明 * 种模型研究吴茱萸汤吸收成分 存在较好的对应关系$通过检测外翻肠囊实验中空
肠段 #$k7$ /N1 的样品可大体推测能吸收入血的
成分$达到采用体外的吸收模型代替整体动物的入 血成分试验目的$实现快速寻找中药或中药复方的
药效物质基础的目标)
$参考文献% +,!赵冬梅$肖隽$毕开顺$等,吴茱萸汤配伍机制的研究+V,,科技
前沿与学术评论$777$*!#&#,
+*,!董宇$张英丰$杨庆$等,制吴茱芙提取物在肠外翻中的吸收研 究及与E4DA 的关系+V,,世界科学技术%%%中医药现代化$
* $$($$ !*##),
+),!GBC@?M $` X..QSM5V$ Y.TN1 F,FBO@C.N1@MO@N1BSB\O.CA@N.1 .P
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